中圖分類(lèi)號(hào)：S646.15 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.13.036

自然界存在豐富的藥用真菌資源，我國(guó)早在東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》中就記錄了茯苓、紫芝、木耳、僵蠶等10余種藥用真菌及其功效I。隨著分子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和真菌種質(zhì)資源工作的深入，目前我國(guó)發(fā)現(xiàn)的藥用真菌已達(dá)到692種[2?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藥用真菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多糖、黑色素、萜類(lèi)化合物、多酚、黃酮類(lèi)等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖、抗炎等藥用功能[3-5]。隨著藥用真菌的藥效活性被不斷發(fā)現(xiàn)，藥用真菌廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品、動(dòng)物飼料、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

藥用真菌野生資源有限，傳統(tǒng)的人工栽培生產(chǎn)子實(shí)體對(duì)木材等基質(zhì)資源消耗量大，并且生長(zhǎng)過(guò)程易受氣候、病蟲(chóng)害等外在環(huán)境影響，面臨嚴(yán)重的品種退化問(wèn)題，制約產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，難以滿足市場(chǎng)需求。深層發(fā)酵技術(shù)具有生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量高、品質(zhì)穩(wěn)定、易操作、對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于靈芝、猴頭菇、豬苓、桑黃等多種藥用真菌生產(chǎn)，成為工業(yè)化獲取藥用真菌菌絲體及其有效成分的有力途徑[6-9]。

目前，藥用真菌發(fā)酵工業(yè)所用的菌株大多來(lái)源于栽培菌株，存在遺傳背景單一、產(chǎn)品同質(zhì)化程度高等問(wèn)題，導(dǎo)致工業(yè)化生產(chǎn)極不穩(wěn)定。因此，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的藥用真菌品種、開(kāi)發(fā)高價(jià)值產(chǎn)品是藥用真菌產(chǎn)業(yè)亟待解決的問(wèn)題。筆者將總結(jié)誘變育種、基因重組育種、基因工程育種等菌種選育技術(shù)在藥用真菌中的應(yīng)用，為藥用真菌發(fā)酵工業(yè)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1誘變育種

誘變育種是現(xiàn)階段最重要、運(yùn)用最廣泛的菌種選育方法。藥用真菌的誘變主要通過(guò)物理、化學(xué)等方式處理，具有突變頻率高、變異范圍廣等優(yōu)勢(shì)。誘變材料可采用藥用真菌的菌絲體、原生質(zhì)體、孢子懸浮液等。此外，不同誘變方式與輻射劑量處理獲得的目的菌株的誘變性能不同。

1.1物理誘變

1.1.1紫外線誘變技術(shù)

紫外線誘變是菌株改良的有效物理方法之一。Aina等分別以30、60、 90min 的時(shí)間間隔對(duì)野生型裂褶菌孢子進(jìn)行紫外線照射，繼代培養(yǎng)后經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵獲得菌絲體和胞外多糖（ExtracellularPolysaccharide，EPS）。結(jié)果表明，生物體暴露在紫外線下的時(shí)間越長(zhǎng)，菌絲體生物量和EPS產(chǎn)量就越高，照射 60min 的裂褶菌突變體具有最高的菌絲產(chǎn)量和EPS。此外，紫外線誘變能增強(qiáng)菌絲體提取物的活性[0]。Bamigboye等使用紫外線照射虎奶菇菌絲體獲得高產(chǎn)突變菌株，與野生虎奶菇相比，突變體經(jīng)搖瓶發(fā)酵獲得的胞內(nèi)多糖（IntracellularPolysaccharide，IPS）和EPS具有更高的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基清除活性[1]。

1.1.2電離輻射誘變技術(shù)

人們常用 γ 射線處理藥用真菌獲得生理活性物質(zhì)含量提升的突變株，如KIM等采用 γ 射線輻射處理杏鮑菇的原生質(zhì)體，獲得纖維素酶含量更高的突變菌株[12]。 γ 射線照射還能提高菌絲體對(duì)硒的富集能力，如楊夢(mèng)蓮利用 ⁶⁰Co-γ 射線誘變育種的方法篩選出耐高硒的靈芝突變體[13]。

1.1.3脈沖強(qiáng)光誘變技術(shù)

脈沖強(qiáng)光（IntensePulsedLight，IPL）是一種新興的非熱技術(shù)。有研究表明，經(jīng)IPL誘變篩選出的突變株發(fā)酵菌絲體中多糖、多酚、黃酮類(lèi)化合物和三萜類(lèi)化合物等產(chǎn)量均優(yōu)于親本菌株[4]。

1.1.4航天育種

航天育種具有突變率高、周期短、突變譜廣、安全性高等優(yōu)勢(shì)。Zhao等使用宇宙輻射誘變法成功分離出一種新的灰樹(shù)花突變體M270，用于高產(chǎn)EPS；對(duì)M270進(jìn)行20余代測(cè)定，考察突變體M270的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果顯示各代間產(chǎn)生的EPS差異不顯著，表明突變體M270的遺傳較穩(wěn)定[15]。

1.1.5常壓室溫等離子體誘變

常壓室溫等離子體（AtmosphericandRoomTemperaturePlasma，ARTP）誘變是一種新穎有效的物理誘變技術(shù)，目前已在藥用真菌誘變育種中廣泛應(yīng)用。例如，Gong等利用ARTP誘變技術(shù)獲得的猴頭菇突變菌株HEB和HEC的發(fā)酵菌絲體多糖含量較出發(fā)菌株分別提高 23.25% 和 47.45%^[16] 。此外，ARTP誘變技術(shù)可結(jié)合其他誘變技術(shù)獲得目標(biāo)突變株，解除單一誘變劑產(chǎn)生的誘變飽和效應(yīng)，提高育種效率。例如，李亞潔等結(jié)合 ⁶⁰Co-γ 射線與ARTP誘變技術(shù)選育出高產(chǎn)和性狀遺傳穩(wěn)定的蛹蟲(chóng)草突變菌株[17]。

1.2化學(xué)誘變

化學(xué)誘變是指借助化學(xué)誘變劑，如烷化劑、堿基類(lèi)似物、金屬鹽、移碼突變劑等，對(duì)菌種進(jìn)行誘變選育。KIM等用 0.2% 甲基磺酸甲酯（一種烷基化劑）處理繡球菌的均質(zhì)菌絲碎片，成功篩選出2種高產(chǎn)β-葡聚糖的突變菌株（B4和S7），證實(shí)了單一誘變劑對(duì)藥用真菌菌種選育的有效性[18]。此外，多種誘變劑的組合使用具有可行性。例如，化學(xué)誘變劑氯化鋰或氯化鋰與 TritonX^-100 的組合使用已被用于處理靈芝的原生質(zhì)體，以增強(qiáng)多糖和三萜類(lèi)化合物的產(chǎn)生[9]?；瘜W(xué)誘變劑吖啶橙（AcridineOrange，AO）還可與紫外線聯(lián)合處理香菇菌株以獲得具有更高EPS產(chǎn)量、強(qiáng)效抗菌和抗氧化活性的突變體[20]。但大部分化學(xué)誘變劑屬于高毒性或致癌物質(zhì)，使得化學(xué)誘變技術(shù)在藥用真菌中的應(yīng)用受限。

2 基因重組育種

2.1雜交育種

雜交育種主要適用于異宗配合的品種，具有一定的方向性，對(duì)于野生種質(zhì)資源的利用具有重要意義，已成為一種常用的技術(shù)手段。研究發(fā)現(xiàn)，將2種蛹蟲(chóng)草菌株ZGCM和CM17進(jìn)行雜交可以獲得高產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素和蟲(chóng)草素且穩(wěn)定遺傳的優(yōu)質(zhì)菌株，為蛹蟲(chóng)草相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了優(yōu)良的種質(zhì)資源[2I]。此外，李娜等利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)獲得雜交菌株GZ02，結(jié)果表明，與親本相比，雜交菌株發(fā)酵菌絲體的胞內(nèi)多糖含量和得率分別提高 5.47% 和 1.34%^[22] 。目前，大多文獻(xiàn)主要集中研究雜交育種對(duì)發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)速度、生物量及活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響，而較少探究親本與雜交菌株的發(fā)酵產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和生物活性之間的差異。段語(yǔ)嫣利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)獲得雜交菌株GZ36，探究其發(fā)酵菌絲體的胞外多糖含量、重均分子量分布特征、單糖組成特征和免疫活性與親本之間的差異，結(jié)果表明，雜交菌株的胞外多糖含量明顯高于2個(gè)親本，且單糖組成和比例與親本菌株G0154更接近，與親本菌株相比，雜交菌株胞外多糖的活性更強(qiáng)[23]。

2.2 原生質(zhì)體融合技術(shù)

原生質(zhì)體融合技術(shù)是改進(jìn)微生物菌株代謝物譜和生物量產(chǎn)量的有效手段。此外，該技術(shù)可以克服遠(yuǎn)緣菌株雜交的限制，對(duì)于珍稀野生藥用真菌馴化、藥用真菌菌種改良及新品種選育具有重要意義。育種步驟一般包括原生質(zhì)體制備和再生、親本原生質(zhì)體融合、融合子篩選、融合子鑒定等。有研究發(fā)現(xiàn)，擔(dān)子菌的細(xì)胞壁成分主要為葡聚糖和幾丁質(zhì)，采用組合酶制備原生質(zhì)體的酶解效果較好[24]。

藥用菌原生質(zhì)體的融合主要通過(guò)聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PEG）、電場(chǎng)或電脈沖誘導(dǎo)，其中最常用的是PEG（含 Ca²⁺ ）。有研究表明，PEG濃度對(duì)原生質(zhì)體融合具有重要影響。例如，魏荷芬等探究桃紅側(cè)耳原生質(zhì)體的制備條件，發(fā)現(xiàn)經(jīng) 250g?L^-1 PEG處理可得到高產(chǎn)蛋白質(zhì)的優(yōu)良融合菌株[25。然而，PEG具有一定毒性，對(duì)轉(zhuǎn)化效率和融合子再生具有負(fù)面影響。采用物理方法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合也是一種常見(jiàn)的育種技術(shù)。例如，高明俠等使用電脈沖誘導(dǎo)紫芝和赤芝原生質(zhì)體，融合率可達(dá) 0.038% ，發(fā)酵結(jié)果表明，與親本菌株相比，融合株的生物量與多糖含量顯著提高，且遺傳穩(wěn)定性好[26]。

3 現(xiàn)代育種技術(shù)

3.1 遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)

由于不同菌株的細(xì)胞壁成分差異較大，各菌種適用的遺傳轉(zhuǎn)化體系不盡相同。常用的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium-MediatedTransformation，ATMT）、原生質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Protoplast-MediatedTransformation，PMT）、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Liposome-Mediated Transformation，LMT）和電穿孔轉(zhuǎn)化法（Electroporation，EP），其中ATMT技術(shù)的應(yīng)用較廣，已用于多種藥用真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建[27]。例如，Chen等首次使用ATMT技術(shù)實(shí)現(xiàn)雙孢蘑菇的遺傳轉(zhuǎn)化[28]，隨后豬苓[29]、蟬花[30]等藥用真菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系也相繼建立。ATMT技術(shù)還可與自的基因過(guò)表達(dá)相結(jié)合，用于研究與藥用真菌功能活性成分代謝相關(guān)的基因。例如，Chen等研究發(fā)現(xiàn)，在蛹蟲(chóng)草中過(guò)表達(dá)EgtD、CmEIB和CmEgt2能明顯提高麥角硫因的產(chǎn)量，由此構(gòu)建一條麥角硫因合成途徑，并通過(guò)ATMT技術(shù)將該途徑引入蛹蟲(chóng)草基因組，成功提高發(fā)酵液和菌絲體中麥角硫因和蟲(chóng)草素的產(chǎn)量，推動(dòng)了蛹蟲(chóng)草在藥理學(xué)功能研究中的發(fā)展[31]。

3.2CRISPR/Cas9基因編輯育種技術(shù)

成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白9（Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-associated protein 9， CRISPR/Cas9）系統(tǒng)是第三代基因組編輯技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、精度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，該技術(shù)被用于雙孢蘑菇、靈芝、蛹蟲(chóng)草等藥用真菌的基因編輯，為藥用真菌次生代謝產(chǎn)物的高效合成提供可行的途徑。例如，Qin等在靈芝上成功建立CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)[32l，Wang等利用該基因編輯系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞色素P450單加氧酶（CYP450）基因cyp5150l8進(jìn)行編輯，進(jìn)而調(diào)控突變體的發(fā)酵產(chǎn)物，為靈芝和其他擔(dān)子菌類(lèi)蘑菇的進(jìn)一步基因編輯和代謝工程提供了研究方向[33]。

4結(jié)論與展望

近年來(lái)，全球?qū)λ幱谜婢男枨蟛粩嘣鲩L(zhǎng)，提高真菌發(fā)酵產(chǎn)物及其活性物質(zhì)產(chǎn)量成為研究熱點(diǎn)。培育高產(chǎn)藥用真菌品種的方法主要分為誘變育種、基因重組育種和現(xiàn)代分子育種，通常根據(jù)藥用菌的種類(lèi)、目標(biāo)產(chǎn)物、遺傳背景及經(jīng)濟(jì)價(jià)值等方面選擇合適的育種技術(shù)。然而，誘變育種與基因重組育種周期長(zhǎng)且可預(yù)測(cè)性低，已無(wú)法滿足發(fā)酵工業(yè)中的高產(chǎn)和高品質(zhì)要求。

遺傳轉(zhuǎn)化和CRISPR/Cas9基因編輯等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)有助于藥用真菌發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，加速藥用真菌活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用。但是，大多數(shù)藥用真菌并非傳統(tǒng)意義上的模式菌株，且遺傳背景復(fù)雜，遺傳操作方法尚不成熟，仍存在一些亟待解決的問(wèn)題。例如，遺傳背景復(fù)雜的藥用真菌難以建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，制約基因工程育種的應(yīng)用，后續(xù)需要利用測(cè)序技術(shù)對(duì)藥用真菌的遺傳背景進(jìn)行分析。大多藥用真菌在發(fā)酵過(guò)程中活性物質(zhì)的合成途徑與調(diào)控元件尚不清楚，缺乏系統(tǒng)研究與鑒定，嚴(yán)重阻礙現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的調(diào)控，后續(xù)需要加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化、通用化、精準(zhǔn)化的合成途徑與合成基因鑒定平臺(tái)及生物信息學(xué)分析平臺(tái)建設(shè)，不斷發(fā)掘各種活性物質(zhì)的合成途徑，明確具體的調(diào)控基因，以便實(shí)現(xiàn)藥用真菌的定向改造。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)面臨編輯效率低、脫靶效應(yīng)嚴(yán)重等難題，后續(xù)可以通過(guò)優(yōu)化目標(biāo)菌株的密碼子、選擇合適的啟動(dòng)子表達(dá)Cas9基因來(lái)提高編輯效率；還可通過(guò)改造系統(tǒng)元件，增加CRISPR系統(tǒng)基因編輯的特異性來(lái)減少脫靶效應(yīng)。

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（責(zé)任編輯：劉寧寧）