Abstract：This paper optimizes the extraction process of blueberryanthocyanins，determines the anthocyanin content in different varietiesof blueberries from the Linshu region.By using the optimal process to extract and detect 12 blueberry samples fromtheLinshuregion，it finds through cluster analysis thatthe12 blueberrysamples could be divided into 5categories based on diferences inanthocyanin content，in which the Duke blueberry sample from Lanrun Family Farm has the highest total anthocyanin content.

Keywords：blueberries;anthocyanins; extraction; orthogonal design

0 引言

藍(lán)莓是杜鵑花科中的越橘屬生灌木，果實呈現(xiàn)藍(lán)紫色，果肉和滋味均獨(dú)具特色，營養(yǎng)含量豐富。藍(lán)莓果中花青素、綠原酸、黃酮素及維生素等生物活性成分含量豐富[。研究表明，藍(lán)莓是植物界中花青素含量尤為豐富的品種之一，其花青素含量峰值可達(dá)到 4200mg/kg^[2] 。藍(lán)莓所含的花青素以其卓越的性能和極低的副作用，在眾多植物花青素中脫穎而出，備受推崇[3]。科學(xué)研究揭示，藍(lán)莓中的花青素具備廣泛的健康促進(jìn)作用，包括但不限于出色的抗氧化性能、有效的血糖與血脂調(diào)節(jié)能力、顯著的腫瘤細(xì)胞生長抑制作用、對肝臟的保護(hù)效應(yīng)以及腸道菌群的平衡調(diào)節(jié)等。鑒于其豐富的藥理活性，藍(lán)莓花青素近年來已成為科研領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)[4-6。藍(lán)莓市場需求量逐年增加，該產(chǎn)業(yè)擁有廣闊的發(fā)展前景。盡管如此，藍(lán)莓鮮果的供應(yīng)仍難以滿足日益增長的需求，呈現(xiàn)出供不應(yīng)求的態(tài)勢7

自2005年起，臨述縣開始引進(jìn)并種植藍(lán)莓，至今已發(fā)展至超過2萬畝的種植規(guī)模8。臨述縣積極引進(jìn)并培育了藍(lán)豐、薄霧、綠寶石、奧尼爾公爵、萊格西等一系列藍(lán)莓新品種，涵蓋了早熟、中熟及晚熟品種，并依據(jù)當(dāng)?shù)貤l件，靈活采用大棚與露地兩種種植模式。得益于藍(lán)莓種植帶來的顯著經(jīng)濟(jì)效益與快速擴(kuò)大的種植規(guī)模，臨述縣已初步構(gòu)建起多個“一村一品”特色產(chǎn)業(yè)鎮(zhèn)村，其中大興鎮(zhèn)更是榮獲國家級“一村一品”示范鎮(zhèn)稱號，并發(fā)展了5個專注于藍(lán)莓種植的專業(yè)村[9]

鑒于臨述地區(qū)豐富的藍(lán)莓資源優(yōu)勢及其對促進(jìn)當(dāng)?shù)厮{(lán)莓產(chǎn)業(yè)升級的重要性，深入開發(fā)和有效利用藍(lán)莓花青素顯得尤為關(guān)鍵。本研究通過運(yùn)用正交實驗設(shè)計，優(yōu)化了超聲輔助提取藍(lán)莓中花青素的技術(shù)方法。在此基礎(chǔ)上，針對臨述縣大興鎮(zhèn)的5個產(chǎn)地共12份藍(lán)莓樣本，進(jìn)行了花青素的精確量化與分析。這一工作不僅為相關(guān)企業(yè)及研究機(jī)構(gòu)提供了花青素質(zhì)量控制的科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步拓展花青素的應(yīng)用市場奠定了堅實基礎(chǔ)，有助于推動藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)鏈的延伸與價值提升。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

12份藍(lán)莓樣品采自臨述地區(qū)5個不同產(chǎn)地，分屬8個品種。其中，1份采自臨述縣順澤農(nóng)場，編號為A1；1份采自臨沐縣瑩輝果蔬種植農(nóng)場，編號為B1；4份采自臨述縣花滿田種植專業(yè)合作社，編號為C1～C4；5份采自臨述縣聚輝種植專業(yè)合作社，編號為D1～D5；1份采自藍(lán)潤家庭農(nóng)場，編號為E1。所有采摘藍(lán)莓均為成熟果實。按照試驗設(shè)計，各樣品詳細(xì)信息見表1。

本試驗采用的花青素標(biāo)準(zhǔn)品（矮牽牛色素、矢車菊色素、飛燕草色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素）均來自ChromaDex公司。實驗中所用的甲醇（色譜純）與乙腈（色譜純）均購自美國天地公司。此外，無水乙醇（分析純）、HC1（分析純）及甲酸（分析純）由國藥集團(tuán)提供。試驗過程中使用的水為一級純凈水，由優(yōu)普系列超純水機(jī)處理得到。

表1不同產(chǎn)地藍(lán)莓樣品

1.2主要設(shè)備

Aglient1260高效液相色譜儀（配VWD檢測器），美國安捷倫公司；多管渦旋混合器，山東青云實驗耗材有限公司；電子天平（精度 0.001g ），上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；康士潔超聲波清洗機(jī)（HX-10），武漢恒信世紀(jì)科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；優(yōu)普純水/超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1樣品前處理

采用四分法分取藍(lán)莓樣品約 200g ，置于勻漿機(jī)中勻漿，收集后放置在具塞廣口瓶中密封避光保存。

1.3.2花青素的提取

慈美琳等研究的結(jié)果，優(yōu)化了試驗條件，選取了料液比、超聲時間、超聲溫度及沸水浴時間這4個關(guān)鍵因素，并采用了L9（ 3×4） 正交表來設(shè)計一項四因素三水平的正交優(yōu)化試驗，旨在探索藍(lán)莓中花青素的最佳提取工藝。正交實驗設(shè)計見表2。

表2正交實驗設(shè)計

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱量了飛燕草色素等6種花青素標(biāo)準(zhǔn)品，每種均為 5mg ，然后分別溶解在 10mL 的容量瓶中，使用甲醇進(jìn)行溶解并定容，制備出質(zhì)量濃度為500.0μg /mL的儲備液。從每種儲備液中分別移取40，100，200，400，800，μL 至各自的 10mL 容量瓶中，再次用甲醇定容，以此配制出5個系列的質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、40，80，μg/mL ，以備后續(xù)使用。隨后，在預(yù)設(shè)的色譜條件下，利用高效液相色譜法（HPLC）對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。通過測定得到的峰面積與對應(yīng)濃度之間的關(guān)系，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)一步計算出線性回歸方程。

表3梯度洗脫程序

1.3.4液相色譜條件與樣品測定

1.3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗采用的色譜柱為ZORBAXSB-C18（由美國安捷倫公司提供，規(guī)格為 250mm×4.6mm×5μm） 。試驗設(shè)置了2種流動相：流動相A為含有 1% 甲酸的水溶液，流動相B則為含有 1% 甲酸的乙腈。流動相的流速被設(shè)定為 1mL/min ，每次進(jìn)樣的體積為 20μL 色譜柱的工作溫度維持在 35^°C ，紫外檢測器的檢測波長則設(shè)定在 530nm_? 。梯度洗脫程序如表3所示?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液和樣品制備溶液分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行分離和測定，以峰面積和對應(yīng)濃度做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量。

試驗所得數(shù)據(jù)均為3次平行試驗結(jié)果的平均值，使用Excel2016、SPSS24.0及Origin2019三款軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以花青素標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫軸，儀器測得的峰面積為縱軸，繪制得到的工作曲線詳見表4。6種花青素單體色譜圖如圖1所示。由表4和圖1可知，6種花青素單體的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，在測定范圍內(nèi)可以滿足檢測需要。實驗數(shù)據(jù)具有良好的線性關(guān)系。

表46種花青素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

圖16種花青素單體色譜圖

注：1-飛燕草色素；2-矮牽牛色素；3-矢車菊色素；4-天竺葵色素；5-錦葵色素；6-芍藥素

2.2花青素的提取正交結(jié)果

在單試驗的基礎(chǔ)上，選取料液比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度 （C） 、沸水浴時間 （D） 為考察因素，花青素總量 （Y） 為評價指標(biāo)進(jìn)行L （9×34） 正交試驗，正交試驗結(jié)果見表5。根據(jù)表5中的極差分析結(jié)果，可以得出影響藍(lán)莓中花青素提取效率的因素主次順序為：超聲時間 （B）gt; 料液比 （A）gt; 超聲溫度 （C）gt; 沸水浴時間 （D） 。而最佳的提取條件組合為A1B3C3D3，具體即料液比為1：25、超聲時間為40min、超聲溫度為 45°C 、沸水浴時間為 90min. 。此最佳提取組合與表5中試驗3號各因素組合結(jié)果一致。采用優(yōu)化出的最佳提取條件A1B3C3D3進(jìn)行3次平行試驗驗證，花青素總量分別為4755.29、4738.91、4768.85mg/kg ，平均為 4754.35mg/kg

2.3不同藍(lán)莓樣品中花青素含量的測定

采集臨述地區(qū)5個不同產(chǎn)地8個不同品種的藍(lán)莓，使用優(yōu)化的高效液相色譜法測定藍(lán)莓中花青素含量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，臨述縣不同藍(lán)莓產(chǎn)地和不同藍(lán)莓品種中，藍(lán)莓花青素的總量及單體花青素含量存在顯著差異，花青素總量范圍為 291.92～2516.52mg/ kg，含量最高的為E1號樣品，采自藍(lán)潤家庭農(nóng)場的公爵藍(lán)莓樣品。所有樣品均未檢出天竺葵色素，而芍藥素僅在B1號樣品，被檢出其值為 444.27mg/kg 采自臨沭縣瑩輝果蔬種植農(nóng)場的綠寶石藍(lán)莓樣品。

圖212種藍(lán)莓樣品花青素含量對比圖

同時，由圖2可知，所有樣品中，A1號樣品較特殊，矮牽牛色素和芍藥素均未檢出，而其他樣品中，飛燕草色素的含量均高于其他花青素單體（包括矢車菊色素、矮牽牛色素和錦葵色素）。其中，飛燕草色素含量最高的為C4號樣品，達(dá)到了 1389.85mg/kg 采自臨沭縣花滿田種植專業(yè)合作社的萊克西藍(lán)莓樣品。以上差異可能與各藍(lán)莓產(chǎn)地的栽培條件和品種密切相關(guān)。

2.4不同藍(lán)莓樣品中花青素聚類分析

以花青素含量為指標(biāo)，采用系統(tǒng)聚類分析法[0]對12種樣品進(jìn)行聚類分析，得到結(jié)果如圖3所示。

從圖3中發(fā)現(xiàn)，聚類分析結(jié)果與樣品中花青素總量分布有相似趨勢，12種藍(lán)莓樣品中花青素的分布可大致可分為5類：（1）A1，（2）B1，（3）C1、C3、C4、D1、E1，（4）C2、D4，（5）D2、D3、D5。不同藍(lán)莓樣品中花青素的聚類分析，有利于對藍(lán)莓中可能含花青素樣品的了解，為企業(yè)選料。原料溯源等提供技術(shù)支持。

表5正交試驗結(jié)果

圖312種藍(lán)莓樣品系統(tǒng)聚類分析后譜系圖

3結(jié)論

本試驗以臨沐地區(qū)藍(lán)莓為試驗原料，用單因素和正交試驗優(yōu)化了藍(lán)莓中花青素超聲輔助提取方法。得到花青素的最佳提取工藝為料液比1/25、超聲時間 40min. 、超聲溫度 45% 、沸水浴時間 90min 。在此工藝條件下，對臨沐地區(qū)12種藍(lán)莓樣品進(jìn)行花青素提取和測定發(fā)現(xiàn)：藍(lán)潤家庭農(nóng)場的公爵藍(lán)莓樣品花青素總量最高；臨沐縣聚輝種植專業(yè)合作社的薄霧藍(lán)莓、茶花藍(lán)莓、藍(lán)豐花青素總量相似；臨沭縣聚輝種植專業(yè)合作社的蘇斯蘭藍(lán)莓和臨沭縣花滿田種植專業(yè)合作社的藍(lán)豐藍(lán)莓花青素總量相近；臨沭縣花滿田種植專業(yè)合作社的萊克西藍(lán)莓、薄霧藍(lán)莓、萊克西藍(lán)莓與臨沭縣聚輝種植專業(yè)合作社的萊克西藍(lán)莓、藍(lán)潤家庭農(nóng)場的公爵藍(lán)莓，其花青素總量類似；而臨沐縣順澤農(nóng)場的卡米爾藍(lán)莓、臨沐縣瑩輝果蔬種植農(nóng)場的綠寶石藍(lán)莓與其他藍(lán)莓樣品的花青素總量差別較大。導(dǎo)致臨沭地區(qū)12種藍(lán)莓花青素含量差別的主要原因可能是其栽培條件的差異。本研究為臨述地區(qū)藍(lán)莓花青素的提取及其開發(fā)利用提供了有價值的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：袁文靜）