關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌；液體活組織檢查；腫瘤細(xì)胞，循環(huán)；循環(huán)腫瘤DNA；細(xì)胞外囊泡基金項(xiàng)目：國家“十三五\"科技重大專項(xiàng)（2018ZX10302204-001-003）

Abstract：Hepatocelularcarcinomaisoneof the mostcommoncancers，andduetothelackofobviousspecificsymptoms inits earlystage，patientsareoftenintheadvancedstageatthtimeofdiagnosisandtendtohaveapoorprognosis.Timelydiagnosisand ffective treatmentintheearlystagecanhelptoprolongthesurvivaltimeofpatients.Liquidbiopsyisanoninvasivetechniquethat canobtain theinformationof tumorbydetectingandanalyzingrelatedbiomarkers，including circulating tumorcels，circulating tumorDNA，andextracelularvesicles，therebycontributing toearlydiagnosis，molecularpathologicaltyping，andprognosis prediction.Thisarticlereviews theresearchadvancesin theaplicationofliquid biopsyinthediagnosisandtreatmentof hepatocellular carcinoma.

KeyWords：HepatocellularCarcinoma;；LiquidBopsy；eoplasticCels，irculating；CirculatingTumorDA;ExtracellarVesicles Research funding：National Scienceand Technology Major Projects of the 13^th Five-Year Plan（2018ZX10302204-001-003）

原發(fā)性肝癌是癌癥死亡的第二大常見原因[1]，其中肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型[2]。HCC存在多種風(fēng)險(xiǎn)因素，主要包括HBV、HCV、酒精、代謝紊亂（糖尿病、血脂異常、過度肥胖等）非酒精性脂肪性肝病、黃曲霉素等[3]，通常的發(fā)展順序是肝損傷、慢性炎癥、肝纖維化、肝硬化，繼而演變?yōu)镠CC[4]。目前HCC早期檢測的準(zhǔn)確性并不理想，液體活檢作為一種新的檢測方法，有助于幫助解決這一臨床問題，同時(shí)對治療效果評估和預(yù)后判斷有一定臨床價(jià)值。液體活檢是指對體液中（通常是血液）循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumorcell，CTC）循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)microRNA和細(xì)胞外囊泡（extracellularvesicles，EV）進(jìn)行檢測分析，從而獲取患者腫瘤有關(guān)信息，用以輔助診斷治療[5]。與傳統(tǒng)手術(shù)或穿刺活檢相比，液體活檢有副作用小、操作簡便、方便重復(fù)檢測、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。

1CTC、ctDNA、EV的特性及其檢測方法

1.1CTCCTC是從原發(fā)性實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移到外周血或淋巴系統(tǒng)，最終在血液、骨髓、淋巴結(jié)或其他健康器官中生長的腫瘤細(xì)胞，是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要原因，可以被生動地描述為“腫瘤的種子”。CTC至今有多種定義，CellSearch系統(tǒng)的定義被認(rèn)定為當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)：CTC是血液中表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子（epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM）表達(dá)細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）8、18和/或19、白細(xì)胞特異性抗原45陰性且直徑大于 4μm 的細(xì)胞。分析血液中CTC的數(shù)量、蛋白表達(dá)、基因序列等可以獲取腫瘤的病變信息。CTC檢測主要包括從蛋白、染色體、DNA和RNA水平實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的定性分析。

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到外周血發(fā)生在腫瘤發(fā)展的每個(gè)階段。因此，CTC可以作為疾病早期診斷和監(jiān)測復(fù)發(fā)的重要標(biāo)志物。由于CTC在血液中的含量非常低（每毫升幾百個(gè)）并且存在的半衰期較短 （1～2.4h） ，長期以來研究一直受到阻礙。近年來，隨著技術(shù)的提高，CTC的分離和濃縮技術(shù)取得了巨大進(jìn)步。根據(jù)CTC的物理性質(zhì)和生物性質(zhì)可將富集方法分為兩種類型?；谖锢硇再|(zhì)的方法包括設(shè)計(jì)特定尺寸的過濾器件、Ficoll離心法、雙向電泳技術(shù)等[7]?；谏飳W(xué)特性的技術(shù)依賴于抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，可以分為免疫磁珠法和利用微流控芯片的免疫吸附法，免疫磁珠法又可分為陽性富集法和陰性富集法。EpCAM是CTC純化分離最常用、最重要的抗原，它在血細(xì)胞中不存在，但在上皮來源的非血細(xì)胞中廣泛存在?；贓pCAM的CellSearch系統(tǒng)（使用抗EpCAM涂層的磁珠，從血液中提取CTC，固定、染色和手動計(jì)數(shù)）是基于免疫磁珠法的CTC陽性富集系統(tǒng)，是第一個(gè)通過美國食品藥品監(jiān)督管理局臨床驗(yàn)證的CTC捕獲方法，但是這種方法會錯過很多潛在腫瘤細(xì)胞，尤其在肝癌中，只有一小部分患者 （20%）EpCAM 呈陽性[8]。對于HCC，EpCAM和波形蛋白聯(lián)合GPC3（磷脂酰肌醇蛋白聚糖3）蛋白的分離方案可用于更徹底的CTC分離，該組合方案具有毒性低、特異性強(qiáng)（ 96.94% ）、靈敏度高1 98.12% ）、檢出率高（ 98.64% ）等優(yōu)點(diǎn)，能夠特異、準(zhǔn)確、高效地富集血液中的 CTC^[9] 。使用免疫磁珠的陰性富集法通過去除背景血細(xì)胞來富集CTC。通過上述富集方法處理外周血可以降低血細(xì)胞水平，從而檢測和分析剩余細(xì)胞群。目前CTC的檢測方法主要包括免疫熒光標(biāo)記、RNA原位雜交、熒光定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)等[10]。

1.2ctDNA血漿游離DNA（cellfreeDNA，cfDNA）是血漿中游離存在的DNA，有的來自正常細(xì)胞，有的來自異常細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞），還有部分來自外部（如病毒DNA）]。ctDNA指的是由腫瘤細(xì)胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的DNA。來自壞死腫瘤細(xì)胞、CTC和腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體，它包含著腫瘤細(xì)胞特異性突變的基因信息。

ctDNA只占cfDNA的一小部分 （0.01%～1%） ，并且總是被大量非癌細(xì)胞來源的DNA稀釋，目前無法通過捕獲技術(shù)特異性分離ctDNA，因此檢測腫瘤特異性突變是檢測ctDNA的最有效方法。由于細(xì)胞損傷，癌癥患者的cfDNA水平遠(yuǎn)高于健康個(gè)體，這在化療或放療后尤為明顯;cfDNA的半衰期很短，只有不到 2h^[12] ，這些因素使ctDNA的檢測更加困難。只有檢測cfDNA上的腫瘤特異性相關(guān)特征才能有效地證明ctDNA的存在，例如單核苷酸突變、甲基化變化和癌癥相關(guān)的病毒序列。最近有研究表明一種基于琥珀酰磷乙醇胺的脂質(zhì)體可以在體外抑制單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，從而短暫地增加血液中cfDNA的回收率；或者使用單克隆抗體與cfDNA結(jié)合，從而減慢其被核酸酶降解的速度。上述兩種調(diào)節(jié)體內(nèi)cfDNA清除效率的方法已在小鼠中得到證實(shí)，有希望在臨床應(yīng)用中提高液體活檢的靈敏度和實(shí)用性[13]。

血漿中ctDNA的變化分為定量和定性，前者指ctDNA總濃度，或者指DNA突變。近年來已經(jīng)開發(fā)了許多具有高靈敏度和特異度的方法，包括數(shù)字PCR和二代測序（NGS）用于檢測DNA畸變的先進(jìn)技術(shù)。BEAMing技術(shù)是一種相對靈敏且廉價(jià)的已知突變篩查方法，把PCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合，可以檢測低至 0.01% 頻率水平的突變[14]。雖然基于PCR的技術(shù)有著很高的靈敏度，但該技術(shù)只能檢測有限數(shù)量的突變。為了克服這一問題，NGS測序技術(shù)用于獲得更完整的基因組圖譜，涉及深度測序的方法包括 Safe-SeqS、Capp-Seq、Tam-Seq 和Ampli-Seq等。通過這些技術(shù)檢測出的癌癥基因圖譜可為患者提供個(gè)性化治療[15]

1.3EVEV是指正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放的納米顆粒的總稱。根據(jù)形成過程EV可以大致分為3類：外泌體、微囊泡和凋亡小體[16]。EV的直徑為 40～160nm ，通常被脂質(zhì)雙分子層包裹，內(nèi)含有DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和脂質(zhì)等生物分子。鑒于EV同樣在早期就存在于血液中，分析腫瘤來源的EV可以作為一種診斷早期癌癥的方法。

與CTC和ctDNA相比，EV在數(shù)量上有巨大優(yōu)勢，每毫升血液中有 10⁹ 數(shù)量級，更容易獲得[17]。目前至少有6種不同類型的分離方法，包括：超速離心、過濾法、體積排阻色譜法、沉淀法、免疫親和捕獲法和微流控法，這些方法各有特點(diǎn)和優(yōu)劣，可以單獨(dú)或組合使用，以達(dá)到臨床應(yīng)用所需要的回收率和純度[18]。通過分析EV所包含的miRNA、IncRNA、mRNA、蛋白等分子標(biāo)志物，可以獲取更有特異性的癌癥信息，輔助診斷和治療。例如研究人員通過對EV中RNA測序的方法區(qū)分早期HCC與高危肝硬化人群，受試者操作特征曲線下面積（AUC）達(dá)0.93[19]

CTC、ctRNA、EV源自癌細(xì)胞或癌細(xì)胞裂解后產(chǎn)物（圖1）。CTC攜帶一整套腫瘤細(xì)胞的遺傳信息（包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等），并且與腫瘤的發(fā)生和傳播有密切聯(lián)系，在臨床中有許多潛在應(yīng)用，包括疾病診斷、預(yù)后評估、個(gè)體化治療等。然而由于CTC在外周血濃度低且離體培養(yǎng)困難，對CTC生物學(xué)信息理解尚處起步階段。ctDNA和EV可以攜帶有關(guān)腫瘤的片段化信息，其中EV在體液中有明顯的數(shù)量優(yōu)勢，不過異質(zhì)性限制了其應(yīng)用。由于無法對人類藥物進(jìn)行高通量篩選，ctDNA和EV作為藥物療效的標(biāo)志物未得到充分利用[20]

注：CTC從原始或轉(zhuǎn)移性腫瘤自然脫落后在血液中循環(huán)，是腫瘤的“種子”，可以導(dǎo)致新的致命轉(zhuǎn)移；ctDNA來源于凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞將其片段化的DNA釋放到循環(huán)中；EV由腫瘤細(xì)胞分泌釋放，內(nèi)含有DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物分子。

2液體活檢在HCC中的臨床應(yīng)用

2.1CTC在HCC中的預(yù)后價(jià)值研究表明EpCAM陽性CTC與高AFP水平相關(guān)，并且與血管浸潤相關(guān)，表明EpCAM陽性CTC有潛力成為評估HCC患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。CTC的陽性臨界值尚未形成統(tǒng)一定論，一些研究者將CTC陽性定義為“每 7.5mL 外周血中 CTC?1 或≥2”，一些研究者認(rèn)為“每 7.5mL 外周血中 CTC?5^′ 的癌細(xì)胞活動性較強(qiáng)。毫無疑問的是，CTC陽性的HCC患者總生存期和無病生存期顯著縮短，并且檢測到的CTC越多，患者的預(yù)后越差[21]。

目前EpCAM陽性的CTC已經(jīng)在HCC中深入研究，但是與其他幾乎普遍表達(dá)EpCAM的上皮細(xì)胞腫瘤不同，EpCAM不在成熟肝細(xì)胞中表達(dá)，僅在少部分HCC腫瘤中表達(dá)。因此，可能有EpCAM陰性的HCC細(xì)胞存在于血液中，并且使用EpCAM富集方法無法檢測到，這可能是無法在某些HCC患者中檢測出CTC的原因。非EpCAM陽性富集方法，例如唾液酸糖蛋白或廣譜角蛋白表達(dá)，或根據(jù)細(xì)胞大小富集檢測出的CTC陽性率高于EpCAM檢測法，但是相關(guān)研究數(shù)據(jù)較少，不具有可比性。HCC的最佳CTC富集方法可能需要幾種生物標(biāo)志物聯(lián)合使用[22]。在一項(xiàng)涉及270例HCC 患者的研究中，把DAPI⁺/CD45^-/CK⁺ 細(xì)胞定義為CTC陽性，并在術(shù)前外周血中計(jì)數(shù)。對比術(shù)前腫瘤大?。栃远x為 gt;5cm ）、AFP水平（陽性定義為 gt;20ng/mL 和BCLC分期（陽性定義為gt;A期），CTC數(shù)量與HCC腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)并且可以更好地預(yù)測HCC復(fù)發(fā)（AUC=0.95）[23]

CTC除了用于評估患者預(yù)后之外，還為疾病的演變提供動態(tài)指標(biāo)，也可以為耐藥性等提供線索。NGS技術(shù)可以揭示單個(gè)腫瘤內(nèi)或原發(fā)腫瘤與其轉(zhuǎn)移腫瘤之間的異質(zhì)性。CTC提供了一種新型的非侵入性腫瘤DNA獲得手段，可更方便地用于NGS測序和分子分析。

2.2ctDNA在HCC中的診斷價(jià)值ctDNA在HCC中表現(xiàn)出重要的診斷價(jià)值。近年來，ctDNA的“甲基化修飾”一直是研究熱點(diǎn)。因?yàn)閏tDNA的甲基化表達(dá)發(fā)生在腫瘤早期，所以檢測甲基化表達(dá)可能為早期癌癥診斷提供幫助。每一種細(xì)胞的甲基化修飾都是獨(dú)一無二的，并且在生理或者病理?xiàng)l件下高度穩(wěn)定。因此，識別不同的甲基化修飾可能成為新的HCC診斷工具。例如RAS相關(guān)家族1A基因中啟動子的高甲基化可在 92.5%HCC 患者中檢測到，并可以區(qū)分健康對照組和單純慢性HCV感染群體，總體預(yù)測率分別為 77.5% 和 72.5%^[24] 。因此ctDNA中異常啟動子甲基化可以作為HCC患者的篩查工具，尤其是早期高危人群的篩查。此外，幾個(gè)熱點(diǎn)甲基化基因位點(diǎn)的組合使用可以進(jìn)一步提高靈敏度和特異度。總之，啟動子區(qū)域的高甲基化被公認(rèn)為是癌癥發(fā)生的早期表現(xiàn)，不同腫瘤相關(guān)基因的甲基化在正常組織DNA中存在非常低或不存在，檢測這些甲基化對HCC診斷具有特異性。

cfDNA的定量分析也有一定的臨床價(jià)值。cfDNA水平可以區(qū)分HCC和HCV攜帶者，最佳臨界值為 73.0ng/mL 靈敏度為 69.2% ，特異度為 93.3%^[25] 。如果cfDNA 和 AFP或 α -L-巖藻糖苷酶（ ∝ -L-fucosidase，AFU）聯(lián)合檢測，可以進(jìn)一步提高靈敏度。cfDNA、AFP和AFU在HCC的檢測中無顯著相關(guān)性。cfDNA聯(lián)合AFP或AFU、cfDNA與AFP和

AFU三者聯(lián)合的靈敏度分別為 71.8%.87.2% 和 89.7% ，而單獨(dú)使用cfDNA、AFP和AFU的靈敏度分別為 56.4% 、53.8%和66.7%[26]

2.3ctDNA在HCC中的預(yù)后價(jià)值除了早期診斷外，ctDNA在HCC預(yù)后中也發(fā)揮重要作用。非靶向ctDNA、cfDNA的水平始終與總生存期和無病生存期呈負(fù)相關(guān)，有望成為評估HCC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的新指標(biāo)[27]。在一項(xiàng)包括41例HCC患者的研究中，根治性肝臟手術(shù)前ctDNA陽性率為 63.4% ，手術(shù)后ctDNA陽性率下降至 46% ，41例患者中有9例觀察到疾病進(jìn)展伴早期復(fù)發(fā)，中位隨訪時(shí)間為17.7個(gè)月，非復(fù)發(fā)組術(shù)前ctDNA陽性率顯著低于復(fù)發(fā)組，術(shù)后是否復(fù)發(fā)與ctDNA檢測結(jié)果之間存在顯著相關(guān)性[28]

靶向ctDNA檢測可以反映腫瘤的異質(zhì)性，并且可以評估預(yù)后。TP53、CTNNB1和TERT等關(guān)注度較高的突變位點(diǎn)是檢測ctDNA突變的首選目標(biāo)。一項(xiàng)研究使用MiSeq系統(tǒng)檢測相關(guān)突變，發(fā)現(xiàn)在血管浸潤的患者中更容易檢測到存在突變的ctDNA，并且預(yù)期無病生存期更短[29]。需要注意的是，并非所有檢測到的突變均來自腫瘤細(xì)胞，在cfDNA中的突變也會被檢測并且有可能干擾結(jié)果，因此有必要篩選相應(yīng)的樣本以確定突變來源。

2.4EV在HCC中的診斷價(jià)值研究表明，EV參與慢性肝病進(jìn)展、調(diào)節(jié)HCC增殖及HCC血管生成、促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)換、免疫逃逸和復(fù)發(fā)等過程。 Sun 等[30]報(bào)道一種基于HCCEV表面蛋白測定的方法用于檢測早期HCC，該方法通過評估3個(gè)HCCEV亞群（EpCAMCD63、CD147CD63和GPC3CD63）建立評分，區(qū)分早期HCC和肝硬化的AUC為0.95，敏感度為 91% ，特異度為 90% ，靈敏度和特異度顯著優(yōu)于血清AFP，有望幫助識別可治愈階段的HCC并改善患者長期預(yù)后。盡管遵循《國際肝癌協(xié)會肝細(xì)胞癌生物標(biāo)志物開發(fā)白皮書》，但該研究隊(duì)列樣本量較少，很難進(jìn)行精細(xì)的亞組分析，在生物標(biāo)志物對照研究中可能存在潛在偏倚，需要后期更大規(guī)模更深入的研究驗(yàn)證其在臨床中的作用。

2.5治療評估目前對實(shí)體腫瘤治療反應(yīng)的評估主要取決于影像學(xué)測量的腫瘤直徑的動態(tài)變化。但是影像學(xué)監(jiān)測效果不夠敏感，限制了其在治療早期階段的應(yīng)用。液體活檢可以用于評估手術(shù)切除效果，有望在腫瘤直徑明顯變化前幾周預(yù)測腫瘤反應(yīng)[31]。ctDNA的甲基化水平和CTC的數(shù)量在治療后均有降低，可以用于評估手術(shù)切除效果，尤其是在腫瘤血源性播散和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面。

CTC亞型可能與治療反應(yīng)相關(guān)，或可作為肝癌細(xì)胞分子亞型的補(bǔ)充。不同亞型的癌細(xì)胞對不同化療藥物的敏感度不同，例如 pERK⁺/pAkt^- CTC對索拉非尼更敏感[32]。CTC的個(gè)體分析可能具有不同的臨床意義，這將有助于選擇更加個(gè)性化的治療方法并預(yù)測治療結(jié)果。ctDNA中檢測到的突變也可為治療方案選擇提供參考，這種非侵入性檢測方法獲得的腫瘤DNA可以提供癌細(xì)胞基因組圖譜，并在某些方面指導(dǎo)治療。

CTC、ctDNA、EV的產(chǎn)生機(jī)制與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且攜帶大量相關(guān)信息，液體活檢可通過無創(chuàng)方式提供大量基因組和轉(zhuǎn)錄組信息，提示腫瘤間的異質(zhì)性。這和傳統(tǒng)活檢方法相比操作難度低，患者接受度高，更有可能普及并且實(shí)現(xiàn)對疾病的長期監(jiān)測?，F(xiàn)階段研究尚未成熟，與傳統(tǒng)AFP、影像學(xué)等檢查結(jié)果相結(jié)合，可以進(jìn)一步提高靈敏度和特異度。隨著腫瘤基因組學(xué)和分子標(biāo)志物進(jìn)一步發(fā)展，液體活檢技術(shù)有望發(fā)揮更大的作用。

3小結(jié)與展望

總之，液體活檢是一種在癌癥領(lǐng)域非常有應(yīng)用前景的技術(shù)，首先，它可以在腫瘤發(fā)生早期無創(chuàng)性地獲取相關(guān)細(xì)胞或生物分子，通過對生物標(biāo)志物檢測而對HCC高危人群進(jìn)行疾病篩查，結(jié)合影像學(xué)和傳統(tǒng)生化指標(biāo)，對疾病進(jìn)行早期鑒別診斷，進(jìn)一步提高生存預(yù)期。其次，對于接受靶向治療的患者，對腫瘤有關(guān)分子標(biāo)志物檢測可以進(jìn)一步獲得腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性信息，為患者差異化個(gè)性化治療方案的選擇提供依據(jù)，從而提高治療效果并減少副作用。最后，在接受手術(shù)切除治療的HCC患者中，術(shù)后CTC、ctDNA的檢測可以在治療效果、預(yù)后判斷和監(jiān)測復(fù)發(fā)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

值得注意的是，液體活檢技術(shù)從實(shí)驗(yàn)研究到臨床應(yīng)用仍面臨巨大挑戰(zhàn)。第一，由于CTC、ctDNA以及EV在外周血中的含量較低且半衰期較短，相關(guān)的分離、富集、捕獲技術(shù)尚未成熟，相關(guān)技術(shù)有待進(jìn)一步提高效率。第二，大多數(shù)液體活檢研究缺乏有效性和實(shí)用性的有力證據(jù)，對檢測的靈敏度和特異度存疑，未來各種多中心臨床研究可能會解決這一問題。第三，目前許多研究或是對單一分子標(biāo)志物進(jìn)行對比，或是對幾項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行綜合評定，缺乏簡單的評分標(biāo)準(zhǔn)，通過人工智能進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，有望獲取多項(xiàng)指標(biāo)中的內(nèi)在聯(lián)系，從而制訂客觀可應(yīng)用的評分標(biāo)準(zhǔn)。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李玉龍負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文和最終定稿；張欣欣負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，擬定寫作思路，指導(dǎo)修改論文。

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收稿日期：2024-08-13：錄用日期：2024-12-10本文編輯：劉曉紅

引證本文：ILI YL，ZHANG XX.Research advances in theapplicationof liquidbiopsyinthediagnosisandtreatmentofhepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol， 2025，41（6）：1194-1198.

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