摘要目的：建立膚痔清軟膏微生物限度檢查方法。方法：以3株細(xì)菌、2株真菌對膚痔清軟膏進(jìn)行微生物限度檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：試驗(yàn)組枯草芽孢桿菌、白色念珠菌采用培養(yǎng)基稀釋法回收率為88％以上：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉采用常規(guī)法回收率為85％以上；控制菌檢查試驗(yàn)組采用100ml增菌培養(yǎng)基，可檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌；采用200ml皰肉培養(yǎng)基可檢出生孢梭菌。結(jié)論：經(jīng)驗(yàn)證膚痔清軟膏微生物限度檢查采用培養(yǎng)基稀釋法檢查梭菌、細(xì)菌、霉菌和酵母菌；常規(guī)法檢查金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

關(guān)鍵詞 茁藥膚痔清 微生物限度檢查方法

膚痔清軟膏是由黃柏、土大黃、金果欖等組成的復(fù)方制劑，苗醫(yī)：旭嘎凱沓痂，樣丟象泱安，滁內(nèi)擋祛卡。陡：嘎久杠工漿店羌，羅歐，崗俺，陰高坳。中醫(yī)：具有清熱解毒，化瘀消腫，除濕止癢功能，常用于濕熱蘊(yùn)結(jié)所致手足癬、體癬、痔瘡腫痛出血、帶下病等在微生物限度常規(guī)檢驗(yàn)中，微生物的檢出率都較低。為保證檢驗(yàn)方法的科學(xué)性、可行性及結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)用2005年版《中國藥典》規(guī)定的3株細(xì)菌、2株真菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌)對3批膚痔清軟膏進(jìn)行了微生物限度檢查法的驗(yàn)證試驗(yàn)研究，以確認(rèn)所采用的方法是否適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測定和控制菌檢驗(yàn)及檢查藥品本身污染微生物的狀況。

1 材料

1．1 儀器YJA-電動(dòng)勻漿儀(臺州市椒江五星試壓設(shè)備有限公司)，SE2020電子天平(梅特勒－托利多常州衡器有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SHEL·LAB)。

1．2 培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號031142)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號50121)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號040202)、BL培養(yǎng)基(批號050321)、pH7.0氯化鈉一蛋白胨緩沖液(批號060223)，北京三藥科技開發(fā)公司；氯化鈉(批號041011)，成都五環(huán)高欣化學(xué)試劑廠；皰肉牛肉粒(批號060314)，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1．3 供試品膚痔清軟膏(批號為20060302 2006040520060601)。

1．4 菌種大腸埃希菌[CM-cc(B)44102]、枯草芽孢桿菌[cMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 菌液制備將上述5株菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至規(guī)定培養(yǎng)基，細(xì)菌培養(yǎng)16h；酵母菌培養(yǎng)24h；霉菌培養(yǎng)5d，按《中國藥典》2005年版二部附錄方法制備菌(孢子)懸液，備用。

2．2 供試液制備按規(guī)定取供試品10g，按《中國藥典》2005年版一部附錄方法制成1:10供試液，備用。

2．3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2．3．1 試驗(yàn)組供試液1ml和50～100CFU試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，每株菌平行制備2個(gè)平皿。

2．3．2 菌液組測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2．3．3 供試品對照組取試驗(yàn)組供試液注皿量，測定供試品本底菌數(shù)。

2．3．4 回收率計(jì)算回收率％=[(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))÷菌液組平均菌落數(shù)]×100％

2．3．5 結(jié)果判斷 在3次平行試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的菌回收率均應(yīng)在70％以上；若低于70％，應(yīng)采用適宜的方法消除供試品的抑菌活性，重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

預(yù)試驗(yàn) 取供試液1，0.50，0.33，0.2ml分別注1皿為一組，每組加入1種試驗(yàn)菌菌液，共5組?？莶菅挎邨U菌1，0.50．0.33ml·皿^-1的回收率分別為45.8％，67.6％，84.5％，黑曲霉1，0.50ml·皿^-1的回收率分別為69，83.6％，白色念珠菌0.2·皿^-1的回收率為96.2％，其余2株菌1ml·皿^-1的回收率均達(dá)80％以上。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉分別采用培養(yǎng)基稀釋法0.2ml·皿^-1(1 ml分注5皿)、0.33ml·皿^-1(1 ml分注3皿)、0.5ml·皿^-1(1 ml分注2皿)其余2株菌采用常規(guī)法1ml·皿^-1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

結(jié)果見表(表試驗(yàn)組數(shù)據(jù)除白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉為10皿、6皿、4皿平均值外，其余2株菌及菌液組均為2皿平均值)。

2．4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2．4．1 試驗(yàn)組供試液10ml及10～100CFU銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、生孢梭菌加入相應(yīng)培養(yǎng)基中，按《中國藥典》2005年版一部附錄銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法檢查。

2．4．2 陰性菌對照組 方法同試驗(yàn)組，以大腸埃希菌作為陰性對照菌。

2．4．3 結(jié)果判斷陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌；試驗(yàn)組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，該試驗(yàn)方法成立。

試驗(yàn)結(jié)果見表。

2．4．4 采用經(jīng)驗(yàn)證的方法檢查3批膚痔清軟膏20060302、20060405、20060601細(xì)菌數(shù)分別為10，20，小于10個(gè)g^-1，霉菌及酵母菌數(shù)均小于10個(gè)g^-1，未檢出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌。3討論

(1)膚痔清軟膏對白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制生長速度作用，當(dāng)供試液為1，0.5，0.33．0.25ml·皿^-1時(shí)，加入的白色念球菌，培養(yǎng)72h菌落細(xì)小且與平皿內(nèi)沉淀物不能區(qū)別，培養(yǎng)時(shí)間延長至96h，該菌并不隨培養(yǎng)時(shí)間延長而菌落增大，需室溫放置24h后菌落方清晰可見。1，0.5，0.33，0.25ml·皿^-1白色念珠菌的回收率分別為12％，84％，84％，96.2％，雖然從0.5m/·皿^-1回收率即可達(dá)70％以上，但方法的可行性差，不宜用于該供試品的霉菌、酵母菌檢查。供試液量降低至0.2ml·皿^-1時(shí)，培養(yǎng)72h菌落清晰可辨，基本消除膚痔清軟膏對白色念珠菌的抑制生長速度作用。

(2)生孢梭菌菌種保存時(shí)間不宜過長，新開啟的生孢梭菌凍干菌種有利于梭菌檢查方法驗(yàn)證。本試驗(yàn)采用保存數(shù)月菌種的新鮮培養(yǎng)物，接種50～100CFU至試驗(yàn)組皰肉培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)渾濁、產(chǎn)氣、臭氣、消化碎肉現(xiàn)象明顯，顯微觀察典型次末端位芽孢生長良好，但將該培養(yǎng)物0.2ml接種至慶大霉素哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，按規(guī)定培養(yǎng)后，平皿表面無明顯菌落生長，將培養(yǎng)物接種量增至0.5ml仍無明顯菌落生長。采用慶大霉素哥倫比亞血瓊脂，平皿表面可見細(xì)小、霧狀菌落，革蘭染色可見典型芽孢菌，但該培養(yǎng)基中的血干擾過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)呈陽性反應(yīng)。采用新開啟的生孢梭菌凍干菌種重新進(jìn)行試驗(yàn)，皰肉培養(yǎng)物在慶大霉素哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)呈陰性反應(yīng)。

(3)經(jīng)驗(yàn)證：生產(chǎn)企業(yè)在原、輔料、生產(chǎn)和檢驗(yàn)等條件不變的情況下，膚痔清軟膏的微生物限度檢查可按以下方法進(jìn)行檢驗(yàn)。供試液1ml分注3皿，每皿0.33ml，測定細(xì)菌數(shù)；供試液1ml分注5皿，每皿0.2ml計(jì)霉菌及酵母菌數(shù)。分別取供試液10ml加入100mlBL培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、200ml皰肉培養(yǎng)基，按2005年版《中國藥典》微生物限度檢查法銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法檢查控制菌。