關(guān)鍵詞：深秋紅;沙棘（Hippophaerhamnoides）;HrNHX1基因;基因克隆;生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S793.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）07-0192-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.07.033 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Cloning and bioinformatic analysis of NHXl gene in Shenqiuhong Hippophae rhamnoides

CUI Chang-zhena，HUO Yan-boab，ZHANG Si-yua，CHAI Guai-qianga.b，BAO Liang-liangb，DUAN Yi-zhong.b （a.College of AdvancedAgricultural Sciences；b.Yulin Genuine QinMedicinal Materials Research Institute，Yulin University， Yulin 719000，Shaanxi，China）

Abstract：UsingShenqiuhongHippophaehamnoidesastheexperimentalmaterial，thegeneencodingtheNHX1proteiof heNa+/H+ antiporter（NHX）familywascloned，andbioinformaticanalysis was performedonthe HippophaerhamnoidesNHX1protein（HrNHX1）.Theresults indicatedthatthefullengthofthe HrNHX1 gene wasapproximately6OObp，encodinganacidic hydrophobicpro tein consisting of 538 amino acid residues.The molecular formula of this protein was C₂₇₅₄H₄₂₆₉N₆₇₂O₇₅₉S₂₁ ，with a total of 8 502 atoms andarelativemolecular massof 59637.71.HrNHX1belonged toastableprotein，containing13transmembrane domains，ackinga signalpeptid，beingano-secretoryproteinndcontainingoneNa+/HexchangerdomaincharacteristicoftheNHXproteinfamily. Subcelularlocalizationanalysisshowedthatthe HNHX1proteinwaslocalizedonthevacuolarmembrane.Homologyalignmetanalysis indicated thattheHrNHX1proteinsequencehadhighsequencesimilaritywiththeNHX1proteinsequencesofGosypiumaimondi，Gossypiumhirsutum，Morusnotabilis，ndHeveabrasiliensis.PhylogenetictreeanalysisfoundthattheHrHX1proteinsequence clusteredonthesameevolutionarybranchwiththeNHXproteinsequencesofriceandwheat，whichhaddroughtresistanceandsalt tolerancefunctions，sugestingtheyhadacloseevolutionaryrelationship.The HrNHX1geneplayedanimportantroleinenhancing plantdroughtresistanceandsalttolerance，andregulatingtheactivityofitsencodedHrNHX1proteinorthexpresionlevelofthis gene could effectively improve plant adaptability to drought and salt stress.

Key words： shenqiuhong; Hippophae rhamnoides； HrNHXl gene;gene cloning；bioinformatic analysis

沙棘（Hippophaerhamnoides）屬于胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬（Hippophae），是一種具有顯著經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值的植物[1]。在干旱的環(huán)境中，沙棘葉片細(xì)小且具有較厚的角質(zhì)層和多表皮毛的特征，可有效減少水分蒸發(fā)，具有較好保水能力和抗旱性[2]。干旱阻礙植物的營養(yǎng)生長，使得植物的葉面積呈減小趨勢，從而影響其光合作用3；干旱還可以改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重時(shí)會導(dǎo)致植物死亡。若植物生長過程中長期受土壤環(huán)境干旱脅迫，植物細(xì)胞會處于低滲透壓狀態(tài)[4]，進(jìn)而影響植物生長發(fā)育。沙棘在處于適度干旱環(huán)境時(shí)能夠生存并長勢良好，這與其獨(dú)特的生理生化特性密切相關(guān)，即發(fā)達(dá)的根系能夠充分吸收土壤中的水分，同時(shí)根的形狀和結(jié)構(gòu)也適應(yīng)沙質(zhì)土壤環(huán)境，能夠有效固定土壤，防止水土流失[5]。

首次在大麥中發(fā)現(xiàn) Na⁺/H⁺ 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（NHX）后，科學(xué)工作者陸續(xù)在擬南芥（Arabidopsisthaliana）、玉米（Zea mays）、辣椒（Capsicum annu-um）大白菜（Brassica rapa ssp.Pekinensis）等植物中通過克隆得到NHX的同源基因，證實(shí)了NHX基因在植物界中廣泛存在。NHX作為 Na⁺/H⁺ 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在鹽脅迫條件下通過介導(dǎo) Na⁺ 和 H⁺ 的跨膜運(yùn)輸維持細(xì)胞質(zhì)離子穩(wěn)態(tài)，有效減輕鹽離子對細(xì)胞功能的損傷7；同時(shí)該蛋白還能調(diào)節(jié)水分跨膜運(yùn)輸，維持細(xì)胞內(nèi)水分平衡，從而增強(qiáng)植物對干旱脅迫的適應(yīng)能力[8]。NHX基因在植物響應(yīng)鹽堿脅迫時(shí)，利用質(zhì)子泵和植物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜 H⁺ 電化學(xué)梯度作為驅(qū)動(dòng)力，將細(xì)胞質(zhì)中的 Na⁺ 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外或區(qū)隔化至液泡中，從而維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)低 Na⁺ 濃度狀態(tài)。這一過程不僅有效減輕 Na⁺ 的細(xì)胞毒性，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) pH 穩(wěn)態(tài)[9]。此外，NHX基因還可能影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量，進(jìn)而維持細(xì)胞膨壓達(dá)到抗旱的作用[10]。NHX基因在提升植物抗鹽性的同時(shí)，植物的抗旱能力也有所提升，AtNHX5基因過表達(dá)提高了桑樹的抗旱和耐鹽能力[]。ArNHX5基因或AtNHX6基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯耐鹽抗旱性顯著提高。在對 ZxNHX/VPI-I 轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，ZxNHX/VP1-1通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因小麥 Na⁺ 和 K⁺ 在細(xì)胞中的分布，增加植物耐鹽性，并通過提升細(xì)胞內(nèi)脯氨酸和可溶性糖等物質(zhì)增加其抗旱性，在正常的鹽脅迫下小麥的葉綠素含量降低，但轉(zhuǎn)基因小麥的葉綠素含量比正常小麥高，也證明NHX可提高植物抗鹽能力[12]。

沙棘抗旱性研究大多聚焦在生理特性上，關(guān)于沙棘抗旱基因的研究較少，根據(jù)NHX基因在其他植物中發(fā)揮的作用，推測沙棘可能通過NHX基因高表達(dá)，提升細(xì)胞內(nèi)離子濃度，從而升高滲透勢，致使植物組織吸水能力增強(qiáng)，最終增強(qiáng)其在干旱脅迫中的生存能力[13]。以深秋紅沙棘為研究對象，通過生物信息學(xué)分析沙棘NHX1蛋白（HrNHX1）的結(jié)構(gòu)，并預(yù)測HrNHX1是否為抗旱基因，為植物抗逆性育種和分子生物學(xué)研究提供重要依據(jù)。

材料與方法

1.1材料

以內(nèi)蒙古沙棘品種深秋紅為試驗(yàn)材料，精選子粒飽滿、大小均一的種子100粒進(jìn)行播種，最終發(fā)芽97粒，發(fā)芽率達(dá) 97% 。待幼苗株高為 15-20cm 時(shí)，采集健康葉片作為試驗(yàn)樣品。

1.2沙棘的干旱處理及沙棘總RNA的提取

將種子用 KMnO₄ 消毒處理后以10顆種子為1組放置于濾紙上（每個(gè)培養(yǎng)皿中放置2張 11cm 的濾紙），用去離子水潤濕，將種子放置在恒溫培養(yǎng)箱中。待到其長出真葉時(shí)，移栽到 10cm （高） ?5cm （直徑）的育苗盤中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中育苗，溫度 20～ 28^°C ，出苗后每天澆1次水，待幼苗長至 15～20cm 時(shí)進(jìn)行干旱脅迫處理。選取長勢旺盛，生長一致的沙棘幼苗。于2024年2月1日10：00停止供水，分別在停水后0、6、12、24、48、96h進(jìn)行采樣。采集的沙棘葉立即放入液氮壺中，在 -80°C 的冰箱中儲存?zhèn)溆?。RNA提取參照試劑盒說明書操作，首先將液氮速凍的沙棘葉片充分研磨成細(xì)粉后立即加入適量裂解液，經(jīng)充分渦旋混勻后離心取上清液，該上清液通過CS過濾柱去除基因組DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，隨后將濾液轉(zhuǎn)移至CR3吸附柱，依次使用RW1去蛋白液、DNaseI工作液和漂洗液進(jìn)行柱上處理，最后用無RNase的去離子水洗脫獲得高純度RNA。RNA樣品通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性檢測，并測定其濃度和純度。將RNA樣品分裝后保存于-80^qC 超低溫冰箱中備用。

1.3 PCR擴(kuò)增與序列測序

根據(jù)PrimescriptTMII1st Strand Cdna Synthesis Kit說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取 5μL cDNA，加人20μL RNase Free ddH₂O 進(jìn)行稀釋，在 0.2mL 的PCR管中，依次加人cDNA（ 1μL ） 、上下游引物（ 1μL ）、 ddH₂0 （ 10.5μL 等，定容至25μL ，混勻。

PCR擴(kuò)增程序： 95^°C 預(yù)變性 3min;95^°C 變性 30s 56^°C 退火 30s，72°C 延伸 1min ，32個(gè)循環(huán)； 72^°C 延伸 5min 。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物送至西安生工生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 生物信息分析方法

利用EXPASY中的ProtParamtool分析蛋白的組成成分（氨基酸種類及數(shù)量）和理化性質(zhì)（相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性、脂溶性、酸堿性、親水性/疏水性等），采用ProtScale工具分析蛋白質(zhì)的親水性/疏水性特征，利用NCBI的CD-Search工具預(yù)測蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及蛋白結(jié)構(gòu)的功能。通過Prabi在線工具進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，利用SWISS-MODEL構(gòu)建蛋白三級結(jié)構(gòu)模型;采用DeepTMHMM1.0在線工具預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域，通過SignalP4.1Server分析信號肽序列，同時(shí)結(jié)合WoLFPSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫和DNAman開展蛋白質(zhì)序列同源性比對與分析，使用MEGA11.0.13軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 HrNHX1基因的克隆

將沙棘葉片的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在約 1600bp 處有一條清晰且明顯的條帶（圖1），將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到 HrNHX 基因的核酸及氨基酸序列（圖2）。

2.2 HrNHX1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1HrNHX1蛋白的理化性質(zhì)由表1可知，HrNHX1蛋白由538個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包含全部20種氨基酸，其中亮氨酸（Leu）占比最高，達(dá) 12.8% ，半胱氨酸（Cys）含量最低，僅占 1.1% 。HrNHX1蛋白含有42個(gè)帶負(fù)電的氨基酸殘基（ Asp+Glu 和38個(gè)帶正電的氨基酸殘基（ Arg+Lys ），其分子式為C₂₇₅₄H₄₂₆₉N₆₇₂O₇₅₉S₂₁ ，總原子數(shù)達(dá)8502個(gè)，相對分子質(zhì)量為59637.71。由于等電點(diǎn)小于7.00，表明該蛋白為酸性蛋白。 ΔHrNHX1 蛋白為疏水性蛋白，親水系數(shù)為0.534；該蛋白在第483個(gè)氨基酸殘基處親水性最強(qiáng)，親水系數(shù)為-2.756，而在第63個(gè)氨基酸殘基處疏水性最強(qiáng)，親水系數(shù)為3.256（圖3）。HrNHX1蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為38.90，不穩(wěn)定指數(shù)小于40.00通常指示蛋白穩(wěn)定性良好，因此判斷該蛋白為穩(wěn)定蛋白。綜合考慮其疏水性和穩(wěn)定性特征，推測該蛋白屬于穩(wěn)定疏水性蛋白。HrNHX1蛋白的脂肪族指數(shù)為111.26，表明其具有較高的熱穩(wěn)定性。

圖1HrNHX1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

表1HrNHX1蛋白的理化性質(zhì)

圖3HrNHX1蛋白親水性預(yù)測

2.2.2HrNHX1蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測分析利用NCBI的CD-Search工具預(yù)測 HrNHX1 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖4所示。 HrNHX1 蛋白序列中第 50～ 442位氨基酸構(gòu)成一個(gè)典型的 Na⁺/H⁺ exchanger結(jié)構(gòu)域。該家族蛋白在植物抗逆性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi) pH 和離子穩(wěn)態(tài)來增強(qiáng)耐鹽性，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓，進(jìn)而提高植物的抗旱能力。

2.2.3HrNHX1蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析利用Prabi在線工具對HrNHX1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果（表2）表明， HrNHX1 蛋白二級結(jié)構(gòu)中∝ 螺旋占比最高，為 44.98% ，其次為無規(guī)卷曲和延伸鏈，占比分別為 32.90% / 17.84% ， β 轉(zhuǎn)角占比最少，為 4.28% 。利用SWISS-MODEL在線平臺構(gòu)建了HrNHX1蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型（圖5）。

2.2.4HrNHX1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽及亞細(xì)胞定位分析選擇DeepTMHMM1.0在線工具對HrN-HX1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果（圖6）表明，該蛋白具有13個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。利用SignalP

表2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)占比

圖5HrNHX1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

4.1Server對HrNHX1蛋白的信號肽進(jìn)行分析（圖7），發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在信號肽，為非分泌蛋白。通過WoLFPSORT在線工具預(yù)測HrNHX1蛋白的亞細(xì)胞定位，該蛋白定位于液泡膜，這與NHX基因的典型定位相符。

圖 6HrNHX1 跨膜結(jié)構(gòu)域

圖7HrNHX1蛋白的信號肽預(yù)測

2.2.5HrNHX1蛋白序列同源性比對由圖8可知，HrNHX1蛋白序列與雷蒙德氏棉（Gossypiumraimon-dii）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）川桑（Morus nota-bilis）、橡膠樹（Heveabrasiliensis）NHX1蛋白序列的相似性為 76.69%～80.84% ，表明沙棘與其他植物NHX1蛋白序列顯示出較高的同源性。

2.2.6HrNHX1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立利用MEGA11軟件中的Neighbor-Joining（NJ）方法，將HrNHX1蛋白與文獻(xiàn)報(bào)道有功能的水稻（Oryzasati-va）小麥（Triticumaestivum）桑樹（Morusnotabilis）、霸王（Zygophyllumxanthoxylum）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）大豆（Glycinemax）、豇豆（Vignaunguicu-lata）的NHX蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建（圖9）。HrNHX1蛋白序列與水稻、小麥具有抗旱、耐鹽功能的NHX蛋白序列聚類于同一進(jìn)化分支，表明它們在進(jìn)化上具有較高的親緣關(guān)系，推測HrNHX1蛋白可能具有抗旱、耐鹽功能。桑樹、霸王、陸地棉、大豆和豇豆的NHX1蛋白序列并未與HrNHX1蛋白序列位于同一進(jìn)化分支上，表明它們在進(jìn)化上的親緣性較遠(yuǎn)。

圖9沙棘與其他植物NHX蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 小結(jié)與討論

NHX蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)的 pH 和 Na⁺ 的平衡方面起著重要作用，對維持細(xì)胞正常生理功能和整體穩(wěn)態(tài)具有重要意義。在植物中，NHX蛋白通過可逆濃度梯度將細(xì)胞內(nèi)的 Na⁺ 泵到細(xì)胞外或液泡內(nèi)，從而維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，這一功能對響應(yīng)植物的非生物脅迫應(yīng)答，尤其是對抗旱性和抗鹽性具有重要作用。提高植物中NHX基因的表達(dá)量不但可以提高植物對于鹽堿脅迫的耐受能力，而且可以提高植物的抗旱性[14]

通過與多種植物的NHX蛋白進(jìn)行同源比對發(fā)現(xiàn)，HrNHX1蛋白序列與雷蒙德氏棉（Gossypiumrai-mondii）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）川桑（Morusnotabilis）橡膠樹（Heveabrasiliensis）NHX1蛋白序列具有較高的序列相似性。已有研究表明，在轉(zhuǎn)基因大豆中過表達(dá)TaNHX2基因可以提高脯氨酸和可溶性糖的含量，而這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠增強(qiáng)細(xì)胞滲透壓，從而改善植株在干旱條件下的抗逆能力[15]由于 HrNHX1 與TaNHX2聚類于同一進(jìn)化分支，因此推測它們可能具有類似功能，即通過維持細(xì)胞膨壓、調(diào)節(jié)滲透平衡來增強(qiáng)沙棘的抗旱性。在干旱和鹽脅迫下，OsNHX1基因過表達(dá)可以提高水稻植株的耐旱性和耐鹽性[16]。 NHX 基因在提高植物耐鹽性的同時(shí)也會提升植物的抗旱性，印證了HrNHX1基因具有抗旱能力。同時(shí)，通過對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)， HrNHX1 蛋白二級結(jié)構(gòu)中 ∝ 螺旋占比最高，為 44.98% ，是其二級結(jié)構(gòu)的主要組成形式，這一特征與其作為離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能特性相符[17]。HrNHX1蛋白被預(yù)測為酸性且穩(wěn)定的疏水性蛋白，其結(jié)構(gòu)中含有13個(gè)跨膜區(qū)域，且不存在信號肽，為非分泌蛋白。亞細(xì)胞定位分析表明，該蛋白定位于液泡膜中。這些發(fā)現(xiàn)為探究HrNHX1蛋白的具體功能提供了重要理論依據(jù)。綜上，本研究結(jié)果將為深入探討HrNHX1基因在沙棘抗旱機(jī)制中的作用提供理論依據(jù)，同時(shí)為沙棘抗逆育種及分子生物學(xué)研究提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]王生云，逯亞玲，連歡歡，等.青海省沙棘產(chǎn)業(yè)發(fā)展影響因素及對策［J].青海農(nóng)林科技，2023（3）：33-36，71.

[2]楊雪芳.中國沙棘葉解剖學(xué)特征及黃酮關(guān)鍵酶活性研究[D].太原：山西大學(xué)，2017.

[3］張佩佩.樹木非結(jié)構(gòu)性碳水化合物對干旱的響應(yīng)及其調(diào)控機(jī)制[D].上海：華東師范大學(xué)，2020.

[4]方圓.節(jié)節(jié)麥抗旱性種質(zhì)資源篩選及其轉(zhuǎn)錄組分析[D].鄭州：河南大學(xué)，2014.

[5]王樹青.山西省呂梁市沙棘產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對策分析[J].山西林業(yè)科技，2023，52（S1）：56-57.

[6]BASSILE，BLUMWALDE.The insand outsof intracellular ion ho-meostasis：NHX-typecation /H⁺ transporters [J」.Current opinion inplant biology，2014，22：1-6.

[7]龍鳳.Epichloébromicola內(nèi)生真菌對堿脅迫下布頓大麥生長及離子平衡的影響[D].新疆阿拉爾：塔里木大學(xué)，2023.

[8]萬鵬.擬南芥 Na⁺/H⁺ 反向交換體基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2015.

[9]王宇，賈冰晨，吳筱林，等.藜麥CqNHX基因家族鑒定及表達(dá)模式分析[J].煙臺大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)與工程版），2020，33（3）：270-275.

[10] PARDO E M，TOUM L，PEREZ BORROTO L S，et al. Ectopicexpression of GmNHX3 and GmNHX1，encoding two Glycine maxNa+/H+vacuolar antiporters，improves water deficit tolerance inArabidopsis thaliana[J].Biologyplantarum，2021，65：157-166.

[11]LIM，LIY，LIHQ，et al.Overexpression of AtNHX5 improvestolerance to both saltand drought stress in Broussonetia papyr-ifera（L.）Vent[J].Tree physiology，2011，31（3）：349-357.

[12]段崇豪.ZxNHX/VP1-1轉(zhuǎn)基因小麥耐鹽功能研究[D].濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2023.

[13]YARRAR，HE S J，ABBAGANI S，et al. Overexpression of awheat Na⁺/H⁺ antiporter gene（TaNHX2）enhances tolerance tosalt stress in transgenic tomato plants （Solanum lycopersicum L.）[J].Plant cell，tissue and organ culture，2012，111： 49-57.

[14]孫琦，黃薇，劉芳，等.小擬南芥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及NHX2基因的克隆與表達(dá)[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，37（2）：200-209.

[15]張小明，薛永國，王萍，等.轉(zhuǎn)TaNHX2基因大豆的抗旱性鑒定[J].大豆科學(xué)，2017，36（4）：519-524.

[16]LIU S，ZHENG L，XUE Y，et al. Overexpression of OsVP1 andOsNHX1 increases tolerance to drought and salinity in rice [J].Journal of plant biology，2010，53（6）：444-452.

[17]馬玉花，冶貴生，龍曉晨，等.柴達(dá)木盆地梭梭NHX基因的克隆及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，31（3）：86-90.

（責(zé)任編輯雷霄飛）