關(guān)鍵詞：鄖西馬頭山羊（Caprahircus）;線粒體DNA；D-loop區(qū)；遺傳多樣性

中圖分類號：S827 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）07-0198-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.07.034 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：口

Genetic diversity analysis of mitochondrial DNA D-loop region in Yunxi Matou goat

CHENGLei，LIUChen-hui’，CHENYang1，XIANGMin1，YUJie1，ZHONGZhu-xia1， XIAYong-chun2，YANGWu-jun3，HUXiu-zhong1

（1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，WuhanAcademyofAgriculturalSciences，Wuhan43O65，China; 2.Yunxi Qingqing Matou Goat Breeding Cooperative，Shiyan 442624，Hubei， China; 3.Yunxi County Animal Husbandryand Veterinary Service Center，Shiyan 442624，Hubei，China）

Abstract：ThegeneticdiversityofYunxiMatougoat（Caprahircus）wasevaluatedbasedongeneticvariationanalysisofmitochondrial DNA（mtDNA）D-loopregionsequences.Thecomplete mtDNA D-loop sequences of 184 Yunxi Matou goats were obtained by PCR amplificationandsequencing，folowedbysystematicanalysisof nucleotidepolymorphismandhaplotypediversity，neutralitytests （Tajima’s D and Fu’s Fs ），mismatch distribution analysis，and cluster analysis with mtDNA D-loop sequences from different goat breeds.The results showed that the proportions of A， G ，C，and Tbases in mtDNA D-loop of Yunxi Matou goat were 30.77% ， 14.26%， 26.26% ，and 28.71% respectively，with A+T content （ 59.48% ）significantly higher than G+C content （ 40.52% ）.There were 52 haplotypesand131variable sites inmtDNAD-loopofYunxiMatougoat，ncluding51singleton variablesitesand80parsimonyinformative sites.Fu's Fs test showed Fs value of -2.48 ，indicating significant deviation from the neutral model（ Plt;0.05 ）.The phylogenetictreeofYunxi Matou goatandotherfivegoatbreeds（Chuandong White goat，Shannan White goat，Huanghuai goat，Beichuan Whitegoat，andBoergoat）showedthat184individuals weredividedintothreemajorbranches，ncluding twonativebranchesand oneBoergoathybridbranch.TheYunxi Matougoatpopulationshowedhighpolymorphismandrichgeneticdiversitywithgreatbreeding potential，but exhibited genetic introgression from surrounding local goat breeds and Boer goat.

Key Words：Yunxi Matou goat（Capra hircus）；mitochondrial DNA;D-loop region； genetic diversity

馬頭山羊是中國優(yōu)良地方肉用山羊（Caprahircus）品種，主要分布于湖北、湖南等地，具有性成熟早、繁殖性能高、耐高溫高濕環(huán)境等特性[1]。由于缺乏科學(xué)的育種指導(dǎo)和系譜記錄不完善等原因，導(dǎo)致馬頭山羊品種退化、遺傳性能減弱等問題逐漸顯現(xiàn)，尤其是“重引進(jìn)、輕選育\"的現(xiàn)象導(dǎo)致群體一致性差、生產(chǎn)質(zhì)量下降、市場競爭力減弱，馬頭山羊的純種繁育及開發(fā)利用面臨新的挑戰(zhàn)。

哺乳動物線粒體DNA（MitochondrialDNA，mtD-NA）是由富含鳥嘌呤的重鏈和富含胞嘧啶的輕鏈共同構(gòu)成的環(huán)狀DNA分子，其重組率低，常被認(rèn)為是單核苷酸變異的儲存庫[2.3]。mtDNA D-loop 區(qū)是mtDNA上的非編碼區(qū)域，受到的選擇壓力小，其突變率高于編碼區(qū)域的突變率，且進(jìn)化速度在整個線粒體基因組中最快，D-loop區(qū)多態(tài)性在家畜遺傳多樣性分析、起源進(jìn)化和親緣關(guān)系鑒定等研究中具有重要應(yīng)用價值4。E等5利用微衛(wèi)星和mtDNA評估長江流域山羊的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu);Vacca等[6]通過分析不同山羊品種mtDNAD-loop序列，在地中海山羊中發(fā)現(xiàn)了新的單倍型；Nguluma等分析了12個坦桑尼亞當(dāng)?shù)厣窖蚍N群mtDNAD-loop序列的遺傳多樣性、母系起源和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系?；趍tDNAD-loop序列的地方山羊品種遺傳多樣性分析已有報(bào)道，包括廣西都安山羊和隆林山羊[8]、山西太行黑山羊[]涼山會理黑山羊[]及馬鞍山白山羊[]等，但有關(guān)馬頭山羊遺傳特性、起源進(jìn)化方面的研究較少。因此，通過測定mtDNAD-loop序列單核苷酸和單倍型多態(tài)性，分析馬頭山羊遺傳背景和親緣關(guān)系，對馬頭山羊品種的保護(hù)和利用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)樣品來自湖北勛西馬頭山羊養(yǎng)殖合作社，共184只健康馬頭山羊。用一次性真空采血管（含EDTA抗凝劑）頸靜脈采集試驗(yàn)羊只血液樣品約5mL -20^°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增片段測序

利用天根血液基因組DNA提取試劑盒從馬頭山羊全血中提取基因組DNA，參考韓浩園等[12]的研究結(jié)果設(shè)計(jì)馬頭山羊mtDNAD-loop序列PCR擴(kuò)增引物，由北京擎科生物科技有限公司合成。上游引物序列為 5^′ -AACCACTATTAACCACATCTA- 3^′ ，下游引物序列為 5^′ -CACTTACCATGTAAAAGACCC- ?3^′ 。PCR反應(yīng)體系 （20μL） ：上、下游引物各 0.5μL，2×Taq PCRMaster Mix 10μL ，模板DNA 1μL ， ddH₂O （20 8μL 。PCR擴(kuò)增程序： 95^°C 預(yù)變性 變性 30s

56^°C 退火 30s，72°C 延伸 60s，30 個循環(huán)； 72^°C 延伸 保存。反應(yīng)完成后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶長度與目的片段一致且亮度和純度符合要求的PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Chromas2軟件查看測序結(jié)果峰圖，采用DNAMAN9.0軟件進(jìn)行序列拼接，去除測序質(zhì)量差的雜峰，采用BioEdit7.2軟件進(jìn)行核苷酸序列組分分析，采用DNAsp5.10軟件統(tǒng)計(jì)鄖西馬頭山羊mtD-NAD-loop區(qū)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、核苷酸單倍型數(shù)、單倍型多樣性（Haplotypediversity，Hd）核苷酸多樣性（Nucle-otidediversity， π ）、平均核苷酸差異數(shù)（Averagenumberofnucleotidedifferences，k）、錯配分布Tajima’s D 和Fu's Fs 中性檢驗(yàn)等。將mtDNAD-loop序列導(dǎo)入NETWORK10.2軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載波爾山羊、川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊5個山羊品種的mtDNA D-loop序列（表1），利用MEGA11軟件比對序列并分析遺傳關(guān)系，利用Kimura2-parameter模型計(jì)算品種間的遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建勛西馬頭山羊與其他5個山羊品種的系統(tǒng)發(fā)育樹。

表15個山羊品種名品種的mtDNAD-loop序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNAD-loop序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以184只勛西馬頭山羊基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增mtDNAD-loop序列， 1% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR產(chǎn)物條帶清晰明亮且無雜帶，擴(kuò)增效果良好，擴(kuò)增片段大小約 1200bp ，與預(yù)期目的片段大小吻合（圖1）。

2.2 mtDNAD-loop序列分析

對184只勛西馬頭山羊核昔酸多態(tài)性及mtDNAD-loop序列堿基組成進(jìn)行分析，顯示A、G、 種堿基占比分別為 30.77%.14.26%.26.26% 、28.71%A+ T的占比為 59.48% ，明顯高于 G+C（40.52%） ，表明勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區(qū)富含A/T堿基，具有一定的偏倚性。共發(fā)現(xiàn)131個變異位點(diǎn)，占所測核昔酸的 11.62% ，其中包含51個單一多態(tài)位點(diǎn)，80個簡約信息位點(diǎn)（表2）。

圖1勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M：DL2000DNAMarker;1～20：鄖西馬頭山羊mtDNAD-loop序列的PCR產(chǎn)物

表2勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區(qū)核苷酸變異位點(diǎn)

序列高變區(qū)位置分析結(jié)果（圖2）顯示，鄖西馬頭山羊mtDNAD-loop序列堿基變異的分布有較大差異，區(qū)域 363～615bp 處變異概率較高，691～945 bp處變異概率較低。

2.3 勛西馬頭山羊群體歷史分析

對勛西馬頭山羊群體進(jìn)行Tajima's D 和 Fu sFs 中性檢驗(yàn)，Tajima's D 檢驗(yàn)結(jié)果顯示， D 為-0.30，但差異不顯著（ （Pgt;0.10） ，F(xiàn)u's Fs 檢驗(yàn)結(jié)果顯示， Fs 為-2.48，差異顯著（ Plt;0.05 ），表明種群分化可能偏離中性突變理論模型。種群的錯配分布（圖3）顯示，勛西馬頭山羊群體具有超過2個峰的多峰錯配分布。

2.4mtDNAD-loop區(qū)單倍型分析

利用DNAsp5.10軟件對鄖西馬頭山羊mtDNAD-loop序列進(jìn)行單倍型分析，共發(fā)現(xiàn)52種單倍型（表3）。其中，Hap-9個體數(shù)最多（16個），Hap-2（15個）和Hap-15（15個）次之。單倍型多樣性為0.957，核苷酸多樣性為0.020，平均核昔酸差異數(shù)為21.08。

圖2勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區(qū)核苷酸位置和核苷酸多樣性的關(guān)系

圖3勛西馬頭山羊種群錯配分布

表3勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區(qū)單倍型分布

單倍型網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果（圖4）顯示，試驗(yàn)群體劃分為A單倍型組、B單倍型組、C單倍型組，其中A單倍型組包括12個單倍型，分別為 、Hap-13、Hap-15、Hap-17、Hap-27、Hap-30、Hap-31、Hap-33、Hap-36、Hap-44、Hap-46。B單倍型組包括13個單倍型，分別為 Hap-4，Hap-6，Hap-12 Hap-16、Hap-22、Hap-23、Hap-34、Hap-41、Hap-43、Hap-45、Hap-47、Hap-49、Hap-51。C單倍型組包括27個單倍型，分別為Hap-1、Hap-5、Hap-7、Hap-8、Hap-9、Hap-10、Hap-11、Hap-14、Hap-18、Hap-19、Hap-20、Hap-21、Hap-24、Hap-25、Hap-26、Hap-28、Hap-29、Hap-32、Hap-35、Hap-37、Hap-38、Hap-39、Hap-40、Hap-42、Hap-48、Hap-50、Hap-52。

圖4勛西馬頭山羊mtDNAD-loop區(qū)單倍型網(wǎng)絡(luò)

綠色為A單倍型組；藍(lán)色為B單倍型組；紅色為C單倍型組

2.5 勛西馬頭山羊系統(tǒng)進(jìn)化分析

勛西馬頭山羊與川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊4個山羊品種的地理分布如圖5所示。勛西馬頭山羊與其他5個山羊品種（川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊、波爾山羊）的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）顯示，184個個體被分為3個大分支，每個分支下個體與單倍型網(wǎng)絡(luò)相對應(yīng)，其中A分支共包含58個個體，B分支包含41個個體，C分支包含85個個體。B分支存在4個亞支，其中3個亞支分別與黃淮山羊、陜南白山羊、川東白山羊聚為一支；C分支存在1個亞支，與北川白山羊聚為一支；A分支與B、C兩支遺傳距離較遠(yuǎn)，與波爾山羊聚為一支。

3 小結(jié)與討論

通過mtDNAD-Loop序列多態(tài)性對勛西馬頭山羊遺傳多樣性以及遺傳背景進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)184只馬頭山羊mtDNAD-loop序列中 A+T 的占比為59.48% ， G+C 的占比為 40.52% ，A/T堿基占比明顯高于G/C，與姜雪鷗等[13]、王國華等[14]及黃興等[15]的研究結(jié)果一致，符合mtDNAD-loop區(qū)富含A/T堿基以及高變異序列特征，其主要原因是A/T堿基的富集可以快速促進(jìn)RNA聚合酶等特異性分子的識別，有助于轉(zhuǎn)錄的完成[16。單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析結(jié)果顯示，鄖西馬頭山羊群體的 Hd 為0.957，高于黃勤華等[17]、Ling等[18]報(bào)道的湖南馬頭山羊 Hd （0.808和0.781），單倍型多樣性豐富。此外，序列中共發(fā)現(xiàn)131個變異位點(diǎn)和52種單倍型。鄖西馬頭山羊具有豐富的群體遺傳多樣性，育種潛能大。

圖5各山羊品種地理位置

CDW：川東白山羊；SNW：陜南白山羊；HHG：黃淮山羊； BCW：北川白山羊；MTG：鄖西馬頭山羊。下圖同

圖6勛西馬頭山羊與其他5個山羊品種的系統(tǒng)發(fā)育樹

對勛西馬頭山羊群體進(jìn)行中性檢驗(yàn)，顯示 Fs 為-2.48，顯著偏離中性期望，表明種群可能經(jīng)歷過擴(kuò)增事件；多峰錯配分布表明，勛西馬頭山羊群體可能具有不同來源或與不同群體存在基因交流。構(gòu)建勛西馬頭山羊與其他5個山羊品種（川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊、波爾山羊）的系統(tǒng)發(fā)育樹，184個個體被分為3個大分支，分別為2個本地支與1個波爾山羊雜交支。2個本地支與黃淮山羊、陜南白山羊、川東白山羊、北川白山羊等地方品種存在一定親緣關(guān)系，與地理事實(shí)基本相符合，并且與楊心春等的研究結(jié)果一致，推測可能是勛西馬頭山羊過去長期實(shí)施半放牧半舍飼，甚至完全放牧的生產(chǎn)模式，與鄰近地區(qū)其他山羊品種發(fā)生了基因交流所致。波爾山羊雜交支與2個本地支遺傳距離較遠(yuǎn)，與波爾山羊具有較近的親緣關(guān)系，可視為1個獨(dú)立分支，推測可能由于實(shí)際生產(chǎn)中部分養(yǎng)殖戶為改善經(jīng)濟(jì)性狀將鄖西馬頭山羊與波爾山羊進(jìn)行雜交所導(dǎo)致。研究結(jié)果表明，在長期的自然選擇和人工選擇下，勛西馬頭山羊可能與周邊多個地方山羊品種存在基因交流。

線粒體多態(tài)位點(diǎn)可以作為品種鑒定的輔助分子標(biāo)記，而且將mtDNAD-loop區(qū)全序列作為DNA條形碼進(jìn)行品種鑒定，在家禽中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[19.20]，但在家畜中相關(guān)研究才剛剛起步[21]。本研究通過錯配分布、單倍型網(wǎng)絡(luò)和系統(tǒng)發(fā)育樹3種方法相互驗(yàn)證，結(jié)果高度一致，均顯示勛西馬頭山羊群體與不同山羊群體存在基因交流，且波爾山羊雜交支與其他支存在差異。研究結(jié)果表明，mtDNAD-loop序列可用于檢測鄖西馬頭山羊是否存在外來引進(jìn)山羊品種的基因滲入。從形態(tài)學(xué)上分析，鄖西馬頭山羊與4個鄰近地區(qū)的地方品種川東白山羊、陜南白山羊、黃淮山羊、北川白山羊及外來引進(jìn)品種波爾山羊的毛色均為白色，鄖西馬頭山羊相較于其他5個品種最大的區(qū)別為無角。在實(shí)際的選育過程中，大多數(shù)養(yǎng)殖戶主要根據(jù)表型特征進(jìn)行選育，從而導(dǎo)致部分地方品種優(yōu)良特性逐漸流失。通過綜合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)差異分析為地方品種遺傳資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯雷霄飛）