The therapeutic efect of berberine on pathological changes of skin in rats with atopic dermatitis based on the Pl3K/Akt/NF- Π_κB signaling pathway

JIANG Su，LI Dongxia，LYU Xinxiang， CUI Yanhong，LYULiting

Departmentof Dermatologyand Venereology，Afliated HospitalofInerMongolia Medical University， Hohhot O050，Chi

Abstract：ObjectiveTo explore the therapeutic mechanismof berberine inatopic dermatitis （AD）rats basedon PI3K/ Akt/NF-kappa B signaling pathway.MethodsSixty adult male Wistarrats were randomlydivided into the blank group （normal rats）， the control group （AD model， 50mg/kg berberine treatment） and the experimental group （AD model， 200mg/kg berberinetreatment），with2Orats ineachgroup.Thelevelsof interleukin-4（IL-4），interleukin-13（IL-13）andtumor necrosis factor- α （TNF- α ）were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） at1d，7 dand14d of intervention. The protein levels of PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt and NF- κI 3p65 were detected by Western blot assay. Pathologicalchangesofratskintissue wereanalyzedbyHEstaining.ResultsAfterinterventionfor1d，7dand14d， serum levels of IL-4，IL-13，TNF- ∝ and PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt and NF-kappa B p65 were higherin the control group than those intheblank group（ Plt;0.05 ）.Afterinterventionfor7dand14d，thelevelsof theabove indicatorswerelower in the experimental group than those in the control group （ Plt;0.05 ）.After14 days of intervention，compared with the blank group，theskintissue ofrats inthecontrol groupand theexperimental groupshowedobvious pathologicalchanges，including thickening of epidermis layer，excesive keratinization of the stratum corneum，thickening of spinous layer anda large infiltrationof inflammatorycelsindermis.Thepathologicaldamageofratskin tissue was significantlyallviated inthe experimental group.ConclusionBerberinecan inhibittheactivationof PI3K/Akt/NF-kappa Bsignaling pathway，reduce serum level of inflammatory factors and reduce pathological damage of skin tissue in AD rats.

Keywords：dermatitis，atopic;berberine;phosphatidylinositol3-kinases;protooncogeneproteinsc-akt;NF-kappaB; cytokines; skin tissue

特應性皮炎（atopicdermatitis，AD）是一種以皮膚干燥、慢性瘙癢和復發(fā)性炎癥為特征的慢性炎癥性皮膚病1。隨著環(huán)境因素變化及生活方式改變，AD全球發(fā)病率呈顯著上升趨勢[2]。當前臨床主要采用藥物治療（如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑），物理治療（紫外線療法），中醫(yī)藥治療（口服中藥、針灸）等綜合干預措施，但仍具有治療抵抗率高、易復發(fā)等問題。黃連素（Berberine）是從黃連、黃柏等藥用植物中提取的異喹啉類生物堿。既往研究證實其具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多重藥理作用[3]，在銀屑病、濕疹等炎癥性皮膚病治療中展現(xiàn)出潛在價值，但其對AD的具體作用機制尚未完全闡明。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/核因子 κB 中 [NF-κB 信號通路作為調(diào)控細胞增殖、分化、調(diào)亡及炎癥反應的關(guān)鍵通路[4，其異常激活與AD皮膚屏障破壞、Th2型免疫偏移等病理過程密切相關(guān)[5]。本研究通過構(gòu)建AD大鼠模型，探討黃連素對AD大鼠的治療作用，并基于 PI3K/Akt/NF-κB 信號通路揭示其潛在的分子機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物SPF級成年雄性Wistar大鼠60只，11＼～12周齡，體質(zhì)量 210～254g ，購自上海懿尚生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2022-0011，使用許可證號：SYXK（滬）2022-0029。大鼠均在溫度 （22±2）^°C 、相對濕度50%～60% ，人工光照黑暗循環(huán) 12h/12h 的SPF級環(huán)境下進行飼養(yǎng)，大鼠自由攝取食水，適應性飼養(yǎng)7d后進行實驗。本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準[編號：（2024）倫審第（35）號]。

1.1.2主要試劑與儀器黃連素（溶于 0.5% 羥甲基纖維素鈉溶液，北京索萊寶科技有限公司）；卵清蛋白（OVA，美國Sigma-Aldrich）；氫氧化鋁凝膠（杭州萬景新材料有限公司，國藥準字H33021601，規(guī)格 100g） ;白細胞介素（IL）-4、IL-13、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；抗體試劑包括PI3K抗體（美國CST）、 -PI3K抗體（英國Abcam）、Akt抗體（美國Santa Cruz Biotechnology） ??p-Akt 抗體（美國BDBiosciences）和NI 抗體（美國CST）。Westernblot電泳儀（美國伯樂生物醫(yī)學有限公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯）；低溫高速離心機（山東博科保育科技股份有限公司，TGL-16E）；質(zhì)譜流式儀（美國富魯達公司，PLR-386）；紫外可見分光光度計（南京貝登醫(yī)療股份有限公司，UV-5100型）；自動脫水機（德國徠卡公司，ASP300S）；石蠟包埋機（德國徠卡公司，HistoCoreAcadiH）;恒溫培養(yǎng)箱（上海?，敼荆珼PX.9082）。

1.2實驗方法

1.2.1構(gòu)建AD模型（1）制備OVA混懸液： 100μg 0VA 粉末與 2mg 氫氧化鋁凝膠混合，加入無菌生理鹽水或?qū)Ｓ镁彌_液，經(jīng)渦旋震蕩制備成均質(zhì)穩(wěn)定混懸液。（2）腹腔注射致敏：取40只大鼠進行建模，將大鼠腹部朝上固定，腹腔注射100μg0VA 混懸液，觀察大鼠的反應，若出現(xiàn)嚴重的過敏反應或其他異常情況，及時給予抗過敏藥物或進行急救。（3）制備 1% OVA溶液：取適量OVA粉末，用無菌生理鹽水或特定的溶劑充分溶解后制成 1% 的OVA溶液。（4）背部涂抹激發(fā)：

于首次致敏后的第15天暴露大鼠背部皮膚并使用無菌棉簽均勻涂抹 1%OVA 溶液 （50μL/cm²） ，每日1次，連續(xù)7d。（5）實驗監(jiān)測與評估：記錄每日進食量、飲水量及搔抓頻率，致敏24h 后檢測血清IgE水平，處死大鼠后取其皮膚組織進行HE染色，觀察真皮層炎性細胞浸潤及淋巴濾泡壞死等病理特征。建模成功需同時滿足如下3項標準： 10min 持續(xù)搔抓超過25次、血清 IgEgtrsim200μg/L 和組織病理學典型改變。

1.2.2分組與給藥方法采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為空白組、對照組、實驗組，每組20只?？瞻捉M僅予以適應性喂養(yǎng)，不做任何處理；對照組、實驗組大鼠在成功構(gòu)建AD模型后分別給予低（ 50mg/kg 高 200mg/kg） 劑量黃連素灌胃治療，7d內(nèi)給藥3次，干預14d，共給藥6次。

1.2.3ELISA法檢測血清IL-4、IL-13、TNF- σ_?∝ 水平分別于干預1d、7d和14d時，采集大鼠空腹尾靜脈血，以 3200r/min 離心 10min （半徑 10cm 后獲取血清，采用ELISA法測定血清IL-4、IL-13、TNF- α_∝α_∝ 水平，按照試劑盒說明進行操作。

1.2.4Westernblot 檢測 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、 NF-κB p65 蛋白表達水平于干預1d、7d和14d時，按照1.2.3中的方法分別獲取血清，提取血清中蛋白，使用BCA法檢測蛋白質(zhì)量。蛋白樣本經(jīng)過 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，按凝膠面積以 0.65mA/cm² 恒流電轉(zhuǎn)移 1.5h ，將蛋白自凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用 5% 脫脂奶粉封閉膜，2h后在膜上加入1：1000 稀釋的兔抗人PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- κB p65，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入 1：2000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，孵育 1.5h ，使用ECL化學發(fā)光試劑盒對膜進行顯影，并分析蛋白灰度值，以 β -actin作為內(nèi)參，實驗重復3次。

1.2.5HE染色觀察大鼠皮膚組織病理變化干預14d后，分別對各組大鼠背部皮膚進行圖像采集以觀察皮膚狀態(tài)，并切取皮膚病變組織樣本。樣本經(jīng) 10% 中性福爾馬林緩沖液固定 24～48h 后，依次進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋處理，制備 3～5μm 厚切片。采用HE染色法進行病理分析，具體流程包括：切片脫蠟復水、蘇木精染色 5min 、鹽酸乙醇分化、伊紅復染 2min ，最后經(jīng)梯度乙醇脫水及二甲苯透明處理，置于光學顯微鏡下（ ×200 觀察組織病理學變化。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù) 標準差 表示，不同時點多組間比較采用重復測量設(shè)計的方差分析。 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.13組血清炎性因子水平比較3組大鼠干預不同時點血清IL-4、IL-13、TNF- σ?α∝ 水平差異均有統(tǒng)計學意義，且組間與干預時間存在交互效應（ （Plt; 0.05）。干預 1d，7d，14d 時，對照組和實驗組血清IL-4、IL-13、TNF- ∝ 水平均高于空白組 （Plt;0.05） 。干預1d時，實驗組血清IL-4、IL-13、TNF- 水平與對照組差異均無統(tǒng)計學意義（ （Pgt;0.05 ；干預 7d 、14d時，實驗組血清IL-4、IL-13、TNF- σ_∝ 水平均低于對照組 （Plt;0.05 ，見表1。

2.23組大鼠PI3K ?p? -PI3K、Akt、p-Akt、NF- κB p65蛋白表達水平比較建模后干預不同時點3組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- κB p65蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義，且組間與干預時間存在交互效應 （Plt;0.05 ）。干預1d時，對照組和實驗組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、 蛋白表達水平均高于空白組 （Plt;0.05 ，實驗組各蛋白表達水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義（ 。干預7d、14d時，對照組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB p65蛋白表達水平均高于空白組 （Plt;0.05） ；實驗組除干預7d時Akt及干預 14d 時 -PI3K、NF- κB p65蛋白表達水平與空白組差異無統(tǒng)計學意義外，其余蛋白表達水平均高于空白組 （Plt;0.05） ；實驗組各蛋白表達水平均低于對照組 （Plt;0.05 ，見表2。

2.33組大鼠皮膚組織的病理變化治療14d時，皮膚組織病理檢查結(jié)果顯示，空白組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，表皮層薄，角質(zhì)層正常，無炎性細胞浸潤；對照組和實驗組大鼠皮膚組織出現(xiàn)明顯的病理改變，表皮層增厚，角質(zhì)層過度角化，棘層肥厚，真皮層有大量炎性細胞浸潤；與對照組相比，實驗組大鼠皮膚組織的病理損傷明顯減輕，表皮層厚度、角質(zhì)層角化程度、棘層肥厚程度以及炎性細胞浸潤程度均有所改善，見圖1、2。

3討論

AD作為一種慢性炎癥性皮膚病，其病理機制與免疫系統(tǒng)異?；罨芮邢嚓P(guān)[6]。PI3K/Akt/NF- σ_κB 信號通路通過調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡及炎癥反應，在AD病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此被視為潛在治療靶點[]。黃連素可通過抑制PI3K/Akt/NF- σ_κB 信號通路發(fā)揮抗炎作用，如一些AD動物模型的研究結(jié)果表明，黃連素能夠顯著減輕皮膚炎癥反應，降低促炎細胞因子表達水平，并改善皮膚病理改變；其作用機制可能包括直接抑制PI3K活性，進而阻斷Akt磷酸化及 NF-κB 核轉(zhuǎn)位，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[8-9]。此外，黃連素還可能通過抑制Th2細胞活化、調(diào)控細胞因子釋放等其他信號通路，在AD治療中呈現(xiàn)多靶點作用特性[10]。目前關(guān)于黃連素治療AD的研究仍處于探索階段，其臨床療效和安全性尚需通過系統(tǒng)的實驗研究與臨床試驗進一步驗證，相關(guān)分子機制也有待深入闡明。

有研究表明，AD的發(fā)生與多種炎性因子相關(guān)，其中血清IL-4、IL-13和TNF- α_?∝ 水平升高是其重要特征[]。本研究結(jié)果顯示，，黃連素能夠顯著改善AD大鼠的皮膚癥狀，降低血清炎性因子IL-4、IL-13和TNF- α_?∝ 水平，減輕皮膚組織病理損傷，與既往研究結(jié)果一致。IL-4和IL-13主要由Th2細胞分泌，可通過促進B細胞產(chǎn)生IgE介導過敏反應和炎癥進程[12];TNF- σ?α∝ 則作為關(guān)鍵促炎因子，進一步加劇炎癥反應。黃連素能夠顯著降低這些炎性因子的水平，其機制可能包括：抑制炎性細胞活化及炎性因子釋放，調(diào)節(jié)免疫細胞功能，并減少Th2細胞分化與IL-4、IL-13的分泌[13-14]

PI3K/Akt/NF- κB 信號通路在炎癥反應中起關(guān)鍵調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，對照組AD大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- σ_κB p65蛋白表達水平均高于空白組，而實驗組經(jīng)黃連素干預14d后，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- κB p65蛋白表達水平明顯低于對照組。提示在AD中，PI3K/Akt/NF- κB 信號通路被異常激活，PI3K激活后可磷酸化Akt并促使其活化，活化的Akt進一步激活下游 NF-κB ，最終促進炎性因子表達及炎癥反應增強[15]。而黃連素可通過抑制PI3K活性，減少Akt磷酸化，從而阻斷NF-κB 的激活過程[16]。 NF-κB 是調(diào)控炎性因子基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，黃連素通過降低 NF-κB p65表達水平，可直接減少炎性因子的產(chǎn)生[17-18]。此外，黃連素對AD大鼠皮膚癥狀的顯著改善及組織病理損傷的減輕作用，可能與其調(diào)節(jié)血清炎性因子水平和PI3K/Akt/NF- κB 信號通路相關(guān)蛋白表達有關(guān)[19]。血清炎性因子水平的降低可有效緩解皮膚瘙癢、紅斑、丘疹等炎癥癥狀；而抑制PI3K/Akt/NF- σ_κB 信號通路的激活可減少炎性因子基因表達，降低炎癥反應程度，從而減輕皮膚組織的病理損傷。另有研究表明，黃連素可能通過清除氧自由基、緩解氧化應激進一步改善皮膚組織的損傷[20]

綜上所述，黃連素對AD具有一定治療作用，其可降低血清IL-4、IL-13、TNF- ∝ 水平及PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- σ_κB p65蛋白表達水平，其機制可能是通過抑制 PI3K/Akt/NF-κB 信號通路來發(fā)揮作用的。黃連素具有來源廣泛、價格低廉、不良反應小等優(yōu)點，為AD的治療提供了新的思路和方法，未來的研究可以進一步深入探討黃連素的作用機制，優(yōu)化給藥方案，提高治療效果。

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