大豆孢囊線蟲（Heteroderaglycines）隸屬于線蟲門（Nematode），異皮科（Heteroeridae），異皮屬（Heterodera）[]，主要危害豆科植物。該線蟲寄生于寄主植物根部，通過口針穿刺及食道腺分泌物破壞寄主細(xì)胞和組織，造成嚴(yán)重減產(chǎn)，從而影響大豆產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。目前，大豆孢囊線蟲病已遍布世界各個(gè)國家的大豆主產(chǎn)地。一般情況下造成大豆減產(chǎn) 10%～30% ，危害嚴(yán)重時(shí)高達(dá) 70%～ 90% ，甚至造成絕產(chǎn)[2]

大豆孢囊線蟲最早于1915年在日本發(fā)現(xiàn)[3]。美國作為大豆主產(chǎn)國，其產(chǎn)量約占世界大豆總產(chǎn)量的 1/3 。在美國，孢囊線蟲為最重要的大豆病害，每年造成約15億美元的產(chǎn)量損失[4。在大豆第一大生產(chǎn)國巴西，自1922年報(bào)道該病害發(fā)生以來，迅速擴(kuò)展蔓延，大豆主產(chǎn)區(qū)幾乎都有孢囊線蟲發(fā)生，且病情逐年加重[5]。在中國，每年因大豆孢囊線蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)6億元，近年來，該病害呈現(xiàn)出不斷擴(kuò)散的態(tài)勢。貴州、甘肅、江西以及寧夏等20多個(gè)省市地區(qū)也相繼報(bào)道發(fā)生該病害[7-8]。據(jù)報(bào)道，黑龍江省大豆孢囊線蟲檢出率高達(dá) 100% ，淮海地區(qū)超過 50% ，貴州局部地區(qū)在 40% 以上[9-11]。黑龍江省北部黑河地區(qū)大豆孢囊線蟲侵染寄主大豆根部造成減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)[12]。因此，對(duì)于該病害的高效防控一直備受關(guān)注。

目前，國內(nèi)外對(duì)于大豆孢囊線蟲的防治措施主要包括農(nóng)業(yè)防治、種植抗病品種、生物防治和化學(xué)防治等，其中化學(xué)防治仍然是主要措施。自從熏蒸型殺線劑禁用之后，市場上出現(xiàn)了具有觸殺、內(nèi)吸和胃毒等作用方式的殺線劑，如噻唑麟[13]、氟吡菌酰胺[14]等。雖然這些藥劑一定程度上能夠達(dá)到防控的目的，但由于價(jià)格和劑型等原因，并未被廣泛的關(guān)注和使用，導(dǎo)致中國的線蟲病害，尤其是孢囊線蟲病的防治藥劑嚴(yán)重缺乏。因此，開發(fā)低毒高效的新型殺線劑已迫在眉睫。

二硫氰基甲烷（Methylenebisthiocyanate，MBT）又稱亞二甲基二硫代氰酸酯，是一種難溶于水、易溶于有機(jī)溶劑的硫氰化合物，因其具有殺菌譜廣，環(huán)境污染小和殘留低等特性，已被廣泛應(yīng)用于病原菌以及線蟲的防治等方面[15-18]。2017年崔江寬等[19報(bào)道，該藥劑與其他藥劑聯(lián)合使用可有效防治小麥孢囊線蟲。祁之秋等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)MBT能夠引起根結(jié)線蟲呼吸作用下降和體液滲漏，其對(duì)根結(jié)線蟲病起到良好的防治效果。目前，MBT對(duì)大豆孢囊線蟲作用機(jī)理的研究較少，其是否可通過作用于線蟲代謝的主要酶類而發(fā)揮殺線功能，尚缺乏研究。

本試驗(yàn)擬通過MBT對(duì)大豆孢囊線蟲活動(dòng)行為等生理活性，以及對(duì)線蟲蛋白質(zhì)代謝和體內(nèi)重要酶活性的影響，揭示MBT對(duì)大豆孢囊線蟲主要的作用方式，為該藥劑的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)，也為孢囊線蟲病的有效控制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試線蟲采集病土在室內(nèi)大量繁殖大豆孢囊線蟲（Heteroderaglycines），采用漂浮分離法收集孢囊，消毒后保存于 4^°C 冰箱，備用。1.1.2供試大豆供試大豆品種為‘東農(nóng) Γ₆₉₀， .由植物保護(hù)學(xué)院植物線蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3供試藥劑 98% MBT原藥（上海利鳴化工有限公司）， 0.5% MBT種衣劑，由甘肅省農(nóng)科院植保所提供。以甲醇作為溶劑，將其配置成10 000mg/L 的母液，根據(jù)試驗(yàn)需要配制成所需系列濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1大豆孢囊線蟲卵懸浮液、二齡幼蟲懸浮液和根浸出液制備卵懸浮液制備：挑取大小相近、飽滿的褐色孢囊置于200目的網(wǎng)篩中，將網(wǎng)篩放置于 35mm 的培養(yǎng)皿中，用 1% NaClO溶液消毒 3min ，滅菌水沖洗 3～5 次。采用200目和500目的套篩收集孢囊，用自制研磨塞充分研磨后，無菌水沖洗數(shù)次，收集卵懸浮液，調(diào)整其濃度為100粒/ imL，4^°C 保存，備用。

二齡幼蟲懸浮液制備：將消毒的孢囊置于滅菌的培養(yǎng)皿中孵化，以滅菌水為孵化液，使水稍漫過孢囊為宜。 25°C 培養(yǎng)箱黑暗條件下進(jìn)行孵化，4d后開始收集二齡幼蟲，根據(jù)試驗(yàn)需要調(diào)整二齡幼蟲懸浮液濃度。

根浸出液制備：選擇籽粒孢囊的大豆種子，用3% NaClO溶液消毒 3min 后，溫室中用無菌土栽培，出苗21d后沖洗根部，將其放入無菌水中浸泡 24h 后，收集根浸出液。

1.2.2大豆孢囊線蟲處理方法采用浸漬法處理線蟲，吸取 1mL MBT藥液和 100μL 的大豆孢囊線蟲懸浮液（約1000條），使得藥劑最終濃度為 0.625，1，25，2，5，5，mg/L 。試驗(yàn)以無菌水處理作為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，在 25°C 培養(yǎng)箱中處理 3，6，12，24，48h 0

1.2.3大豆孢囊線蟲組織勻漿液的制備線蟲經(jīng)MBT處理不同時(shí)間后， 4000r/min 離心4min ，無菌水反復(fù)沖洗沉淀，并再次離心（4000r/min，4min）3 次。以低溫預(yù)冷的 0.86% 生理鹽水為勻漿介質(zhì)，在冰上勻漿， 4^°C 離心（4000r/min，10min） 取上清液，得到 10% 的組織勻漿液。

1.2.4MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲毒殺作用的顯微觀察吸取 1mL 的二齡幼蟲懸浮液（約50條），加人 1mL 藥液使其濃度為 1.25mg/L 。處理線蟲 12，24，48，72，96h 后，隨機(jī)選取10條，在顯微鏡下觀察其中毒后形態(tài)變化，并拍照記錄。每處理重復(fù)3次，無菌水作為對(duì)照。

1.2.5MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲運(yùn)動(dòng)行為的影響在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入新鮮活躍的二齡幼蟲各50條，加入濃度為 1.25.2.5.5mg/L 的MBT稀釋液 1mL ，處理 1.6，12.24h 后，每個(gè)處理隨機(jī)選擇10條線蟲，在體視顯微鏡下觀察1min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況。以無菌水作為對(duì)照，重復(fù)3次，參考Tsalik等[22]的方法，按照每分鐘擺動(dòng)的次數(shù)記錄線蟲頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率。

1.2.6MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲趨性的影響采用細(xì)胞培養(yǎng)板法，經(jīng)MBT不同濃度處理線蟲后觀察其對(duì)根尖的趨性。趨性參照Wang等[23]的方法，在 4^°C 下將PluronicF-127（丙二醇嵌段聚醚F-127）粉末 23g 于 100mL 無菌水中溶解 24h ，配置成 23% （W/V）PluronicF-127膠體 （pH 7. 0） 。待其全部溶解后加入經(jīng)MBT處理后的線蟲，調(diào)整其濃度為200條/ mL 膠體。將生長7d生長勢相近的大豆幼苗，剪取根 1cm 根尖，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔放人1段根尖，加入含處理線蟲的膠體 1mL，24h 后，顯微鏡下觀察線蟲活動(dòng)行為和大豆根尖對(duì)線蟲的吸引能力。

參照錢洪利等[24]的方法，取滅菌培養(yǎng)皿（直徑為 9cm ，如圖1所示），以皿底中央為圓心，劃直徑為 0.5cm 區(qū)域，培養(yǎng)皿內(nèi)倒WA培養(yǎng)基待其凝固后，滴加 20μL 新鮮的二齡幼蟲懸浮液（約100條）。此區(qū)域外劃定3個(gè)不同區(qū)域，各區(qū)域之間間隔 1cm，3 個(gè)區(qū)間外放置蘸有不同濃度MBT藥液的濾紙片（半徑 0.5cm ）， 24h 后檢測二齡幼蟲在不同區(qū)域的分布情況并計(jì)數(shù)。計(jì)算二齡幼蟲的分布率。重復(fù)3次，以無菌水和大豆根浸出液為空白對(duì)照。

線蟲分布率 各區(qū)域分布線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù) ×100%

圖1WA平板檢測二齡幼蟲趨性區(qū)域示意圖

Fig.1Diagram for testing attraction of second-stage juvenilesof SCN onWA plate

1.2.7MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲蛋白質(zhì)含量的影響采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（索萊寶試劑有限公司生產(chǎn)），將不同時(shí)間處理后線蟲勻漿液樣品分別加人 20μL 至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并加入 200μL 的BCA工作液， ，用酶標(biāo)儀測定 562nm 處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。每處理重復(fù)3次，無菌水處理作為對(duì)照。

1.2.8MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響乙酰膽堿酯酶（AChE）活性測定采用索萊寶試劑有限公司所生產(chǎn)的乙酰膽堿酯酶（AChE）活性檢測試劑盒，按照說明書要求進(jìn)行測定。

1.2.9MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響采用索萊寶試劑有限公司所生產(chǎn)的過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性檢測試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（WST-1法），測定CAT、GST和SOD等的活性。

1.2.10MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲室內(nèi)防效及對(duì)大豆生長的影響選擇田園土和細(xì)沙，121^°C 高溫滅菌 ^2h ，土和沙子體積比為 2：1 混勻，裝入口徑 9cm 、高 11cm 的塑料盆中，每盆加人 200g 滅菌沙土。大豆播種7d后移栽幼苗備用。盆栽試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理：接種卵懸浮液后分別加入濃度為 0.625，1.25，2.5，5，mg/L MBT藥液和 0.5% MBT種衣劑包衣種子，單獨(dú)接種卵懸浮液、無菌水作為空白對(duì)照。每盆施人MBT藥液 50mL ，孢囊線蟲卵接種量為每盆3000粒卵。接種35d后，清洗根系土壤，統(tǒng)計(jì)根系二齡幼蟲和孢囊數(shù)量，并測定大豆株高、地上和根系鮮質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS22.0和Excel2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，根據(jù)Duncan’s新復(fù)極差法比較所得數(shù)據(jù)差異顯著性（ ?Plt;0.05 。

2 結(jié)果與分析

2.1MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲毒殺作用顯微觀察

經(jīng)觀察 1.25mg/L 的MBT藥液不同處理時(shí)間二齡幼蟲的形態(tài)變化，結(jié)果如圖2所示。MBT處理 12h 后，二齡幼蟲的形態(tài)與對(duì)照并無明顯差異，但運(yùn)動(dòng)減緩。處理 24～48h ，大部分線蟲僵直不動(dòng)或呈新月形僵死，少部分線蟲運(yùn)動(dòng)速度遲緩，但體壁及腸道正常。處理 72～96h 時(shí)，線蟲體壁變得透明， 96h 時(shí)線蟲全部死亡，個(gè)別線蟲蟲體體壁分離，腸道組織出現(xiàn)不同程度縊縮現(xiàn)象。對(duì)照組線蟲蟲體正常，呈“S\"形彎曲，內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)容物分布均勻，運(yùn)動(dòng)呈活躍狀態(tài)。

2.2MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲運(yùn)動(dòng)行為的影響

圖3和圖4表明，MBT對(duì)二齡幼蟲的運(yùn)動(dòng)行為有明顯抑制作用。與對(duì)照相比，MBT處理后，頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率顯著降低。隨MBT濃度增大和處理時(shí)間延長，二齡幼蟲頭部擺動(dòng)和身體彎曲頻率降低更加顯著。處理 12h 后，線蟲頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率下降幅度最為明顯。與對(duì)照相比， 5mg/L MBT處理線蟲 12h 后，頭部擺動(dòng)頻率與身體彎曲頻率分別下降了72.22% 和 71.30% ，具有顯著性差異。

2.3MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲趨性的影響

處理 24h 后，觀察根尖對(duì)線蟲的吸引能力。如圖5顯示，隨著時(shí)間的延長，對(duì)照組中二齡幼蟲不斷向根尖附近聚集，而各濃度MBT處理中，根尖附近均未發(fā)現(xiàn)線蟲活動(dòng)差異顯著。表明MBT可能影響線蟲的感覺器官或影響線蟲的運(yùn)動(dòng)能力，導(dǎo)致線蟲無法向寄主根部移動(dòng)。

圖2MBT處理后大豆孢囊線蟲二齡幼蟲的形態(tài)變化

Fig.2Morphological changes in second-stage juveniles of Heterodera glycinestreated with MBT

濾紙片法顯示，不同濃度MBT處理 24h 后，二齡幼蟲在WA培養(yǎng)基上的分布與無菌水、根浸出液處理差異顯著，結(jié)果見表1。在距藥劑濾紙片 0～1cm 區(qū)間，隨著藥劑濃度的升高，二齡幼蟲分布逐漸降低。 5mg/L 時(shí)的分布率最低，為4.33% 。在 0～2cm 區(qū)間，不同濃度處理的分布率始終低于對(duì)照組的無菌水。3個(gè)區(qū)間內(nèi)藥劑處理后二齡幼蟲分布率與無菌水、根浸出液處理有顯著差異，根浸出液處理的二齡幼蟲分布率為37.66% ，顯著高于無菌水對(duì)照 （19.67%） ，而在2～3cm 區(qū)間分布率下降，表明二齡幼蟲對(duì)根浸出液有一定的趨向性。

圖4MBT對(duì)二齡幼蟲頭部擺動(dòng)頻率的影響

Fig.4Effect of MBT on the head swing frequency of thesecond-stage juveniles

2.4MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲蛋白質(zhì)代謝的影響

與對(duì)照相比，不同濃度的MBT處理 3～48 h，大豆孢囊線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢，與對(duì)照均差異顯著。由圖6可知MBT處理 ^12h 時(shí)，高濃度 （5mg/L） 處理組的蛋白質(zhì)含量隨著時(shí)間的推移下降最為明顯，低濃度 （0.625mg/L） 處理組線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量在 ^12h 前下降幅度較小，但與對(duì)照之間仍差異顯著。處理 24h 時(shí)，對(duì)照與處理組線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量均有所下降，濃度為 5mg/L 處理組從最初的 0. 263 9mg/mL 下降至 0.2282mg/mL ，降幅為 13.53% 。 ^48h 時(shí)，MBT不同處理組間已無明顯差異（0.625mg/L 除外）。結(jié)果說明MBT處理大豆孢囊線蟲影響體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝平衡，造成蛋白質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而影響線蟲正常的生命活動(dòng)。

圖5MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲根尖趨性的影響

圖6二硫氰基甲烷對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲蛋白質(zhì)含量的影響

Fig.6EffectofMBTonproteincontentof second-stagejuveniles ofH.glycines

2.5MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響

與對(duì)照相比，MBT處理后，線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性受到抑制，這與與線蟲活動(dòng)頻率呈現(xiàn)的變化動(dòng)態(tài)一致（圖7）。同一處理時(shí)間下，隨著MBT處理濃度的增加，線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性明顯降低。處理 3h 時(shí)，低濃度（0.625mg/L） 處理組和對(duì)照組間AChE活性無差異，而高濃度 （2.5mg/L.5mg/L） 處理組AChE活性明顯降低。但在處理 ⁶h 時(shí)，低濃度（0，625mg/L） 處理與對(duì)照組AChE活性具有明顯差異。

圖7MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲 乙酰膽堿酯酶活性的影響 Fig.7Effect of MBT on AChE activity of second-stagejuvenilesofH.glycines

2.6MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

經(jīng)MBT處理后，大豆孢囊線蟲體內(nèi)CAT活性呈下降趨勢（圖8）。在處理后 3～12h ，線蟲體內(nèi)CAT活性隨著處理時(shí)間的延長不斷下降，酶活性為 60.87～87.25U/mg ，明顯低于對(duì)照。在12～24h 時(shí)下降幅度最大，與 6h 時(shí)相比， 12h 時(shí)0.625mg/L 和 1.25mg/L MBT處理的CAT活性下降了約 50% 。處理 24h 后，各處理與對(duì)照差異明顯，但各處理間差異不明顯， ^48h 時(shí)，低濃度處理組和對(duì)照水平無明顯差異。

圖8MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲過氧化氫酶活性的影響

Fig.8Effect of MBT on CAT activity of second-stage juveniles of H . glycines

經(jīng)MBT處理后，大豆孢囊線蟲體內(nèi)GST活性整體呈下降趨勢（圖9）。在處理后 3～6h ，低濃度 （0.625mg/L） 線蟲體內(nèi)GST活性下降幅度最大，明顯低于對(duì)照組。處理后 12～24h ，各組GST活性隨著處理時(shí)間的延長不斷下降， 24h 時(shí)各處理活性達(dá)到最低。 ^48h 后，處理組與對(duì)照之間仍有差異。

經(jīng)MBT處理后，大豆孢囊線蟲體內(nèi)SOD活性變化整體呈下降趨勢（圖10）。處理 3h 時(shí)，線蟲體內(nèi)SOD活性隨著MBT處理濃度的升高而下降，處理組與對(duì)照組之間差異明顯。處理后6～24h ，處理組與對(duì)照組呈下降趨勢 24h 時(shí)各處理活性達(dá)到最低。 ^48h 后，各處理組SOD活性均低于對(duì)照。

圖9MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響

Fig.9Effect of MBT on GST activity of second-stagejuvenilesof H .glycines

圖10MBT對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲超氧化物歧化酶活性的影響

Fig.10Effect of MBT on SOD activity ofsecond-stage juvenilesofH.glycines

2.7MBT種子包衣對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲室 內(nèi)防效

MBT處理后35d結(jié)果表明，不同濃度MBT原藥及 0.5% MBT種衣劑對(duì)大豆孢囊線蟲均有一定的防治效果。濃度越高，對(duì)孢囊及二齡幼蟲的防效越強(qiáng)，其中 5mg/L MBT的效果最好，對(duì)孢囊和二齡幼蟲的防效分別為63. 86% 和58.58% ，其次是 0.5% 種衣劑，對(duì)孢囊和二齡幼蟲防效分別為 63.18% 和 60.21% ，而0.625mg/L MBT的效果最低（表2）。

表2MBT種子包衣對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲病的室內(nèi)防效""）

2.8MBT種子包衣對(duì)大豆生長發(fā)育的影響

MBT藥液處理后對(duì)大豆的生長未產(chǎn)生影響，且一定程度上能夠促進(jìn)其生長發(fā)育（表3）。株高為 26.33～27.68cm ，與空白對(duì)照（ 26. 00cm 無明顯差異。與接種對(duì)照相比，不同濃度的MBT處理后，總鮮質(zhì)量均有增加，增加率為 0.38% ～10.48% 。 0.5% MBT種衣劑處理后株高與空白對(duì)照相比有所降低，但與接種對(duì)照相比，總鮮質(zhì)量明顯增加，增加率為 8.56% 。

表3MBT種子包衣對(duì)大豆生長發(fā)育的影響

Table 3 Effect of MBT seed coating on soybean growth

3討論

運(yùn)動(dòng)行為是反映線蟲神經(jīng)系統(tǒng)完整性的重要指標(biāo)，線蟲的運(yùn)動(dòng)受到多種神經(jīng)元及其相互間的神經(jīng)傳導(dǎo)所控制[25]。本研究測定了MBT對(duì)大豆孢囊線蟲蟲體中毒變化、運(yùn)動(dòng)行為及趨性的影響，結(jié)果表明，MBT對(duì)二齡幼蟲具有毒殺作用，隨著處理時(shí)間的延長，線蟲蟲體運(yùn)動(dòng)減緩、僵直，并逐漸死亡。說明MBT能夠穿透蟲體，影響線蟲生理生化的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致線蟲死亡。頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率常作為線蟲運(yùn)動(dòng)行為的重要指標(biāo)[26]。馬娜娜等[27]研究發(fā)現(xiàn)硫柳汞對(duì)秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）神經(jīng)行為有抑制作用，通過損害線蟲的多巴胺等運(yùn)動(dòng)神經(jīng)遞質(zhì)，從而影響線蟲的運(yùn)動(dòng)能力。盧偉偉等[28]發(fā)現(xiàn)氯化甲基汞降低秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)能力，隨著處理濃度的增高，線蟲基本運(yùn)動(dòng)能力呈減弱趨勢。二者研究報(bào)道與本研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)MBT可引起線蟲頭部擺動(dòng)和身體彎曲頻率整體呈下降趨勢，處理 12h 后下降最為明顯，說明MBT能夠抑制線蟲運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)，從而影響線蟲的活動(dòng)能力，進(jìn)而起到毒殺作用。低濃度壬基酚能夠刺激秀麗隱桿線蟲神經(jīng)系統(tǒng)的活躍，從而表現(xiàn)為興奮效應(yīng)[29]。本研究中，低濃度MBT對(duì)線蟲頭部擺動(dòng)和身體彎曲頻率并不明顯。

目前，關(guān)于線蟲行為學(xué)的研究主要集中在攝食行為、寄主植物對(duì)線蟲的吸引、感覺器官的超微結(jié)構(gòu)及線蟲性引誘物質(zhì)等4個(gè)領(lǐng)域[30-32]。張永娣等[16]發(fā)現(xiàn) 1.5% 二硫氰基甲烷WP3000倍液灌根處理瓜萎后，對(duì)根結(jié)線蟲較好的防治效果。研究表明，模式線蟲秀麗隱桿線蟲對(duì)化學(xué)物質(zhì)表現(xiàn)出不同的趨性，具體表現(xiàn)為逃避、趨向性及整體運(yùn)動(dòng)性的改變等，其受到12種化學(xué)感應(yīng)神經(jīng)元的控制[33]。本研究利用Pluronic F-127膠體觀察，高濃度和低濃度藥劑處理線蟲后根尖對(duì)其無吸引力，與對(duì)照之間差異顯著。其可能是MBT損傷了大豆孢囊線蟲化學(xué)感應(yīng)神經(jīng)元，導(dǎo)致其與根尖之間的親和力減弱。濾紙片法同樣也顯示MBT對(duì)二齡幼蟲具有趨避性，降低了線蟲對(duì)根系的寄生作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著MBT處理濃度和時(shí)間的延長，二齡幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量呈降低趨勢，且各藥劑處理之間均低于對(duì)照水平。表明該藥劑可抑制線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)正常的代謝機(jī)制，導(dǎo)致線蟲最終死亡。劉丹丹[34]研究發(fā)現(xiàn)，酸類化合物處理南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）、大豆孢囊線蟲、甘薯莖線蟲（Ditylenchusdestructor）3種線蟲后，體內(nèi)蛋白質(zhì)含量與乙酰膽堿酯酶活性均呈降低趨勢，而對(duì)照組線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量無顯著變化，研究結(jié)果與本研究一致。MBT處理線蟲后，體內(nèi)AChE活性顯著被抑制，高濃度下酶活性與低濃度差異顯著。表明MBT抑制了乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)無法正常降解，阻斷神經(jīng)信號(hào)的傳遞，線蟲無法正常運(yùn)動(dòng)和攝食，最終線蟲被毒殺致死。自然界中，昆蟲受到逆境或脅迫等不利因素影響時(shí)，體內(nèi)會(huì)發(fā)生抗逆反應(yīng)，其代謝機(jī)制是抗逆反應(yīng)中的一種，在昆蟲維持正常的生命活動(dòng)中起重要作用[35]。CAT、SOD是生物體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分，在生物體內(nèi)清除氧自由基起重要作用，GST是一種多功能的超家族解毒酶系，廣泛分布于植物、動(dòng)物及微生物中[36]。因此，檢測線蟲體內(nèi)CAT、SOD和GST活性可間接反映氧自由基水平以及在抗逆過程中的作用3。本研究通過測定MBT對(duì)大豆孢囊線蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響，結(jié)果表明，藥劑處理二齡幼蟲后，體內(nèi)CAT和SOD酶活性降低，表明線蟲體內(nèi)存在的氧自由基超過蟲體本身所能承受的范圍，而保護(hù)酶活性被抑制，體內(nèi)氧化和抗氧化作用達(dá)不到平衡，導(dǎo)致細(xì)胞功能被破壞，引起線蟲死亡。而GST活性在 3～24h 呈現(xiàn)下降趨勢，^48h 時(shí)比前一時(shí)間段有上升趨勢，由此可推測MBT急性處理線蟲 24h 后，部分存活線蟲可能產(chǎn)生了輕微抗性，能夠發(fā)揮GST的作用。

大豆孢囊線蟲因具有堅(jiān)硬的孢囊殼的保護(hù)，防治極其困難，化學(xué)種衣劑不僅操作簡單方便，而且不易污染環(huán)境，對(duì)大豆生長安全，生產(chǎn)上易于推廣。本研究結(jié)果表明，隨著MBT處理濃度的增加，防治效果增強(qiáng)，其中種衣劑的防治效果更好，防效在 60% 以上。李云飛等[38]研究表明， 10% MBT乳油按照藥種體積比 1：20 處理水稻種子，田間防治效果在 84% 以上，與 95% 的殺螟丹相比，防治效果更佳，且產(chǎn)量明顯高于對(duì)照。種衣劑包衣后出苗安全，而且會(huì)促進(jìn)植株根長和鮮質(zhì)量等生理指標(biāo)的增加，進(jìn)而促進(jìn)植株對(duì)線蟲的抗性[39-40]。本研究也發(fā)現(xiàn)，MBT對(duì)大豆具有促生作用，最大總鮮質(zhì)量增加率為 10.48% 。

4結(jié)論

本研究表明，二硫氰基甲烷（MBT）對(duì)大豆孢囊線蟲的行為和代謝及大豆生長發(fā)育均有影響。MBT通過降低乙酰膽堿酯的酶活性，作用于線蟲神經(jīng)系統(tǒng)，使線蟲運(yùn)動(dòng)和尋找寄主的能力受到影響；通過顯著降低過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和超氧化物歧化酶（SOD）等關(guān)鍵酶的活性，使線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受到抑制，干擾蛋白質(zhì)代謝，進(jìn)而影響線蟲的正常生命活動(dòng)。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)證實(shí)， 0.5% MBT種衣劑和2.5mg/L MBT對(duì)孢囊及其幼蟲均有良好的防效，隨著濃度增加，對(duì)幼蟲的防效也隨之提高，且2.5mg/L MBT對(duì)大豆具有促生作用。因此，MBT在有效防治孢囊線蟲方面具備應(yīng)用潛力。

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Effects of Methylene Bithiocyanate on Toxicity，Control Efficacy and Metabolism of Heterodera glycines

ZHOU Chen1，JIANG Wei1 ，LUO Ning1 ，GUO Wei1 ，LI Huixia1 and LIU Yonggang2

1.College ofPlantProtection，Gansu Agricultural University，Biocontrol Engineering LaboratoryofCrop Diseasesand Pests of Gansu Province，Lanzhou73oo7o，China；2.Instituteof Plant Protection，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Pollution-free Pesticide Engineering Laboratory of Gansu Province，Lanzhou 73Oo7o，China）

Abstract In this experiment，based on tests of MBT toxicity and control efcacy against soybean cyst nematode，the dipping method was used to detect the effects on movement behavior，protein content， and related enzyme activities of H . glycines.The results indicated that after being treated with low concentrations of MBT，the nematodes retained their normal shape，but their movements became sluggish.As the treatment time was prolonged，the mobility of the nematodes declined significantly，ultimately leading to gradual mortality.In contrast，when treated with high concentrations of MBT，nematode movement was markedly reduced，with significant decreases in head swinging and body bending frequencies，and death occurred relatively rapidly.After MBT treatment，the protein content in nematodes was significantly reduced，but it was less affected by MBT concentration. As the concentration of MBT increased，the activities of acetylcholinesterase （AChE），catalase （CAT），glutathione-S-transferase （GST），and superoxide dismutase （SOD） in the nematodes exhibited an overall downward trend. Notably，AChE activity decreased most significantly，with greater reductions observed at higher concentrations.The activities of CAT，GST，and SOD also significantly decreased，with substantial reductions occurring even at low concentrations.In vitro and in vivo trials demonstrated that MBT significantly repelled the second-stage juveniles and control efficacy of 0.5% MBT seed coatings on the second-stage juveniles and cysts were 60.21% and 63.18% ，respectively. In conclusion，it is inferred that MBT disrupts the nervous system of nematodes，and then affects protein synthesis and activities of related enzymes，and ultimately leads to the death of the nematodes. These results provide a theoretical basis for the development and utilization of this agent，and lay the foundation for the effective control of cyst nematodes.

Key wordsMethylene bisthiocyanate; Soybean cyst nematode; Seed coatings; Physiological activity： Enzymatic activity

Received 2024-10-17 Returned 2024-11-14

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China （No.32260654）； the Key Research and Development Program of Gansu Province （No. 24YFWAol5）;National Key Research and Development Program（No. 2024YFD1401204-03）.

First authorZHOU Chen，male，master student. Research area： plant pathogenic nematology. E-mail： 2805756427@qq.com

Corresponding authorLI Huixia，female，Ph. D，professor，doctoral supervisor. Research area： plant nematology. E-mail ：lihx@gsau.edu. cn

LIU Yonggang，male，Ph. D，research fellow. Research area： plant chemical protection， pesticide toxicology and biocongtrol. E-mail：liuyg@gsagr. ac. cn

（責(zé)任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）