中圖分類號：Q756 文獻標識碼：A 文章編號：1674-0033（2025）04-0052-06

Abstract：Inorder to investigate thecharacteristicsof polyadenalation （poly（A））and alternative polyadenalation （APA） in the genome of Chlamydomonas reinhardtii， 23 535 153 RNA-Seq reads with poly（A） tails were collected from the high throughput illuminadata，and then 256771 unique poly（A）sites without redundant and 97 479 PACs （poly（A） clusters） were collected based on the reads. It is illuminated that 55.67% and 28.48% （20 unique poly（A） sites were detected in 3^′ -UTR and intergenic regions，respectively. Single nucleotide profile showed adenine （A） peak （52.20 % ）around the poly（A） sites，and guanine （G， 33.72% averagely） was obviously higher than other three， UGUAA （19.76 % ，Z-score=32.88） was a dominant poly（A） signal in NUE region. The APA genes were up to 67.78% in C.reinhardti.Furthermore，GO analysis demonstrated that the genes mainly involved in molecular function and biological proces，and revealed the genes participated in the formation of multiple protein isoforms by changing receptor activity and ncRNA metabolic process.

Key words：Poly（A） signals; alternative polyadenylation; Ilumina data; GO analysis；Chlamydomonas reinhardtii

信使RNA（mRNA） 3^′ 端的形成包括剪切和多聚腺苷酸化（polyadenylation，poly（A））過程，該過程是真核生物轉錄后加工的關鍵步驟。多聚腺苷酸化在真核生物中發(fā)揮著重要作用，包括保護成熟mRNA免受意外降解、mRNA胞外轉運和翻譯元件的識別，并且 3^′ -末端的形成也是轉錄終止不可或缺的過程[-2]。

通常認為AAUAAA是一個廣泛存在于真核生物中的poly（A）信號[2-3]，而研究表明團藻（Volvoxcarteri）和萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）的alpha2-和beta2-微管蛋白編碼基因中的poly（A）信號為UGUAA4。Shen等發(fā)現(xiàn)16952條EST序列中的 52% 有UGUAA信號，且4057個注釋基因中的 33% 為選擇性聚腺苷酸化（alternativepolyadenylation，APA）。在真核生物中，許多基因有一個以上的poly（A）位點，這種特異的位點會導致一個基因產生多個不同的mRNA，這種現(xiàn)象稱為選擇性聚腺苷酸化（即APA，并已被證明在基因表達調控中起著至關重要的作用[-2]。而測序深度的提高能揭示更多的APA基因，水稻中采用基于大規(guī)模并行測序（MPSS）和基于合成的Illumina測序技術，分別獲得 47% 和 82% 的APA支持基因。

綠藻中的萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）是現(xiàn)代細胞生物學中常用的一種模式生物，主要進行光合作用、纖毛和細胞周期等方面的研究，其核基因組約為 100Mbp ，并具有高的GC含量（約 62% ）、密碼子偏向等特點。本研究利用IIlumina高通量測序數(shù)據(jù)，探究萊茵衣藻中poly（A）信號、APA程度及可能的生物學功能，這將有助于對poly（A）信號的變化及其潛在功能的認識，為深化萊茵衣藻基因調控提供潛在的借鑒。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)獲取

萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii，簡稱衣藻）屬于綠藻門團藻目衣藻屬，是單細胞單核光合藻類。本研究使用萊茵衣藻IIlumina高通量轉錄組數(shù)據(jù)、全基因組數(shù)據(jù)和基因注釋數(shù)據(jù)進行研究。

1.2方法

1.2.1聚腺苷酸化位點鑒定

登錄DNAnexus （https：//www.dnanexus.com/） ，下載衣藻Illumina轉錄組數(shù)據(jù)；使用 scopE++ 工具（http：//code.google.com/p/scopeplusplus/）對poly（A）位點進行標識，長度至少為 15nt. 純度為 95% ；然后使用Helicos將帶有有效poly（A）尾的reads映射到基因組，從而獲得單個poly（A）位點。為了避免位點的異質性，本研究基于密度理論和約束理論的聚類算法，對相鄰的poly（A）位點進行迭代聚類。為了獲得高質量的聚類poly（A）位點（poly（A）clusters，PACs），使用至少有3條reads支持的位點進行聚類。

1.2.2聚腺苷酸化位點基因組定位及結構分析

從Phytozome（http：//www.phytozome.net）數(shù)據(jù)庫下載衣藻基因組序列及基因注釋（Geneannotaion v5.6） 數(shù)據(jù)。并結合基因注釋信息，可將位點定位到基因內或基因間的具體位置。

聚腺苷酸化信號分析：由于poly（A）位點附近有明顯的聚腺苷酸化信號，故從衣藻基因組截取每個poly（A）位點上游100堿基到下游50堿基的序列，從而獲得位點的單核苷酸圖譜（即堿基組成），每個位點位置定義為-1，上游為負，下游為正[]。利用 SignalSleuth2軟件[搜索 poly（A）信號，并使用RSAT工具（Regulatory SequenceAnalysisTools）對獲得的信號進行顯著性檢驗，而統(tǒng)計分析是基于馬爾科夫模型的Z-score進行。

1.2.3APA基因鑒定及GO分析

至少有兩個PACs位點支持的基因定義為APA基因，而非APA基因應該只有一個PAC。為了研究APA 基因的功能，本研究從JGI（https：//genome.jgi.doe.gov/）下載了衣藻的GOannotation文件，然后使用GOEAST（GeneOntology EnrichmentAnalysisSoftwareToolkit）工具確定富集的GO項及其統(tǒng)計顯著性（p-value） [2]。

2結果與分析

2.1衣藻基因中poly（A）位點的收集和分析

從下載的Illumina轉錄組數(shù)據(jù)中，找到了22372354個帶有poly（A）尾巴的reads，然后使用工具比對，獲得195266個poly（A）位點，經聚類后得到88304個高質量的PACs。

對照衣藻基因組注釋v5.6，本研究發(fā)現(xiàn)約55.67% 和 28.48% 的特異poly（A）位點分別分布在3^′ -UTR區(qū)和基因間隔區(qū)，其余的 15.85% 分布在5^′ -UTR、編碼區(qū)（CDS）和內含子區(qū)域。

2.2衣藻單核苷酸圖譜

一般來說，植物中有三組不同的poly（A）信號區(qū)：poly（A）位點及其周圍序列稱為剪切元件（cleavageelement，CE），poly（A）位點的近上游元件區(qū)（near upstream element，NUE），以及 poly（A）

位點的遠上游元件區(qū)（farupstreamelement，F(xiàn)UE）。

圖1為衣藻聚腺苷酸化位點的單核苷酸圖譜，顯示在poly（A）位點（-1位置）A堿基有明顯的峰 （52.20%） ；同時，在-25＼～-10為NUE區(qū)，可以看出有U和A峰及C和G谷；在整個圖譜中（-100＼～50），G堿基（平均 33.72% 明顯高于其他三個，說明這是聚腺苷酸化信號的重要特征，這與Shen等的研究結果基本一致。

2.3NUE區(qū)的聚腺苷酸化信號

聚腺苷酸化的識別信號主要存在于NUE區(qū)（-25～-10）^[1] ，因此使用SignalSleuth2軟件獲得衣藻NUE區(qū)的聚腺苷酸化信號組成，見表1。結果顯示，GGGGG的頻率最高 （24.78%） ，但其Z-score過低沒有顯著性，故不會是衣藻的聚腺苷酸化識別信號。五堿基信號UGUAA在NUE區(qū)域具有非常高的顯著性（三階馬爾可夫模型Z-score為32.88）和高頻率 （19.76% ，富含G的五堿基信號GUGGG、GGUGG、GAGGG也具有較為顯著的頻率（大于 8% ）和Z值（大于18，見表2。

2.4衣藻中的APA基因及其功能

利用最終得到的88304個高質量的PACs及17113個衣藻基因，圖2分析了不同基因所擁有的PACs的統(tǒng)計占比。由圖2可見，高達26.88% 的基因有不少于5個PACs，而 16.17% 的基因未有任何PACs位點，依據(jù)本研究的數(shù)據(jù)衣藻總的APA基因高達 67.78% 。

為探究APA基因的功能，本研究選取至少含有5個PACs支持的基因進行GO分析。表3列出了統(tǒng)計顯著性最高的GO功能，結果顯示衣藻APA基因主要涉及分子功能和生物過程調控，主要包括受體活性、非編碼

RNA代謝過程、絲氨酸肽酶活性、絲氨酸水解酶活性、碳水化合物衍生物代謝過程等。這些GO功能揭示衣藻APA基因參與多樣蛋白異構體的形成，并在此過程中參與相關的作用。

3討論與結論

3.1Poly（A）位點在基因組中的分布

基于衣藻基因組注釋 v5.6 ，本研究發(fā)現(xiàn)約28.48% 的特異poly（A）位點位于基因間區(qū)。這些位于基因間區(qū)的poly（A）位點可能來自未注釋或未發(fā)現(xiàn)的基因，或者暗示存在新的未檢測到的聚腺苷酸轉錄本。Shen等5使用EST數(shù)據(jù)僅獲得16952個poly（A）位點，而本研究使用高通量Illimina測序獲得195266個poly（A）位點，并經聚類后得到88304個高質量的PACs，說明測序深度與獲得的poly（A）位點數(shù)量有極大的正相關性。

不同生物的單核苷酸圖譜和poly（A）信號具有明顯的差異，而本研究獲得的衣藻的結果與文獻[5]和文獻[10]的研究結果均基本一致。在衣藻poly（A）位點上下游區(qū)域（-100＼～50），堿基G含量明顯高于其他三個（除了-1位置），這可能與衣藻基因組堿基構成有關；衣藻基因組中GC含量高達 63.45% ，明顯高于其他多細胞生物。類似現(xiàn)象也存在與人的基因組中，由于人類基因組富含AT堿基，通過直接RNA測序技術（DirectRNASequencing，DRS）發(fā)現(xiàn)NUE區(qū)的poly（A）信

3.2衣藻的多聚腺苷酸化特征

本研究利用Illimina高通量數(shù)據(jù)及新版本的衣藻基因組注釋文件（v5.6，發(fā)現(xiàn)衣藻總的APA高達 67.78% ，而Shen等使用EST數(shù)據(jù)和基因組注釋文件 （v3.1） 報道衣藻中的APA為 33% 。還有研究表明，生物的APA水平極大地依賴于轉錄的數(shù)據(jù)量和基因組注釋的精度，在擬南芥和水稻中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象[614]。

雖然APA涉及的生物學功能及調控機制已發(fā)現(xiàn)于很多植物和動物中[1-2I5-1，然而APA在衣藻基因組中的經試驗驗證的功能仍然較少。Bell等[7發(fā)現(xiàn)衣藻中UGUAA是主要且可能唯一的順式元件，主要指導細胞核中mRNA的多聚腺苷酸化形成，而細胞器中的多聚腺苷酸化主要通過影響葉綠體和線粒體中的核糖體RNA起作用。而衣藻mRNA的 3^′ 端會形成特異的、富含A/U的和富含C（高達 22% 的尾巴，這種前所未有的轉錄后修飾似乎是綠藻門綠藻綱的特有特征8。本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，在衣藻中受體基因、非編碼RNA及蛋白質代謝過程極大地受

APA調控。

本研究通過分析Iumina高通量數(shù)據(jù)，獲得23535153個帶有poly（A）尾巴的RNA-Seqreads，去除冗余后得到256771個特異的poly（A）位點和97479個聚類的位點（PACs）。本研究發(fā)現(xiàn)，約55.67% 和 28.48% 的特異poly（A）位點分布在 3^′ -UTR區(qū)和基因間隔區(qū)。單核苷酸圖譜顯示，poly（A）位點A堿基有明顯的峰 （52.20% ，G堿基（平均33.72% 明顯高于其他三個堿基。近上游元件區(qū)（NUE）有明顯的poly（A）信號UGUAA。衣藻APA基因高達 67.78% ，GO分析顯示這些基因主要涉及分子功能和生物調控過程，揭示衣藻APA基因可能與多樣蛋白異構體的形成有關。本研究通過使用第二代測序技術（Illumina測序）獲得更多的poly（A）位點，并發(fā)現(xiàn)以前沒有被注釋的APA基因。本研究不僅成功揭示了衣藻中更多的poly（A）位點和APA基因，還為深入探究其他生物中的poly（A）信號及APA調控基因表達提供了極具價值的參考。

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