摘" 要：油茶（Camellia oleifera）是中國重要的木本油料作物，但由于栽培管理不當，土壤肥力下降，病害頻發(fā)，其中炭疽病是影響油茶產(chǎn)量的主要病害之一。為探索綠色可持續(xù)的防治策略，本研究利用生物炭作為載體，負載貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis SK1-5-2），評估其對油茶生長促進作用及對炭疽病的抑制效果。通過盆栽試驗驗證，生物炭負載貝萊斯芽孢桿菌（SK1-5-2-GFP）在促進油茶生長、改善土壤理化性質(zhì)及提高抗病性方面表現(xiàn)出顯著協(xié)同效應(yīng)。與對照（CK）相比，生物炭負載SK1-5-2（BB）的植株高度、葉面積、地徑、葉綠素含量及鮮質(zhì)量均顯著提高，其中BB的地徑增幅明顯高于單獨接種菌液處理組（BV）。菌株定殖試驗結(jié)果顯示，SK1-5-2-GFP能夠在生物炭多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)穩(wěn)定附著，并在油茶根際細胞間隙實現(xiàn)高效定殖，且其存活率及功能性未受GFP標記影響。在土壤理化性質(zhì)方面，BB的全氮、速效磷和有機質(zhì)含量較CK分別提高55.2%、334.0%和181.0%；生物炭單獨處理組（BC）速效鉀含量較CK增加63.1%。在土壤酶活性方面，BB組的過氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶及酸性磷酸酶活性分別較CK增加28.0%、44.4%、57.9%和338.6%，均達到顯著水平。根際微生物群落分析表明，BB處理顯著提升有益菌的相對豐度，Bacillus屬和Priestia屬成為優(yōu)勢菌群，同時真菌群落中藍狀菌屬（Talaromyces）豐度升高，致病性鐮刀菌屬（Fusarium）豐度則明顯降低。在病害防控方面，BB油茶炭疽病的發(fā)病率降至55.6%，顯著優(yōu)于BV（60.1%）和BC（77.8%）。綜上所述，生物炭負載貝萊斯芽孢桿菌通過優(yōu)化根際微環(huán)境、調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)及抑制病原菌，實現(xiàn)了促進油茶生長與病害防控的雙重效益。本研究為油茶可持續(xù)種植提供新的微生物調(diào)控策略，也為農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用與土壤改良技術(shù)的發(fā)展提供科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞：生物炭；貝萊斯芽孢桿菌；油茶；生長促進；炭疽??；生物防控中圖分類號：S794.4；S476 """""文獻標志碼：A

Growth-promoting and Disease-resistant Effects of Biochar-loaded Bacillus velezensis on Camellia oleifera

ZHANG Jiangfan^1，3， WU Wenqiang^1，3， HUANG Dongyi^2，3， LAI Hanggui^2，3， HU Haiyan^2，3， DING Yuanhao^2，3， LIU Jinping^2，3， WANG Jian^2，3， HUANG Xiaolong^1，3*

1. School of Life and Health Sciences， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. School of Southern Tropical Agriculture， Hainan University， Sanya， Hainan 572025， China; 3. Tropical Oil-tea Engineering Research Center of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： Camellia oleifera， a vital woody oil crop in China， has been increasingly threatened by declining soil fertility and frequent disease outbreaks due to improper cultivation practices. Among these， anthracnose is one of the primary diseases limiting yield. To explore environmentally friendly and sustainable control strategies， this study employed biochar as a carrier to deliver Bacillus velezensis SK1-5-2， aiming to evaluate its plant growth-promoting potential and its efficacy in suppressing anthracnose. Pot experiments demonstrated that biochar-loaded SK1-5-2-GFP significantly enhanced C. oleifera growth， improved soil physicochemical properties， and increased disease resistance， indicating a strong synergistic effect. Compared to CK， the biochar-loaded bacterial treatment （BB） significantly improved plant height， leaf area， basal stem diameter， chlorophyll content， and fresh weight. Notably， stem diameter in the BB group increased more substantially than that in the group treated with bacterial suspension alone （BV）. Colonization assays revealed that strain SK1-5-2-GFP stably adhered within the porous structure of biochar and efficiently colonized the intercellular spaces in the rhizosphere of C. oleifera， with its viability and functionality unaffected by GFP labeling. Soil properties， total nitrogen， available phosphorus， and organic matter contents in the BB group increased by 55.2%， 334.0%， and 181.0%， respectively， compared to CK. Additionally， available potassium in the biochar-only group （BC） increased by 63.1%. Regarding soil enzyme activities， the BB group exhibited significant increases in catalase （28.0%）， sucrase （44.4%）， urease （57.9%）， and acid phosphatase （338.6%） activities compared to CK. Rhizosphere microbial community analysis showed that BB treatment significantly elevated the relative abundance of beneficial microbes， with Bacillus and Priestia emerging as dominant genera. Among fungal communities， the abundance of Talaromyces increased， whereas the pathogenic Fusarium genus obviously declined. The anthracnose incidence in the BB group dropped to 55.6%， markedly lower than that in the BV （60.1%） and BC （77.8%） groups. In conclusion， biochar-loaded B. velezensis enhanced plant growth and disease resistance in C. oleifera by optimizing the rhizosphere microenvironment， modulating microbial community composition， and suppressing phytopathogens. This study would provide a novel microbial regulation strategy for the sustainable cultivation of C. oleifera， offering valuable insights for future applications of agricultural microorganisms and soil improvement technologies.

Keywords： biochar; Bacillus velezensis; Camellia oleifera; growth promotion; anthracnose; biological control

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.08.018

油茶（Camellia oleifera）原產(chǎn)于中國，屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）的常綠小喬木，是世界四大木本油料樹種之一^[1]。目前廣泛栽培于我國湖南、江西、廣西、湖北、重慶、福建、貴州、海南等15個南方?。▍^(qū)、市）^[2]。油茶籽榨取的茶油富含大量不飽和脂肪酸，同時含有豐富的生育酚、角鯊烯、植物甾醇、黃酮、多酚等生物活性物質(zhì)，是一種多功能的優(yōu)質(zhì)食用油^[3]。

油茶多在土壤貧瘠的丘陵山區(qū)造林，撫育過程中常因缺乏科學管理而大量施用化肥和農(nóng)藥，導致土壤肥力下降，病蟲害頻發(fā)。其中，油茶炭疽病是當前影響油茶生長的最嚴重病害之一^[4]，在油茶主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，可引起果實大量脫落、花芽枯萎、枝梢干枯，甚至整株衰敗死亡，嚴重影響油茶產(chǎn)量^[5]。盡管化學防治在一定程度上可遏制病害發(fā)生，但長期濫用化學農(nóng)藥不僅促使病原菌抗藥性增強，對植物產(chǎn)生毒害^[6]，還帶來顯著的環(huán)境污染和生態(tài)風險^[7-9]。因此，開發(fā)兼具促生與抗病功能的綠色生物技術(shù)手段，對于實現(xiàn)油茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）屬于芽孢桿菌屬，是一種能夠產(chǎn)生多種生物酶和次級代謝產(chǎn)物的有益菌，具有良好的促生與廣譜抗菌能力，在農(nóng)業(yè)病害生物防控中應(yīng)用廣泛^[10]。作為外源有益微生物菌劑，芽孢桿菌能夠在作物根際定殖，提升土壤養(yǎng)分利用率，改善作物根際微生態(tài)環(huán)境，并增強作物抗病性^[11]。然而，在新環(huán)境中，外源微生物需同時應(yīng)對微型動物的捕食和土著微生物的資源競爭，常面臨定殖率低、功能不穩(wěn)定等問題^[12]。為提高其定殖效率和功能穩(wěn)定性，常需借助載體材料共同引入，如泥炭苔、玉米芯粉、膨潤土、珍珠巖、蛭石、聚丙烯酰胺、生物炭及藻酸鹽微球等^[13-14]。這些載體不僅能保護微生物活性，還有助于提升其在土壤中的定殖能力與功能表達。然而，當前有關(guān)載體與微生物之間相容性及其在載體中生存規(guī)律的研究仍較匱乏，制約了微生物功能的進一步發(fā)揮。

生物炭是由生物質(zhì)在缺氧條件下經(jīng)熱解生成的一種富碳固態(tài)物質(zhì)，具有獨特的物理和化學性質(zhì)，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力^[15-16]。其可改善土壤結(jié)構(gòu)，增強土壤穩(wěn)定性和保水能力，降低土壤容重，為植物根系提供更適宜的生長環(huán)境^[17]。此外，生物炭富含多種養(yǎng)分，具有良好的保肥能力，能夠提升土壤肥力，促進植物對養(yǎng)分的吸收^[18-22]生物炭還可為土壤微生物提供理想的棲息環(huán)境與營養(yǎng)來源，有助于提高微生物多樣性與群落豐度，增強土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性^[23]。其豐富的孔隙結(jié)構(gòu)與優(yōu)良的吸附性能，使其成為理想的微生物載體材料^[24]。已有研究表明，生物炭與木霉菌聯(lián)合使用，可有效抑制病原菌生長，并增強其定殖能力與功能發(fā)揮。DE MEDEIROS等^[25]研究表明，生物炭與木霉菌的協(xié)同策略在防控土傳病原菌方面展現(xiàn)出巨大潛力。

綜上，生物炭作為一種功能性載體，能在提升外源有益微生物定殖效率、增強植物抗病性和促生作用等方面提供重要支持。已有研究表明，B. velezensis對油茶具有顯著的促生作用，并能增強其對炭疽病的抗性，在油茶產(chǎn)業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景^[26]。然而，關(guān)于該菌在熱帶地區(qū)油茶中的應(yīng)用研究尚屬空白。

本研究前期從海南火龍果根際分離獲得一株具廣譜抗菌活性與促生能力的貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2。以該菌株為基礎(chǔ)，采用椰殼生物炭作為載體，構(gòu)建適用于熱帶地區(qū)的“生物炭–貝萊斯芽孢桿菌”復合體系，系統(tǒng)評估其在提升微生物定殖效率、促進油茶生長與抗病性以及改善土壤理化性質(zhì)方面的效果。研究旨在突破熱帶地區(qū)微生物定殖的技術(shù)瓶頸，為海南地區(qū)油茶產(chǎn)業(yè)提供兼具抗病、增產(chǎn)和土壤修復功能的一體化綠色解決方案。

1" 材料與方法

1.1 "材料

供試菌株貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2由本實驗室前期從火龍果根際土壤中分離獲得。供試油茶炭疽病病原菌TJ1-6（Colletotrichum siamense）則從患病油茶葉片中分離純化獲得。油茶種子來源于海南省儋州市海南大學儋州基地，品種為海大2號。綠色熒光蛋白標記質(zhì)粒pGFP-4412購自上海欽誠生物科技有限公司。生物炭購自鄭州昊森環(huán)?？萍加邢薰?，以椰殼為原料制備而成，主要理化性質(zhì)如下：有機質(zhì)含量為79.1%，灰分為3.4%，總氮為0.5%，水分為2.9%，NPK總養(yǎng)分為7.2%，重金屬含量為0.0%，比表面積為417.1"m²/g，制備溫度為580"℃，粒徑范圍為18～ 30"mm，pH 6.8。

1.2" 方法

1.2.1 "貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2綠色熒光蛋白標記" 參考IDRIS等^[27]的方法，接種菌株SK1-5-2于液體LB培養(yǎng)基中，33"℃、170 r/min下振蕩過夜培養(yǎng)。取適量培養(yǎng)液于GCHE培養(yǎng)基中，調(diào)整OD₆₀₀值至約0.3；在33"℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)，直至OD₆₀₀值達到約1.4。隨后加入等體積的GC培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約1.5 h。將培養(yǎng)液等分為2份，5000 r/min離心5 min（室溫）。取200 μL上清液重懸沉淀，加入2"mL轉(zhuǎn)化緩沖液和1 μg pGFP-4412質(zhì)粒，輕輕混勻后置于33"℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，期間每10～15 min輕輕顛倒混勻1次。加入含亞致死濃度的卡那霉素的LB培養(yǎng)液，33"℃、170"r/min培養(yǎng)2～3"h，8000"r/min離心5"min，取400"μL上清液重懸沉淀后均勻涂布于含卡那霉素的LB平板上，次日觀察有無抗性菌落出現(xiàn)，并進行PCR擴增，引物為F：5?-TCGTT AGAACGCGGCTACAATTAAT-3?；R：5?-ATAA AGTAAGAAAAAATGAGTCCGT-3）。擴增體系總體積為50 μL，其中模板DNA 1 μL，引物各2 μL，PCR Mix 25 μL，ddH₂O 20 μL；擴增程序為94"℃預變性5 min，94"℃變性30 s，55"℃退火30 s，72"℃延伸1 min，30個循環(huán)，72"℃最后延伸10"min。將PCR擴增陽性的菌液制片，采用共聚焦熒光顯微鏡觀察菌體是否有綠色熒光信號。

1.2.2" 貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP生物炭復合材料制備 "參考JIA等^[28]的方法，將GFP標記的貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2接種于液體LB培養(yǎng)基中，于30"℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h，獲得菌種預培養(yǎng)液。按1%（V/V）接種量再次接入新鮮LB培養(yǎng)基中，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)48"h，培養(yǎng)結(jié)束后將菌液濃度調(diào)節(jié)至1× 10⁸ CFU/mL。隨后，按生物炭與菌懸液質(zhì)量∶體積比為1∶5進行混合，于30"℃、170"r/min下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，過濾除去游離菌體，并用去離子水沖洗3次，以去除殘余浮游細胞。所得樣品置于20"℃烘箱中低溫風干，獲得負載菌株SK1-5-2的生物炭復合體，并于4"℃下保存?zhèn)溆?。為觀察菌株在生物炭表面的附著狀態(tài)，取少量復合樣品在經(jīng)液氮預冷的異戊烷中進行快速冷凍處理，隨后采用環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）進行微觀結(jié)構(gòu)成像。此外，利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）檢測SK1-5-2-GFP在生物炭表面的綠色熒光表達，以評價其附著與分布情況。

1.2.3" 盆栽試驗" 油茶盆栽試驗于2024年5月在海南大學海甸校區(qū)進行。試驗設(shè)4個處理組：對照（CK）、貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP處理（BV）、生物炭處理（BC）以及生物炭負載貝萊斯芽孢桿菌處理（BB），每個處理設(shè)40盆，采用隨機排列設(shè)計。試驗用土壤經(jīng)自然風干后過2 mm篩。根據(jù)試驗設(shè)置，分別將BC和BB按照土壤質(zhì)量的2%（m/m）比例充分混勻后裝入營養(yǎng)缽（110"mm×170 mm），每盆添加1.50"kg土壤。CK和BV則直接裝入相同質(zhì)量的未經(jīng)處理的土壤。油茶種子事先在沙床中催芽，待長出2片真葉后，選取生長一致的幼苗移栽至各處理組的營養(yǎng)缽中，每盆定植1株。BV處理組在移栽后7 d內(nèi)進行根際灌菌處理，使用1×10⁶ CFU/mL的SK1-5- 2-GFP菌液進行灌根，共灌根5次，每次間隔3 d。

1.2.4" 標記菌株在油茶側(cè)根定殖觀察" 在油茶種植15 d后，采集油茶的側(cè)根放入清水中，輕輕搖動，去除表面泥土和其他雜質(zhì)。使用無菌吸水紙輕輕按壓樣品，吸干表面的水分，確保側(cè)根干凈無水跡。采用解剖刀片小心地將油茶的側(cè)根切成厚度均勻的薄片。將處理好的切片樣品置于載玻片上，滴加適量的封片劑，蓋好蓋玻片，置于共聚焦熒光顯微鏡上進行顯微觀察和成像。

1.2.5 "油茶生長指標測定" 盆栽種植30 d后對油茶生長指標進行測定。葉綠素含量測定：分別取4個處理組油茶各40株長勢一致的植株，在植株中上部健康向陽葉片，利用便攜式葉綠素含量測量儀CCM-300（Opti-Sciences， USA）在同一位置測量每株植物葉片葉綠素3次，取其平均值；用自來水將地上部和根系沖洗干凈，用吸水紙將根系和地上部所有水分擦干。鮮質(zhì)量：分別取4個處理組油茶各20株油茶根部清洗干凈后，稱取鮮質(zhì)量取平均值；株高：分別取4個處理組油茶使用軟尺測量20株油茶株高，取平均值；葉面積：4個處理組油茶，各組隨機挑選20株，選取真葉用游標卡尺測量葉片最長處和最寬處，計算葉面積。

1.2.6" 土壤理化指標測定" 參照常規(guī)測定方法^[29-30]測定5個土壤理化性質(zhì)：有效磷、有效鉀、全氮、土壤pH、土壤有機質(zhì)。采用土壤蔗糖酶（SC）檢測試劑盒、土壤脲酶（UE）活性檢測試劑盒、土壤酸性磷酸酶（ACP）活性檢測試劑盒和土壤過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒測定不同處理油茶根際土壤4種酶活（蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶），具體方法參照試劑盒說明書。各理化性質(zhì)與酶活值均設(shè)置3個重復。

1.2.7" 炭疽病感染" 病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)復蘇，然后挑取少量菌絲放入SNA液體培養(yǎng)基^[31]于28"℃恒溫震蕩培養(yǎng)7"d后，無菌水稀釋至1.5×10⁷ CFU/mL 孢子懸浮液，上述經(jīng)處理的油茶，每個處理組隨機取20株。采用刺傷法進行接種，用無菌注射器針頭刺穿葉片2處，滴加油茶炭疽病孢子懸浮液，只接無菌水為對照，每個處理20株，15 d后觀察并記錄植株生長和發(fā)病情況。病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相應(yīng)病級）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級）×100；病害防效=（病菌對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。病情分級為0級：無病斑；1級：病斑面積占整個葉面積的1%以下；3級：病斑面積占整個葉面積的2%～5%；5級：病斑面積占整個葉面積的6%～20%；7級：病斑面積占整個葉面積的21%～35%；9級：病斑面積占整個葉面積的36%以上。

1.2.8" 樣品總DNA的提取及微生物多樣性分析" 采用E.Z.N.A.^? Soil DNA Kit（Omega Bio-tek）DNA抽提試劑盒，抽提根際土壤樣本DNA。采用NEXTflexTM Rapid DNA Seq Kit （Bioo Scientific）構(gòu)建DNA測序庫。細菌16S rRNA V1～V9區(qū)全長引物序列為27F（5?-AGRGTTTGATYNT GGCTCAG-3?）；1492R（5?-TASGGHTACCTTG TTASGACTT-3?）。真菌ITS rRNA全長引物序列為ITS1（5?-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- 3?）；ITS4（5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）。采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的MiSeq PE300測序平臺獲得原始數(shù)據(jù)。

1.3 "數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件整理統(tǒng)計數(shù)據(jù)；采用Graphpad Pism 9.5軟件進行單因素方差分析和鄧肯多重比較，以Plt;0.05為差異顯著水平，并繪圖。采用Chao1指數(shù)評估菌群豐富度，采用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)評估菌群多樣性，利用R語言繪制物種群落組成Bar圖并進行主成分分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1 "貝萊斯芽孢桿菌綠色熒光標記及遺傳穩(wěn)定性檢測

將pGFP-4412質(zhì)粒成功導入貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2后，獲得了能夠在抗性平板上生長的標記菌株SK1-5-2-GFP。以SK1-5-2-GFP的基因組DNA為模板，使用GFP基因特異性引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小約為1000 bp，與設(shè)計片段長度一致（圖1A）。此外，在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察到SK1-5-2-GFP能夠激發(fā)出明顯的綠色熒光（圖1B），表明pGFP-4412質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入菌株體內(nèi)并能正常表達。進一步對標記菌株進行遺傳穩(wěn)定性檢測，將SK1-5-2-GFP傳代至第10代（圖1C）和第20代（圖1D）后，依然可在抗性平板上正常生長，單菌落在共聚焦顯微鏡下仍能激發(fā)綠色熒光。結(jié)果表明，pGFP-4412質(zhì)粒在SK1-5-2菌株中具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 "標記菌株SK1-5-2-GFP對油茶炭疽病的抑制作用

在平板對峙試驗中比較了原始菌株（圖2A）與標記菌株（圖2B）對油茶炭疽病病原菌的抑制能力。結(jié)果表明，GFP標記菌株抑菌率為87%，原始型菌株抑菌率為84%，二者在抑制病原菌生長的能力上無顯著差異。表明GFP標記對貝萊斯芽孢桿菌的拮抗功能未造成明顯影響。

2.3" 菌株SK1-5-2-GFP在生物炭上的固定與存活

通過環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）成像，證實了貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP在生物炭表面的成功附著與定殖。ESEM圖像顯示，SK1-5-2-GFP菌株主要分布于生物炭的管狀結(jié)構(gòu)和側(cè)向褶皺內(nèi)部（圖3A，圖3B），表明這些微結(jié)構(gòu)為菌體提供了良好的附著位點與保護環(huán)境。進一步，CLSM圖像清晰觀察到表達綠色熒光蛋白的活菌在生物炭表面的分布（圖3C，圖3D，圖3E），驗證了SK1-5-2-GFP細胞的活性及穩(wěn)定定殖效果。

2.4 "標記菌株SK1-5-2-GFP在油茶根系的定殖

熒光共聚焦顯微鏡（CLSM）圖像顯示，標記菌株SK1-5-2-GFP能夠在油茶側(cè)根部成功定殖（圖4）。菌株主要分布于側(cè)根細胞壁及細胞間隙區(qū)域（圖4A）。明場圖像展示了油茶側(cè)根的細胞結(jié)構(gòu)，為貝萊斯芽孢桿菌的定殖定位提供結(jié)構(gòu)參考（圖4B）。熒光圖與明場圖疊加后顯示，菌株主要分布在根表面及部分細胞間隙區(qū)域（圖4C）。綜合觀察結(jié)果推測，貝萊斯芽孢桿菌可能通過細胞間隙擴散的方式在根際形成菌群聚集，實現(xiàn)有效定殖。

2.5" 生物炭負載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP對油茶生長的影響

不同處理對油茶生長的影響如圖5所示。與CK相比，BV、BC和BB處理均顯著促進油茶的生長發(fā)育，在株高、葉面積、莖基直徑、葉綠素含量及鮮質(zhì)量等指標上均明顯高于CK。此外，這3組處理的油茶根系發(fā)達，根毛數(shù)量明顯增多，尤其是BV和BB，根毛分布更為豐富。在BV與BB處理間，株高、葉面積、葉綠素含量及鮮質(zhì)量差異不顯著，但BB的地徑顯著高于BV。與BC相比，BV和BB在所有生長指標上均表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。綜上，BB在促進油茶生長方面的效果最為顯著，優(yōu)于BV或BC，顯示出良好的協(xié)同增效作用。

2.6 "生物碳負載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP對土壤理化性質(zhì)的影響

研究表明，生物炭處理顯著改善了土壤的理化性質(zhì)（表1）。在全氮含量方面，BB和BC均顯著高于CK，提升幅度為48.3%～55.2%。速效磷含量在BB和BC中也顯著提高，分別較CK提升334.0%和288.0%；相反，BV的速效磷含量較CK下降68.1%。速效鉀含量呈現(xiàn)出BCgt;CKgt;BBgt;BV的變化趨勢，其中BC較CK提高63.1%。在有機質(zhì)含量方面，BC和BB均為CK的2.8倍，而BV與CK之間無顯著差異。土壤pH在各處理間無顯著差異。綜合分析結(jié)果顯示，BC在提升速效鉀、有機質(zhì)和全氮含量方面表現(xiàn)最佳，而BB在速效磷和全氮含量的提升上具有更明顯優(yōu)勢。相比之下，BV對大多數(shù)土壤養(yǎng)分指標產(chǎn)生了抑制效應(yīng)，進一步凸顯生物炭基質(zhì)在土壤改良中的顯著作用，優(yōu)于菌劑單獨施用。

2.7" 生物碳負載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP對土壤酶活力的影響

研究顯示，相較于CK，BB、BV、BC對土壤酶活性具有顯著調(diào)控作用（圖6）。其中，BB和BV表現(xiàn)尤為突出：過氧化氫酶（CAT）活性分別提升28.0%和24.4%，蔗糖酶（SC）活性分別提高44.4%和65.4%，脲酶（UE）活性增幅分別達57.9%和68.6%，且酸性磷酸酶（ACP）活性在BB中激增338.6%，顯著優(yōu)于CK。BC雖使脲酶和過氧化氫酶活性分別提升21.7%和11.4%，但其蔗糖酶和酸性磷酸酶活性與CK無顯著差異。所有處理組中，CK的酶活性均處于最低水平，表明處理組BB和BV能系統(tǒng)性優(yōu)化土壤酶活性，強化土壤生化功能。

2.8" 生物碳負載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2- GFP對油茶抗病性的影響

不同處理對油茶抗病性的影響如圖7所示。CK與BC的病情指數(shù)均為77.8%，表明單獨施用生物炭對油茶炭疽病的抑制效果有限。BV的病情指數(shù)為60.1%，而BB顯著下降至55.6%（圖7A）。結(jié)果顯示，含有貝萊斯芽孢桿菌的BV和BB均能顯著降低病情指數(shù)，其中BB的抗病效果優(yōu)于BV（圖7B）。貝萊斯芽孢桿菌在提高油茶抗病性方面具有顯著作用，且與生物炭聯(lián)用可進一步增強其防控效果。

2.9" 生物炭負載貝萊斯芽孢桿菌對根際微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

2.9.1" α和?多樣性分析 "選取ACE、Chao1、Shannon和Simpson 4個α多樣性指數(shù)，在97% OTU相似度水平下對細菌和真菌群落進行分析，相關(guān)結(jié)果見表2和表3。根際細菌群落的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)顯示，與CK相比，BV、BC和BB的物種豐富度和多樣性均有所提高，但差異均未達到顯著水平（表2）。

在真菌群落方面，ACE指數(shù)分析結(jié)果表明，CK顯著高于其他3個處理組；Chao1指數(shù)中，CK顯著高于BV，但與BC和BB差異不顯著。

Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)分析顯示，各處理組間無顯著性差異（表3）?？傮w來看，與CK相比，各處理在提高根際細菌物種豐富度和多樣性方面具有一定優(yōu)勢，而真菌物種豐富度則呈下降趨勢，真菌多樣性略有提高，但差異均不顯著。

細菌主成分分析（PCA）結(jié)果見圖8A，BC樣本明顯與其他處理組分離，表明生物炭的施用顯著改變了根際細菌群落結(jié)構(gòu)。BV與CK未表現(xiàn)出明顯分離，說明單獨施用貝萊斯芽孢桿菌對細菌群落結(jié)構(gòu)影響有限。BB則與其他各組分離明顯，顯示生物炭負載貝萊斯芽孢桿菌的處理對根際細菌群落結(jié)構(gòu)的影響既區(qū)別于單獨的生物炭處理，也不同于單獨施用菌劑，具有一定的獨特性。

真菌主成分分析結(jié)果如圖8B所示，各處理組間差異明顯，表明各處理方式對根際真菌群落結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了顯著影響。

2.9.2" 細菌門分類水平和屬分類水平群落組成分析" 不同處理組油茶根際的細菌門水平和屬水平的優(yōu)勢微生物豐度百分比堆疊柱狀圖（相對豐度gt;1%）如圖9和圖10所示?；谙鄬ωS度gt;1%定義優(yōu)勢細菌門和優(yōu)勢細菌屬，各處理組的優(yōu)勢細菌門為12個。分別為假單胞菌門（Pseudomona-dota）、芽孢桿菌門（Bacillota）、酸桿細菌門（Acidobacteriota）、疣微菌門（Verrucomic-robiota）、放線菌門（Actinomycetota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、熱硫還原菌門（Thermomicro-biota）、浮霉菌門（Planctomycetota）、綠彎菌門（Chloroflexota）、芽單胞菌門（Gemmatim-onadota）、硝化螺旋菌門（Nitrospirota）、熱脫硫桿菌門（Thermodesulfobacteriota）。CK中假單胞菌門與芽孢桿菌門占主導地位，酸桿菌門次之。BV酸桿菌門和放線菌門比例有所增加。BC假單胞菌門和放線菌門比例增加，芽孢桿菌門比例降低。BB芽孢桿菌門比例明顯增加，但假單胞菌門和酸桿菌門比例降低。

各處理組細菌群落均以芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，其在土壤中占優(yōu)勢地位，其他屬的變化差異明顯。與CK相比，BV中的芽孢桿菌屬的豐度下降明顯，而博爾克氏菌屬（Burkholderia）和暫定酸桿菌屬（Candidatus Koribacter）的豐度均明顯上升；在BC中，硫細菌屬（Thiobacter）增長1100.0%，鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）增加了400%；BB中芽孢桿菌屬和斯特氏菌屬（Priestia）明顯高于BC和BV，斯特氏菌屬相較于CK增加400%，并且相較于其

他處理組各菌屬比例較為均勻。這種微生物群落的變化可能反映了生物炭負載貝萊斯芽孢桿菌在微生態(tài)系統(tǒng)中的獨特作用，增加了土壤微生物群落穩(wěn)定性，進而影響土壤健康和作物生長。

2.9.3" 真菌門分類水平和屬分類水平群落結(jié)構(gòu)分析" 不同處理組油茶根際的真菌門水平和屬水平的優(yōu)勢微生物豐度百分比堆疊柱狀圖（相對豐度gt;1%）如圖11和圖12所示?；谙鄬ωS度gt;1%定義優(yōu)勢真菌門和優(yōu)勢真菌屬，在門水平上，各處理組的優(yōu)勢真菌門均為7個。分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、未定分類真菌（unclassified_k__Fungi）、壺菌門（Chytridiomycota）、羅澤爾菌門（Rozell-omycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、未定分類真菌門（Fungi_phy_Incertae_sedis），其中子囊菌門和擔子菌門豐度占比最大。與CK相比，BV中子囊菌門比例上升；BC中擔子菌門比例下降明顯，但羅澤爾菌門和壺菌門真菌比例增加；BB中未定分類真菌和和羅澤爾菌門比例上升而擔子菌門略有下降。

真菌屬水平上，各處理組的優(yōu)勢真菌屬為藍狀菌屬（Talaromyces），屬的變化差異明顯。研究發(fā)現(xiàn)：相比于CK，BV土壤中木霉屬（Tric-hoderma）相對豐度升高，腐質(zhì)霉屬（Humicola）上升；BC中木霉相對豐度上升，未明確歸類壺菌（unclassified-p-Chytridiomycota）和黑盤孢屬（Melanconiella）相對豐度也上升明顯；BB中藍狀菌屬比例上升，未知真菌（Unclassified_k_ Fungi）相對豐度上升顯著，而鐮刀菌屬豐度明顯下降。

3" 討論

本研究結(jié)果表明，生物炭負載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2能夠顯著促進油茶的生長，改善土壤養(yǎng)分狀況，并優(yōu)化根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。具體而言，生物炭作為載體，提高了SK1-5-2在土壤中的存活率和定殖能力，增強了其促生與生防功能，使其能夠在土壤中長期發(fā)揮作用。此外，該處理顯著提高了土壤酶活性，增強了土壤微生物多樣性，并有效降低了油茶炭疽病的病情指數(shù)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，SK1-5-2在生物炭的支持下，不僅自身存活能力增強，還通過分泌吲哚乙酸、細胞分裂素等植物生長促進物質(zhì)，促進植物根系發(fā)育，并招募多種有益微生物菌群，如斯特氏菌屬、博爾克氏菌屬、藍狀菌屬、木霉屬等，從而間接改善了土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和健康狀況。

與現(xiàn)有研究相比，本研究進一步證實了生物炭作為微生物載體在農(nóng)業(yè)和土壤生態(tài)修復中的潛在價值。已有研究表明，生物炭由于富含有機碳、孔隙率高、持水能力強等特性，為土壤微生物提供了理想的棲息環(huán)境，增強了有益微生物的存活能力和功能發(fā)揮^{[12， 32]}。例如，枯草芽孢桿菌負載于生物炭后，其在土壤中的存活期顯著延長，并對病原菌產(chǎn)生更強的拮抗作用^[33]。此外，JIANG等^[34]的研究發(fā)現(xiàn)，載有N33菌株的生物炭能夠富集芽孢桿菌門、綠彎菌門及芽孢桿菌科等功能微生物，提高土壤酶活性，并改善土壤氮磷鉀等養(yǎng)分，最終促進山核桃生長。本研究結(jié)果與這些研究一致，進一步驗證了生物炭負載B. velezensis在提高土壤養(yǎng)分、優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)及增強植物抗病性方面的協(xié)同作用。值得注意的是，本研究不僅證實了生物炭負載B. velezensis促進植物生長的直接效應(yīng)，還揭示了其在提升土壤微生態(tài)穩(wěn)定性和病害防控能力方面的積極作用。

生物炭-微生物復合體系的作用機制可能涉及多個方面。首先，生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)為B. velezensis提供了物理保護，使其免受土壤中捕食者的威脅，同時緩解了養(yǎng)分匱乏對微生物存活的不利影響。這種結(jié)構(gòu)性支持增強了B. velezensis在土壤中的定殖能力，從而延長其促生和拮抗作用的持續(xù)時間。其次，B. velezensis通過分泌吲哚乙酸、細胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進植物根系發(fā)育，提高植物對土壤養(yǎng)分的吸收能力，并通過固氮、溶磷、解鉀等功能提高土壤養(yǎng)分的有效性^[35-37]。此外，B. velezensis還能夠分泌鐵載體等次級代謝產(chǎn)物，進一步增強土壤微生態(tài)的活力，并促進有益微生物的富集。例如，本研究發(fā)現(xiàn)，B. velezensis的引入使根際土壤中慢生根瘤菌屬、博爾克氏菌屬、藍狀菌屬、木霉屬等微生物的豐度顯著增加。這些微生物能夠通過多種機制促進植物健康，如固氮、分解有機質(zhì)釋放養(yǎng)分、改善土壤結(jié)構(gòu)及通過產(chǎn)生植物激素直接影響植物生長等^[38]。土壤微生物群落的多樣性在提高土壤生態(tài)穩(wěn)定性和增強植物抗病能力方面具有重要作用^[39-40]。研究表明，微生物多樣性越高，土壤對外界干擾的抵抗力越強，從而降低植物病害的發(fā)生率^[41]。在本研究中，生物炭負載B. velezensis處理組中的芽孢桿菌屬、藍狀菌屬的相對豐度均明顯提高，這些菌群在土壤病原菌的生物防治方面具有重要作用。例如，芽孢桿菌能夠分泌多種抗生素，如枯草芽孢菌素和抗真菌物質(zhì)，能夠有效抑制炭疽病病原菌的生長^[42]。此外，木霉菌在共生微生物群落中能夠通過競爭作用抑制病原微生物，限制病害的傳播^[43-44]。已有研究表明，生物炭作為根際有益微生物的載體，可以顯著提高其在土壤和植物根系中的持久性、存活率和定殖效果，從而提高植物的抗病能力^[45]。例如，生物炭與鏈霉菌聯(lián)合使用，能夠顯著提升對馬鈴薯晚疫霉的抑制效果，并顯著降低晚疫病的病情指數(shù)^[46]。同樣，本研究結(jié)果也表明，將B. velezensis負載于生物炭上，不僅增強了其生物防治能力，還顯著降低了油茶炭疽病的病情指數(shù)，其效果優(yōu)于單獨施用生物炭或單獨施用B. velezensis的處理組。

綜合來看，本研究結(jié)果不僅深化了對生物炭負載有益微生物的作用機制的理解，也為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的思路。生物炭最初被用于土壤改良，以增強碳封存能力，但近年來的研究表明，其功能遠不止于此^[19]。本研究進一步驗證了生物炭作為生物載體的應(yīng)用價值，表明其在促進植物健康、提高土壤養(yǎng)分供應(yīng)能力、優(yōu)化土壤微生物群落、增強植物抗病性等方面具有顯著的生態(tài)效益。未來的研究可進一步探討不同類型的生物炭對B. velezensis及其他生防菌的載體效果，并評估其在不同土壤環(huán)境和作物系統(tǒng)中的適用性。此外，可利用宏基因組學、代謝組學等多組學技術(shù)解析生物炭-微生物復合體系在根際環(huán)境中的作用機制，以更精準地調(diào)控根際微生物群落，提升農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性。綜上，生物炭負載B. velezensis作為一種綠色、可持續(xù)的生物防治策略，不僅顯著提升油茶的生長表現(xiàn)和抗病能力，也為生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供重要的理論依據(jù)和實踐指導。

4" 結(jié)論

本研究通過系統(tǒng)分析生物炭負載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2對油茶生長抗病及根際微生態(tài)的影響，揭示了該復合體系在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中的多重增效機制。結(jié)果表明，生物炭作為功能性載體顯著提升了B. velezensis的定殖能力，通過物理保護效應(yīng)和微環(huán)境調(diào)控延長了其促生與生防功能的持續(xù)時間。該體系通過分泌植物激素促進油茶根系發(fā)育，并激活土壤酶活性，提高氮磷鉀等養(yǎng)分有效性，同時通過定向富集籃狀菌屬、木霉屬等有益微生物，構(gòu)建了抗病性更強的根際微生物網(wǎng)絡(luò)，使油茶炭疽病病情指數(shù)顯著降低。與單一施用生物炭或菌劑相比，生物炭-微生物復合體系展現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，證實其作為綠色生防策略在提升土壤生態(tài)功能、增強植物抗逆性方面的獨特優(yōu)勢。

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