林安華 雷閩湘 謝曉云 徐寒松

摘要：目的 觀察糖尿病大鼠心肌病變與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1d)及其受體(CXCR-4)的關(guān)系。方法以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型。隨機(jī)分為1個(gè)月病程組(M1組)、3個(gè)月病程組(M3組)、5個(gè)月病程組(M5組)。心肌切片后行SDF-1α，CXCR-4及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)免疫組化，抗vWF抗體染色心肌微血管計(jì)數(shù)，半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測(cè)SDF-1α，CXCR-4及VEGFmRNA在大鼠心肌中的表達(dá)水平。結(jié)果 隨著病程的延長(zhǎng)，心肌組織中SDF-1α，CXCR-4袁達(dá)水平逐漸增高，與正常對(duì)照組相比，造模后1個(gè)月就有增高，5個(gè)月時(shí)增高最明顯，而心肌組織中VEGF表達(dá)無(wú)明顯改變：心肌微血管計(jì)數(shù)顯示造模后5個(gè)月心肌內(nèi)微血管數(shù)量明顯減少。結(jié)論 糖尿痛心肌病變時(shí)SDF-1α/CXCR-4在心肌中的表達(dá)水平隨糖尿病痛程延長(zhǎng)逐步增高，而VEGF表達(dá)無(wú)明顯改變，糖尿病心肌病變時(shí)微血管減少可能與VEGF表達(dá)不足有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病；心肌病變；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α；CXCR-4；大鼠

中圖分類號(hào)：R587.1 R255.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-1349(2007)07-0601-03

糖尿病心肌病變是由代謝紊亂觸發(fā)，致心肌細(xì)胞凋亡增加，纖維化，出現(xiàn)心律失常，進(jìn)行性心功能不全的一種糖尿病慢性并發(fā)癥，是糖尿病病人死亡主要原因之一，心肌內(nèi)微血管病變是其主要病理改變。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stuomal cell-derived factor-1α，SDF-1α)是趨化作用細(xì)胞因子(chemotaxis)CXC亞族的一員。研究表明，SDF-1α在細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與血管生成密切相關(guān)，通過(guò)與其特異性受體CXCR-4結(jié)合而發(fā)揮趨化作用，促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞逆SDF-1濃度梯度移行和增殖，誘導(dǎo)新生血管形成。在研究SDF-1α對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，SDF-1α能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，并能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，從而促進(jìn)血管發(fā)生，表明SDI、1α參與了微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管的過(guò)程。本研究通過(guò)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立糖尿病心肌病變動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組化和RT-PCR方法研究糖尿病心肌病變心肌SDF-1α，CXCR-4及VEGF的表達(dá)，探討糖尿病心肌病變可能的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料 雄性SD大鼠60只，體量200g±20g，由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物部提供；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，美國(guó)Sigma公司)；羅氏血糖儀及試紙；SDF-1α，CXCR-4，VEGF及抗vWF單抗(武漢博士德公司)；S-P試劑盒(北京中杉金橋公司)；Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)；Taq酶(大連Takara公司)；引物(上海生物工程公司合成)；PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra公司)；UVI.pro凝膠成像與分析系統(tǒng)(華粵公司)。

1．2 方法 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(NC組)和糖尿病(DM組)，每組又分3個(gè)亞組，即1個(gè)月組(M1組)、3個(gè)月組(MS組)、5個(gè)月組(M5組)各10只。禁食12h后，用新鮮配置0.1mmol/L.pH4.5的枸櫞酸鹽緩沖液稀釋STZ(10.g/L)，以60mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，正常組以等體積枸櫞酸鹽緩沖液一次性腹腔內(nèi)注射。1d及3d后尾靜脈采血測(cè)血糖≥16.7mmol/L確定模型并納入試驗(yàn)。每5d測(cè)大鼠體重、血糖1次，普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

分別于造模后1個(gè)月、3個(gè)月、5個(gè)月末稱體重、測(cè)空腹血糖后處死大鼠，取心臟組織應(yīng)用免疫組化S-P法檢測(cè)心肌組織SDF-1α，CXCR-4及VEGF的表達(dá)。

抗vWF抗體染色心肌微血管計(jì)數(shù)，第Ⅷ因子相關(guān)抗原在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，應(yīng)用免疫組化S-P法對(duì)各組大鼠心肌組織中第Ⅷ因子相關(guān)抗原進(jìn)行測(cè)定，參照Weidner法計(jì)數(shù)心肌微血管(MV)。

取心肌置于去PdNA酶的凍存管液氮中保用于Trizol提取心肌總RNA，測(cè)定純度及含量。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用成組設(shè)計(jì)資料兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 一般狀況觀察結(jié)果 DM大鼠均成模，無(wú)血糖返回正?，F(xiàn)象，食量、飲水量及尿量均顯著增加，同時(shí)體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，并出現(xiàn)皮毛枯黃、皮下膿腫等。NC組大鼠無(wú)死亡，DM組大鼠在M3組、M5組各死亡1只。

2．2 心肌微血管密度(MVD)計(jì)數(shù) 第Ⅷ因子相關(guān)抗原在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，陽(yáng)性點(diǎn)在光鏡下為單個(gè)或呈團(tuán)塊、柱狀或已分化成管腔狀的內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色至棕褐色，糖尿病大鼠心肌微血管數(shù)自造模后M1組開(kāi)始較NC組就有減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，M3組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．3 SDF-1α，CXCR-4及VEGF在心肌組織中免疫組化染色鏡下見(jiàn)SDF-1α，CKCR-4及VEGF在正常大鼠及糖尿病大鼠均有表達(dá)，表現(xiàn)為心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及(或)胞膜棕黃色顯色，同時(shí)心肌細(xì)胞染色也可見(jiàn)棕黃色顯色。在DM大鼠心肌中的表達(dá)較正常大鼠為明顯且其顯色強(qiáng)度隨DM病程延長(zhǎng)逐步增強(qiáng)。

2．4 SDF-1α.CXCR-4及VEGFmRNA的表達(dá)量 DM組大鼠心肌組織中SDF-1α，CXCR－4及VEGF mRNA的表達(dá)量與同齡NC組大鼠比較，1個(gè)月時(shí)mRNA表達(dá)就明顯升高，5個(gè)月時(shí)增高最明顯。

3 討論

SDF-1α是新近發(fā)現(xiàn)的具有趨化活性的細(xì)胞因子，廣泛表達(dá)于多種組織器官中。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它與血管新生有著密切關(guān)系，SDF-1α通過(guò)與其特異性受體CXCR-4結(jié)合，促進(jìn)CD34⁺造血干／祖細(xì)胞逆SDF-1α濃度梯度移行和增殖，抑制CD34⁺造血干／祖細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)新生血管形成。Tachibana等研究CXCR-4或SDF-1基因缺乏鼠胚胎期血管系統(tǒng)發(fā)生過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，與野生鼠比較，基因缺乏鼠在胚胎期第13.5天循環(huán)網(wǎng)就有區(qū)別，在野生鼠胚胎中可見(jiàn)腸系膜動(dòng)靜脈的大小分支，而在CXCR-4基因缺乏鼠胚胎中即使血管是正常的其大的分支也被丟失，在SDF-1缺乏鼠胚胎中存在類似表現(xiàn)；另見(jiàn)CXCR-4基因缺乏鼠死于宮內(nèi)并且在心血管發(fā)育中存在缺陷，因而認(rèn)為SDF-1/CXCR-4是器官及血管形成的重要信號(hào)系統(tǒng)。SDF-1α/CXCR-4軸在CD34⁺造血干/祖細(xì)胞的歸巢過(guò)程起著重要作用，并能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖。Mirshahi等研究SDF-1對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，SDF-1能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，并能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)血管發(fā)生，表明SDF-1參與了微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管的過(guò)程。VEGF是一類與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管新生密切相關(guān)的血小板源性蛋白，具有增加血管尤其是微血管滲透性的功能，同時(shí)還能選擇性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂進(jìn)而促進(jìn)血管新生。雖然正常組織也表達(dá)VEGF，但研究證實(shí)VEGF的高表達(dá)與病理性微血管異常增生關(guān)系密.切。Salcedo等研究發(fā)現(xiàn)VEGF能誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞CXCR-4表達(dá)增加。Hiada等報(bào)道SDF-1α基因轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細(xì)胞通過(guò)VEGF/eNOS途徑增加缺血誘導(dǎo)的血管形成和血管新生。阻斷SDF-1/CXCR-4軸能通過(guò)VEGF依賴性途徑抑制薪生血管形成從而延緩腫瘤的生長(zhǎng)。SDF-1α和VEGF以協(xié)同作用機(jī)制促進(jìn)卵巢癌血管新生，在用人卵巢癌細(xì)胞成瘤的小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高濃度的SDF-1α或VEGF均能誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)血管發(fā)生，病理性濃度的SDF-1α和VEGF協(xié)同作用誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)血管發(fā)生，缺氧同步刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生SDF-1α和VEGF，SDF-1α和VEGF協(xié)同增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、擴(kuò)增和存活。

糖尿病大鼠心肌微血管結(jié)構(gòu)扭曲變形、微血管數(shù)目減少且密度降低、血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目減少，STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變發(fā)生在糖尿病病程8周～12周，心功能改變發(fā)生在糖尿病病程6周～14周。本實(shí)驗(yàn)用STZ大鼠飼養(yǎng)到20周，在3個(gè)月時(shí)糖尿病大鼠心肌內(nèi)微血管數(shù)量就有明顯減少，5個(gè)月時(shí)減少更明顯，具有糖尿病心肌病的改變。本實(shí)驗(yàn)免疫組化檢測(cè)SDF-1α，CXCR-4及VEGF在正常大鼠及DM大鼠的心肌均有一定的表達(dá)，測(cè)灰度值比較顯示DM組大鼠在3個(gè)月、5個(gè)月時(shí)SDF-1α、CXCR-4表達(dá)均明顯增高，但VEGF表達(dá)無(wú)明顯改變；相對(duì)光密度結(jié)果顯示SDF-1α，CXCR-4及VEGFmRNA在NC大鼠及DM大鼠的心肌亦均有一定的表達(dá)，但DM大鼠心肌中SDF-1α，CXCR-4的表達(dá)較NC大鼠為高且其增高水平隨DM病程延長(zhǎng)逐步增加，在1個(gè)月時(shí)表達(dá)就明顯升高，5個(gè)月增高最為顯著，而VEGF表達(dá)在各病程組均較NC組無(wú)明顯差異。DM大鼠心肌病變時(shí)SDF-1α，CXCR-4表達(dá)增高，并隨病程延長(zhǎng)而呈繼續(xù)增高趨勢(shì)，但DM大鼠心肌VEGF表達(dá)增高不足，這可能是糖尿病心肌病變時(shí)微血管減少的重要原因。

(本文編輯 王雅潔)