李 青 鄒 坤 汪鋆植

摘要目的：探討開口箭提取物體外抗腫瘤作用。方法：采用四甲基偶氮唑鹽(MTF)比色法。結(jié)果：開口箭提取物、總皂苷、30％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分對人宮頸癌Hela細(xì)胞和人鼻咽癌CNE一1細(xì)胞的抑制作用明顯，與陰性對照組比差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)，對Hela細(xì)胞的IC₅₀分別為114.99μg/ml、72.25μg/ml、39.40μg/ml和45.82μg/ml，對CNE-1細(xì)胞的IC₅₀分別為106.82μg/ml、89.75μg/ml、60.72μg/ml和64.45μg/ml。結(jié)論：開口箭提取物體外有抗腫瘤作用。

關(guān)鍵詞 開口箭 皂苷 MTT法 抗腫瘤

開口箭(Tupistra chinensisBak.)為百合科(Liliaceae)鈴蘭族開口箭屬植物，為著名的傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、益氣活血、散瘀止痛等多種功效，主治勞熱咳嗽、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛等癥，民間用于治療咽喉炎、扁桃體炎等?，F(xiàn)證明開口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用。

本實驗室通過實驗證實湖北省產(chǎn)開口箭含有甾體皂苷和甾體皂苷元，且含量較高。皂苷具有增強(qiáng)免疫功能、抗輻射、抑制腫瘤生長、抗炎、降血糖等廣泛的生物學(xué)活性，近年越來越受人們的普遍關(guān)注。有研究證實開口箭同屬植物皂苷成分有細(xì)胞毒活性。本文旨在通過體外抗腫瘤實驗，觀察開口箭提取物對Hela和CNE-1細(xì)胞的增殖抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 實驗材料

1．1 細(xì)胞株

人宮頸癌細(xì)胞(Hela)和鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1)均由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室提供。

1．2 藥品與儀器

RPMI-1640為美國GIBCO公司產(chǎn)品；新生小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品；HEPES為美國Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為美國G1BCO公司產(chǎn)品；四氮唑藍(lán)(MTT)為美國AMRESCO公司產(chǎn)品；絲裂霉素(MMC)為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫檢測儀(GENIOSTECAN)；C02培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；LIM-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；96孔板(美國Coming公司)。

開口箭根莖于2002年7月采自湖北省神農(nóng)架林區(qū)，經(jīng)三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陳發(fā)菊副教授鑒定為Tupistra chinensisBak.，標(biāo)本存放于湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實驗室(編號：TC200207SNJ)。

1．3 藥物制備

開口箭根莖粉碎后，用甲醇回流提取3次，合并3次提取液，濃縮后經(jīng)石油醚脫脂用水飽和的正丁醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇，濃縮液抽干后即得到開口箭總皂苷，配成水液，過大孔樹脂柱，水洗，30％乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，得開口箭四部分皂苷。

分別取開口箭甲醇提取物、總皂苷、30％乙醇洗脫部分、70％乙醇洗脫部分4個樣品，用含10％滅活的新生小牛血清RP-MI-1640培養(yǎng)液將其配制成所需濃度，依次為62.5、125、250、500、1000、2000μg/ml。絲裂霉素(MMC)用含10％滅活的新生小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液將其配置為250μg/ml。所有受試樣品均用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

2 實驗方法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela和CNE-1細(xì)胞用RP-MI-1640培養(yǎng)液(另加10mM HEPES、2.0mg/mlNaHCO₃、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10％新生小牛血清)，于CO₂孵箱中37℃、5％CO₂飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞用含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化傳代。

2．2 MTY比色法

MTT比色法按Mosmann氏法略加改進(jìn)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單個細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.8×10⁵個／ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種180μl，轉(zhuǎn)板6h后加20μl受試藥，另設(shè)陰性對照組(不加藥)、空白調(diào)零組(只有培養(yǎng)基)和陽性對照組(MMC組)，每組均設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)48h后加MTT(5mg/ml)15μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去上清液，加DMSO 100μl，用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀于492nm波長處測定吸光度(OD)值，求出IC₅₀。抑制率(％)=[1-(實驗組OD均值-空白組OD均值)／(對照組OD均值-空白組OD均值)]×100％。

2．3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行。用Origin軟件，通過半對數(shù)抑合直線求IC₅₀值。

3 實驗結(jié)果

3．1 開口箭總提取物和總皂苷對Hela細(xì)胞的影響。

可知開口箭總提取物和總皂苷對Hela細(xì)胞的抑制作用顯著，與陰性對照組相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，且呈良好的量效關(guān)系，隨著藥物濃度的增加，抑制效果越明顯。

3．2 開口箭30％乙醇洗脫部分和開口箭70％乙醇洗脫部分對Hela細(xì)胞的影響。

由表2可知開口箭30％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分對Hela細(xì)胞的抑制作用顯著，與陰性對照組比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。30％乙醇洗脫部分最佳作用濃度為1001μg／ml，其抑制率達(dá)80.70％，70％乙醇洗脫部分最佳作用濃度為501μg／ml，其抑制率達(dá)73.00％。

3．3 開口箭總提取物和總皂苷對CNE－I細(xì)胞的影響。

由表可知開口箭總提取物和總皂苷對CNE-1細(xì)胞的抑制作用較明顯，與陰性對照組比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，且呈良好的量效關(guān)系，抑制效果隨藥物濃度的增大而增強(qiáng)。

3．4 開口箭30％乙醇洗脫部分和開口箭70％乙醇洗脫部分對CNE-l細(xì)胞的影響。

由表可知，開口箭30％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分對CNE-1細(xì)胞抑制作用顯著，與陰性對照組比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。其中30％乙醇洗脫部分對CNE-l細(xì)胞的增殖抑制與藥物濃度成正相關(guān)，70％乙醇洗脫部分在50μg/ml對CNE-1細(xì)胞的抑制效果最佳。

4 討論

以上結(jié)果表明，開口箭甲醇提取物、總皂苷、30％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分對Hela和CNE-1細(xì)胞株的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，且有統(tǒng)計學(xué)差異，其細(xì)胞毒作用呈現(xiàn)一定程度的劑量依賴性。其中開口箭總皂苷、30％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分對Hela細(xì)胞作用48h的IC₅₀值分別為72.25、39.40和45.82μg/ml，對CNE-1細(xì)胞作用48h的IC₅₀值分別為89.75、60.72和64.45μg/ml，亦符合IC₅₀<1001μg/ml認(rèn)為有用的要求。藥理實驗顯示開口箭毒副作用小，因此開發(fā)其細(xì)胞毒作用有潛在價值。

開口箭總皂苷上大孔樹脂柱所得95％開口箭皂苷部分量較少，目前正在研究之中。至于不同的開口箭部位細(xì)胞毒活性存在差異，應(yīng)與它們所含不同皂苷成分有關(guān)，還需要對其進(jìn)行深入研究。

從植物中尋找抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥物，在國內(nèi)外均為抗腫瘤藥物研究的重要組成部分。據(jù)文獻(xiàn)報道開口箭對HepG₂和S₁₈₀細(xì)胞株亦有明顯的抑制作用，本實驗室發(fā)現(xiàn)開口箭對HL-60和Caski細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，可見開口箭具有廣譜抗腫瘤作用，此外開口箭還有祛痰抗炎等作用。因此對開口箭的體外抗腫瘤作用及機(jī)制值得進(jìn)一步研究。