關(guān)鍵詞：多根紫萍（Spirodela polyrrhiza）；SpLAR基因；生物信息學(xué)；表達(dá)分析；載體構(gòu)建中圖分類(lèi)號(hào)：R932；Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2025）07-0120-08DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.07.021

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Cloning，expression analysis and expression vector construction of the SpLAR gene in Spirodela polyrrhiza

LIUWen-ying，ZUOYan-xi，HEShu-ping，YANGPu，XIANGBei-bei （SchoolofChinese Materia Medica，Tianjin UniversityofTraditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）

Abstract：Toinvestigatetheroleoftheleucoanthocyanidinreductase-encodinggeneSpLARinproanthocyanidinbiosynthesisinSpiro delapolyrrhiza，thefull-length SpLAR cDNA sequence was obtained from transcriptome data and the gene was successfully cloned. The characteristics of the SpLAR protein were predicted，and the expression levels of the SpLAR gene under different culture days and nutrientstressconditionsweredetectedAditinall，bymeasuringtheaccumulatioofproanthocyanidnsudercoespondingoditions，the correlation between the expression level of the SpLAR gene and the accumulation of proanthocyanidins was further analyzed. ThepCAMBIA3Ol-SpLARplantexpresionvectorwasconstructedusinghomologousrecombinationtechnologyBioinformatisanalysisresultsshowedthatthegenewas1O59bpinlength，encoding352aminoacids，withapredictedmolecularweightof38ku.Itwas ahydrophilicandunstable protein，containingone transmembrane domain，having nosignal peptide，and belonging to the NADB_Rossmannsuperfamily.TheSpLARproteinhadthehighestsimilaritywiththehomologous proteinfromColocasiaesculenta. RT-qPCRandcontentdeterinationresultsindicatedthattheexpresionleveloftheSpLARgeneshowedadynamictrendofirstincreasingandthendecreasing，andwaspositivelycorelatedwiththeaccumulationofproanthocyanidins.UnderDatkotreatment，the expression level of the SpLAR gene was the highest at 9d，and at this time，the accumulation of proanthocyanidins reached a peak of 20.6mg/g .Inaddition，thenutrientstresstreatmentcouldsignificantlypromotetheexpressionofthe SpLARgeneandthebiosynthesis of proanthocyanidins，increasing the accumulation to 24.8mg/g at 9 d.

KeyWords：Spirodela polyrrhiza；SpLAR gene;bioinformatics；expressionanalysis；vector construction

浮萍（Duckweeds）隸屬于天南星科浮萍亞科（Lemnoideae），該亞科包含5個(gè)屬，分別為紫萍屬（Spirodela）斑萍屬（Landoltia）青萍屬（Lemna）、扁無(wú)根萍屬（Wolffiella）以及無(wú)根萍屬（Wolffia）[]。多根紫萍（Spirodelapolyrrhiza）作為中藥浮萍的主要來(lái)源，全草均可入藥，具有宣散風(fēng)熱、透疹和利尿之功效[2。現(xiàn)代藥理研究顯示，多根紫萍富含多種活性成分，諸如類(lèi)黃酮及多酚類(lèi)化合物3，具備抗菌、抗氧化、促進(jìn)康復(fù)、退熱、降低血壓、收縮血管及利尿等多種藥理活性[4]

原花青素（Proanthocyanidins，PAs）又稱(chēng)縮合單寧，是多根紫萍中一類(lèi)重要的類(lèi)黃酮化合物5。其在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域均有著廣泛應(yīng)用[。原花青素在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抵御紫外線輻射、增強(qiáng)抗逆性以及防御病蟲(chóng)害等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7。此外，原花青素對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，能夠有效預(yù)防心血管疾病，并展現(xiàn)出抗衰老、抗炎、抗腫瘤及抗誘變等多種生物活性[8]。Seferli等9通過(guò)DPPH清除試驗(yàn)證實(shí)，浮萍提取物具有清除自由基的能力，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷方面具有潛在生物學(xué)意義，此效果可能與其富含的原花青素及其他抗氧化成分有關(guān)[10]

在植物原花青素生物合成途徑中，無(wú)色花青素還原酶LAR起著關(guān)鍵作用，可催化無(wú)色花青素向兒茶素的直接轉(zhuǎn)化反應(yīng)[11]。已有多種植物中的 LAR 基因被克隆，且針對(duì)這些基因開(kāi)展了表達(dá)分析，如薄殼山核桃[]桑樹(shù)[13]弼猴桃[14]等。研究表明， LAR 的表達(dá)情況與原花青素的累積存在相關(guān)性[15]，例如，在白楊中過(guò)表達(dá) PtrLARI 或 PtrLAR3 基因，均能顯著提升轉(zhuǎn)基因白楊植株中的原花青素水平[16];在轉(zhuǎn)基因煙草中上調(diào) LAR 基因的表達(dá)，可增加葉片中原花青素的積累[17]。此外，植物生長(zhǎng)發(fā)育周期及外界環(huán)境因素的變化能夠調(diào)控 LAR 基因的表達(dá)。Liu等[18]測(cè)定了可可葉、花、豆莢外果皮和種子中TcLAR的表達(dá)水平及原花青素含量，發(fā)現(xiàn)TcLAR基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量存在差異。在Tao等[19]測(cè)定的營(yíng)養(yǎng)脅迫下斑萍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，編碼類(lèi)黃酮生物合成轉(zhuǎn)錄本的關(guān)鍵酶表達(dá)水平顯著升高，其中 LAR 基因的表達(dá)也得到增強(qiáng)。

浮萍因其生長(zhǎng)迅速、遺傳操作便利，逐漸成為植物合成生物學(xué)的研究熱點(diǎn)[20]。以浮萍作為底盤(pán)細(xì)胞，運(yùn)用基因編輯2及營(yíng)養(yǎng)脅迫22等技術(shù)手段來(lái)生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物，具有簡(jiǎn)便易操作的特點(diǎn)，且展現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景。然而，截至目前，尚未有關(guān)于多根紫萍原花青素生物合成途徑中關(guān)鍵基因的克隆以及基因表達(dá)量與原花青素積累相關(guān)性的研究報(bào)道。因此，闡明次生代謝途徑關(guān)鍵酶的功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。鑒于此，本試驗(yàn)克隆了多根紫萍 SpLAR 基因，借助生物信息學(xué)方法分析了SpLAR蛋白特性，并檢測(cè)了不同生長(zhǎng)期和營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下SpLAR基因的表達(dá)情況與原花青素積累的相關(guān)性。同時(shí)，構(gòu)建了植物表達(dá)載體，為后續(xù)探究SpLAR基因功能以及利用合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)原花青素奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

多根紫萍為實(shí)驗(yàn)室保存并繼代培養(yǎng)的植株，培養(yǎng)于Datko營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液及營(yíng)養(yǎng)脅迫培養(yǎng)液（無(wú)菌水，pH6 ）中。培養(yǎng)條件設(shè)置為光照 16h 、黑暗 8h ，光子通量密度 45μmol/（m²?s） ，溫度 （25±1）^°C^[23] 。試驗(yàn)所需試劑如表1所示。

表1試驗(yàn)所需試劑

1.2 方法

1.2.1總RNA提取及cDNA的合成依照RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明，提取多根紫萍的RNA。使用1% 的瓊脂糖凝膠及Nanodrop2000核酸分析儀對(duì)提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量和純度檢測(cè)。在確保所提取RNA質(zhì)量合格后，以多根紫萍總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并將其儲(chǔ)存于 -80^°C 備用。

1.2.2SpLAR基因的克隆前期對(duì)多根紫萍轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)定，從中挖掘出 SpLAR 基因的全長(zhǎng)cDNA序列，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)了特異性引物，引物序列如表2所示。擴(kuò)增條件設(shè)置如下： 95°C 預(yù)變性 180s 95^°C 變性 15s，60^°C 退火 15s，72‰ 延伸 55s ，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)； 72^°C 終延伸 5min 。獲得的PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。利用膠回收試劑盒對(duì)目的基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，將其與T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α 。經(jīng)過(guò)菌落PCR鑒定后，將樣本送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3SpLAR基因的生物信息學(xué)分析如表3所示，利用在線網(wǎng)站和軟件對(duì)多根紫萍SpLAR基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析[24]

1.2.4SpLAR基因在不同生長(zhǎng)期及營(yíng)養(yǎng)脅迫下的表達(dá)情況分析為研究 SpLAR 基因在不同生長(zhǎng)期及營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下（無(wú)菌水， 的表達(dá)情況，以Datko營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)組為對(duì)照，分別在培養(yǎng)3、6、9、12d時(shí)采集樣本并分析。上述時(shí)間點(diǎn)依次對(duì)應(yīng)多根紫萍的幼嫩期、指數(shù)生長(zhǎng)期、成熟期及衰老期。首先提取多根紫萍總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。之后以cDNA為模板，利用RT-qPCR反應(yīng)檢測(cè)SpLAR基因的表達(dá)情況。設(shè)計(jì)RT-qPCR特異引物，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列如表2所示。擴(kuò)增體系如下： 2× SuperRealPreMix Plus 10μL ；上游引物 10μmol/L 0.6μL ；下游引物（ 10μmol/L） 0.6μL 滅菌水 7.8μL;cDNA1μL 反應(yīng)在Bio-Rad儀器上進(jìn)行，采用兩步法反應(yīng)程序，使用 2^-ΔΔct 法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.5多根紫萍原花青素含量測(cè)定稱(chēng)取 50mg 多根紫萍粉末，置于 10mL 離心管中，加入 5mL60% 乙醇溶液，于 30^cC 條件下以300W功率、 40kHz 頻率超聲提取 30min 。提取結(jié)束后，將溶液置于室溫，補(bǔ)足失重，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。取 1mL 供試品溶液，加人 2mL4% 香草醛甲醇溶液和 1mL 濃鹽酸，在室溫下反應(yīng) 20min ，隨后在 530nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多根紫萍中原花青素的濃度，并通過(guò)以下公式計(jì)算原花青素的含量。

原花青素含量 Π=C×V×_n/m

式中， C 為多根紫萍原花青素質(zhì)量濃度 ?mg/mL? V為提取液體積（ Ω_mL ）； n 為稀釋倍數(shù)； m 為多根紫萍粉末質(zhì)量。

1.2.6植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-SpLAR的構(gòu)建結(jié)合pCAMBIA1301植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，使用Snapgene軟件設(shè)計(jì)了帶有酶切位點(diǎn)、同源臂序列的特異性引物，引物序列如表2所示。在BstEⅡ和NcoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)對(duì)pCAMBIA1301表達(dá)載體進(jìn)行酶切，擴(kuò)增并純化回收目的基因，隨后按照無(wú)縫克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)，將目的基因片段與線性pCAM-BIA1301表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α ，涂布于具有卡那霉素抗性的LB（ 50mg/L） 平板上，37^°C 條件下倒置培養(yǎng) 12h ，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性質(zhì)粒送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析使用SPSS20.0軟件。采用單因素方差分析的鄧肯法檢驗(yàn)不同培養(yǎng)天數(shù)的差異顯著性，對(duì)不同處理組進(jìn)行獨(dú)立樣本 χ_t 檢驗(yàn)。

表2試驗(yàn)所需引物序列

注：F.正向引物;R.反向引物；下劃線標(biāo)注部分為酶切位點(diǎn)的堿基序列

表3SpLAR基因的生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及軟件

統(tǒng)計(jì)顯著性水平設(shè)置為 Plt;0.05 。

2 結(jié)果與分析

2.1SpLAR基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆

根據(jù)前期完成的多根紫萍轉(zhuǎn)錄組信息，獲得 Sp LAR基因的全長(zhǎng)cDNA序列，NCBIORFFinder的分析結(jié)果顯示，該序列包含1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框（Openreadingframe，ORF），其長(zhǎng)度為 1059bp 。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增ORF區(qū)，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示獲得1條與預(yù)期大小一致的DNA片段（圖1）。回收純化目的條帶后，連接T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α ，陽(yáng)性克隆的測(cè)序結(jié)果顯示，該片段全長(zhǎng) 1 059bp ，編碼352個(gè)氨基酸（圖2）。

圖1以cDNA為模板的PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2SpLAR蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SpLAR蛋白具有352個(gè)氨基酸，組成中包含20種氨基酸。含量最高的氨基酸為丙氨酸（Ala），為 11.9% ；色氨酸 ）含量最低，僅為0.6% 。蛋白分子質(zhì)量為 38ku ，理論等電點(diǎn) （pI） 為5.43，分子式為 C₁₇₁₀H₂₆₈₅N₄₆₃O₅₀₄S₁₇ 。該蛋白的半衰期為 30h ，不穩(wěn)定指數(shù)為 42.82（gt;40） ，表明其為不穩(wěn)定蛋白。脂肪族指數(shù)為88.98，親水性平均值為-0.005，進(jìn)一步表明該蛋白為親水性蛋白。通過(guò)使用ProtScale軟件對(duì)其親水性和疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果表明在N端和C端均存在明顯的疏水峰，驗(yàn)證了其親水特性（圖3）。

圖3SpLAR蛋白的親水/疏水性預(yù)測(cè)

圖4SpLAR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（A）及三級(jí)結(jié)構(gòu)（B）預(yù)測(cè)

2.3SpLAR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA在線分析平臺(tái)對(duì)SpLAR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)開(kāi)展預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，其主要由 α- 螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲組成。其中， ∝ 螺旋的比例為38.64% ，延伸鏈占 14.20% ，無(wú)規(guī)卷曲占 47.16% （圖4A）。以無(wú)色花青素還原酶LAR（ID：A0A7I8KTQ5.1.A）為模板，預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，序列相似度為88.12% ，建?；诘?至第352位氨基酸，模型覆蓋度達(dá) 98% 。從預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中可以觀察到，SpLAR蛋白富含 α- 螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，這與其二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖4B）。

2.4SpLAR跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽預(yù)測(cè)

使用TMHMM2.0在線工具對(duì)SpLAR的氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，SpLAR蛋白含有1個(gè)跨膜區(qū)域，位于第13到第35位氨基酸之間（圖5A）。同時(shí)，通過(guò)SignalP4.0Server在線工具對(duì)SpLAR蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SpLAR蛋白不含信號(hào)肽，預(yù)測(cè)其包含信號(hào)肽的概率為0.189，而切割位點(diǎn)在第16位和第217位氨基酸序列的斷裂概率為0.172，但均未達(dá)到閾值0.5（圖5B）。

圖5SpLAR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域（A）及信號(hào)肽（B）預(yù)測(cè)

2.5SpLAR蛋白的保守功能域預(yù)測(cè)分析

利用NCBI的BLAST工具對(duì)SpLAR基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行保守功能域的查找，結(jié)果顯示，SpLAR蛋白歸屬于NADB_Rossmann超家族（圖6）。該蛋白包含1個(gè)保守的GATG基序，以及2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域RFLP和ICCN（圖7）。這些保守結(jié)構(gòu)域的存在表明SpLAR蛋白在生物學(xué)功能上可能與其他已知的NADB_Rossmann超家族成員具有相似的酶活性和功能，這暗示其在原花青素合成途徑中具有重要的作用。

2.6SpLAR氨基酸序列同源性比對(duì)

利用NCBI中的blastp工具，搜索多根紫萍 Sp LAR基因編碼的氨基酸同源序列，并借助DNAMAN軟件開(kāi)展多序列比對(duì)。結(jié)果表明，SpLAR蛋白與其他植物L(fēng)AR蛋白的氨基酸序列有較高的相似性（圖7）。這些LAR蛋白均具有1個(gè)保守的GATG基序（起始氨基酸為Gly，紅線標(biāo)記處），同時(shí)包含RFLP和ICCN2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（紅色方框處）。具體而言，SpLAR蛋白與美洲山核桃（Caryaillinoinensis）、胡桃（Juglansregia）歐榛（Corylusavellana）咖啡樹(shù)（Cof-feaeugenioides）和歐洲榿木（Alnusglutinosa）中對(duì)應(yīng)LAR蛋白的同源性分別為 60.12%，60.55%，62.80% 61.96% 和 63.30% 。此外，選取芋（MQM04442.1）、海棗（XP_008781017.1）、雷公藤（XP_038706457.1）等與SpLAR蛋白相似性較高的共17條氨基酸序列進(jìn)行分析。運(yùn)用MEGA11軟件，通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并將Bootstrap值設(shè)為 1 000 。結(jié)果表明，多根紫萍蛋白與天南星科植物芋（Colocasiaescu-lenta）聚為一支，表明二者在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近（圖8）。

圖6SpLAR蛋白保守域分析

2.7不同培養(yǎng)天數(shù)及營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下多根紫萍中SpLAR基因的表達(dá)量及原花青素含量

RT-qPCR結(jié)果顯示， SpLAR 基因的表達(dá)量隨多根紫萍生長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)，9d時(shí)， Sp 2LAR 基因達(dá)到表達(dá)峰值，營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下，該基因的表達(dá)量進(jìn)一步升高。含量測(cè)定結(jié)果表明，多根紫萍中原花青素的積累量與 SpLAR 基因的表達(dá)量呈正相關(guān)，在3～9d含量逐漸升高，9d時(shí)原花青素的積累量最高，顯著高于其他處理時(shí)間；Datko處理含量約為 20.6mg/g ，營(yíng)養(yǎng)脅迫處理則達(dá) 24.8mg/g ，營(yíng)養(yǎng)脅迫處理的原花青素積累量比Datko處理高16.9% ，二者之間差異顯著； 12d 時(shí)，Datko處理及營(yíng)養(yǎng)脅迫處理的原花青素含量均有所下降（圖9）。推測(cè)多根紫萍在從幼嫩到成熟期過(guò)渡的過(guò)程中能夠有效合成原花青素，但在后期衰老后可能出現(xiàn)代謝抑制或代謝流重新分配，從而導(dǎo)致其含量下降，

圖9不同培養(yǎng)時(shí)間及營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下多根紫萍中SpLAR基因的表達(dá)量及原花青素積累量

2.8pCAMBIA1301-SpLAR植物表達(dá)載體構(gòu)建

構(gòu)建pCAMBIA1301-SpLAR植物表達(dá)載體（圖10A），質(zhì)粒PCR結(jié)果顯示，在 1000bp 左右處出現(xiàn)條帶（圖10B），與SpLAR基因長(zhǎng)度一致，表明SpLAR已連接在pCAMBIA1301載體上。在 及NcoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，在13000 bp及 1000bp 左右出現(xiàn)目的條帶（圖10C），與線性pCAMBIA1301表達(dá)載體及 SpLAR 基因大小一致，進(jìn)一步表明SpLAR成功連接在pCAMBIA1301載體上；陽(yáng)性質(zhì)粒送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示序列正確。

3小結(jié)與討論

3.1SpLAR基因的克隆及生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)從原花青素的生物合成途徑人手，基于多根紫萍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挖掘出關(guān)鍵基因SpLAR，并結(jié)合RT-PCR技術(shù)成功克隆了該基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，SpLAR基因cDNA全長(zhǎng)為1 059bp ，編碼352個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為 38ku ，蛋白親水性較強(qiáng)且不穩(wěn)定，可能含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，但不含信號(hào)肽，歸屬于NADB_Rossmann超家族，Tanner等[25]及Chemler等[26]的研究表明，依賴(lài)于無(wú)色花青素還原酶催化生成縮合單寧的過(guò)程需要NAD（P）H的參與，這一發(fā)現(xiàn)支持了SpLAR基因在原花青素合成中發(fā)揮重要作用這一觀點(diǎn)。此外，SpLAR蛋白與其他植物的LAR蛋白具有較高的相似性，與天南星科植物芋（Colocasiaesculenta）的親緣關(guān)系最為密切，表明在同源關(guān)系較近的植物中，LAR蛋白展現(xiàn)出較強(qiáng)的保守性，為進(jìn)一步研究其功能提供了基礎(chǔ)。

A.pCAMBIA 1301-SpLAR 重組載體示意;B.重組植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-SpLAR的質(zhì)粒PCR驗(yàn)證;M.DL200Marker;1-4，6-9.SpLAR的質(zhì)粒PCR產(chǎn)物;5.陰性對(duì)照;C.重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證;M.DL15000Marker;1.pCAMBIA1301-SpLAR質(zhì)粒;2.pCAMBIA1301-SpLAR雙酶切結(jié)果

圖10pCAMBIA1301-SpLAR植物表達(dá)載體構(gòu)建與雙酶切驗(yàn)證

3.2SpLAR基因的表達(dá)量與原花青素積累量呈正 相關(guān)，且正響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫

本研究以多根紫萍為研究材料，利用RT-qPCR技術(shù)，探究不同培養(yǎng)天數(shù)及營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下SpLAR基因的表達(dá)情況與原花青素積累量之間的關(guān)系。結(jié)果表明，隨著多根紫萍的生長(zhǎng)， SpLAR 基因的表達(dá)量呈先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，且與原花青素積累量呈正相關(guān)。在9d時(shí) SpLAR 基因的表達(dá)量最高，此時(shí)，Datko處理的原花青素含量為 20.6mg/g ，營(yíng)養(yǎng)脅迫處理的原花青素含量則達(dá) 24.8mg/g ，營(yíng)養(yǎng)脅迫處理的原花青素積累量較Datko對(duì)照高 16.9% 。Bogs等[27發(fā)現(xiàn)葡萄在開(kāi)花早期， VvLAR 的表達(dá)顯著增加，隨著葡萄果實(shí)的成熟， VvLAR 的表達(dá)水平逐漸降低。這表明在植物不同生長(zhǎng)時(shí)期， LAR 基因的表達(dá)情況存在差異，推測(cè)不同培養(yǎng)天數(shù)及營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)原花青素含量的積累具有重要影響。利用浮萍生產(chǎn)淀粉及類(lèi)黃酮次生代謝產(chǎn)物的研究逐漸增多，營(yíng)養(yǎng)脅迫被認(rèn)為是增強(qiáng)浮萍初生及次生代謝產(chǎn)物積累的重要手段[28]，在營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下，浮萍通過(guò)調(diào)控類(lèi)黃酮合成的代謝通量，促進(jìn)了類(lèi)黃酮物質(zhì)的積累[29]。Ma等[30]發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，藍(lán)莓葉片中LAR 的表達(dá)上升，促進(jìn)了原花青素的合成。本研究結(jié)果也顯示，在3、6、9、12d時(shí)，營(yíng)養(yǎng)脅迫會(huì)增強(qiáng) Sp #LAR 基因的表達(dá)量及原花青素的積累量。從合成生物學(xué)的角度來(lái)看，營(yíng)養(yǎng)脅迫有望成為優(yōu)化多根紫萍中原花青素生物合成的有效策略，通過(guò)在不同培養(yǎng)天數(shù)下調(diào)控 SpLAR 基因的表達(dá)，可以進(jìn)一步增強(qiáng)多根紫萍中原花青素的積累。同時(shí)，鑒于多根紫萍的快速生長(zhǎng)和繁殖特性，這一策略可為藥用次生代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)提供新思路。本研究結(jié)果顯示，與Datko對(duì)照相比， SpLAR 基因的表達(dá)量及原花青素含量在營(yíng)養(yǎng)脅迫3～9d時(shí)表現(xiàn)出明顯差異，而到12d時(shí)，兩組之間的差異減小。這可能與植物衰老過(guò)程中代謝途徑調(diào)控能力的減弱有關(guān)[31]。

3.3植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-SpLAR的構(gòu)建

本研究采用同源重組技術(shù)，將SpLAR基因編碼序列插入pCAMBIA1301植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體。通過(guò)BstEⅡ和NcoI雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序分析，證實(shí)目的基因已正確插入載體，且閱讀框保持完整。該表達(dá)載體包含CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子及潮霉素抗性篩選標(biāo)記，為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。之后，將繼續(xù)探究SpLAR基因在原花青素生物合成途徑中的功能，構(gòu)建高效合成原花青素的工程化浮萍體系，探索浮萍作為底盤(pán)細(xì)胞用于原花青素生物合成的可行性及應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 丁艷紅）