中圖分類號：S572.03文獻標識碼：A

文章編號：1007-5119（2025）03-0001-11

Construction of Molecular ldentification Technology for Cured Tobacco Varieties Based on Box-Behnken Response Surface Method

TIAN Zhen1， LI Yuan2，MAO Jingjing]， REN Min2， XIONG Dang'an1， ZHANG Xingwei2， YIN Yudong1，LI Shaopeng'，LIU Guoxing2*

（1. China Tobacco Jiangsu Industrial Co.，Ltd.，Nanjing 21oo19，China; 2. Institute of Tobacco Research， ChineseAcademy ofAgricultural Sciences，Qingdao，China）

Abstract：Toaddress thesevere DNA degradationincured tobacco leaves，whichhinderssubsequent molecular identification experiments，thisstudycomprehensivelyconsideredfactorssuchasDNAconcentrationqualityextractioneficiencycostn safetyformolecuarmarkeraplications.BasedontheSLSmethod，weconductedsingle-factorexperimentsandemploedaBoxBehnken esponse surface model todetermine the optimal DNA extraction protocol forcured tobacco leaves.Sampleamount， centrifugation time，and water bath duration were used as experimental variables， with DNA concentration and the A₂₆₀/A₂₈₀ ratio as response values.The results showed that the optimal conditions for DNA extraction from cured tobacco leaves were 20mg of sample， 10 minutes ofcentrifugation，and 15 minutes in water bath. Under these conditions，the DNA concentration was 588.16±27.09ng/μL and the A₂₆₀/A₂₈₀ ratio was 1.75±0.03 . These results were consistent with the predictions of Design Expert 11 software， confirming thereliabityoftheoptimizationmethod.MolecularmarkerapplicabilitytestsrevealedthatDNAextractedusingtheotimizedSLS methodieldedclearertargetfragmentpeaks incapilaryelectrophoresisaferPCRamplificationwithSSRandKASPprimers，and distinct genotyping plots wereobtainedbyusing KASPmarkers，demonstrating itsapplicabilityforSSRandKASPmolecularmarker detectioniflue-curedtobacoleaves ofdiferent varieties.The established molecularidentificationsystemcombiningtheoptmized SLSmethodwith13selected SSRprimerpairsefectivelydistinguishedthetestedcuredtobaccovarieties，demonstratingits applicability for cured tobacco cultivar identification.

Keywords： cured tobacco leaf; genomic DNA extraction methods;responsesurface analysis methodology;simple sequence repeat KASP; molecular identification

煙葉生產是煙草行業(yè)發(fā)展的基礎，位于煙草產業(yè)鏈的最前端，是推動煙葉高質量發(fā)展的關鍵。煙葉質量狀況反映了煙葉的綜合指標，影響著卷煙制品的質量及品牌發(fā)展。近年來，卷煙工業(yè)原料出現了質量不穩(wěn)定、品種鑒定不清等現象。僅憑傳統的眼觀、手摸方法難以進行品種區(qū)分，如何高效率地對烤后收購煙葉原料進行精準鑒定，是當前工業(yè)公司亟需解決的難點。分子標記技術現已廣泛應用于烤煙[1-2]、雪茄煙[3-4]、晾曬煙[5]、香料煙[6]、野生煙7]等的指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析中，但上述研究大多以新鮮葉片為材料，而烤后煙葉外觀形態(tài)明顯改變，DNA也發(fā)生嚴重降解，影響后續(xù)PCR等試驗效果，導致以鮮煙葉為材料篩選出的SSR引物不一定適用于烤后煙葉的鑒定[8-10]。因此，亟需建立一種穩(wěn)定性和可靠性高的烤后煙葉基因組DNA提取方法及分子鑒定體系。

目前針對烤后煙葉樣品基因組DNA提取方法主要有試劑盒法和十六烷基三甲基溴化銨（cety-Itrimethylammonium bromide， CTAB）法等[11-13]陸錚錚等[11]比較了3種試劑盒提取的烤后煙葉基因組DNA的純度和濃度，最終推薦使用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒。基于CTAB法，通過優(yōu)化研磨方式、緩沖液使用量、裂解時間、離心轉速、洗滌劑等條件，可改良基因組DNA提取質量[12-13]。十二烷基肌氨酸鈉（SodiumN-Dodecanoylsalco-sinate，SLS）法提取DNA相較于CTAB法所用時間更短、效率更高[14]，不需要加人 β 巰基乙醇等對人體有害的化學試劑，且比試劑盒成本更低，但還未見應用于烤后煙葉DNA提取。

Box-Behnken響應面法是一種基于三水平的二階試驗設計方法，具有試驗次數少、試驗精度高等優(yōu)點，多應用于藥學、化學、食品等領域的活性物質提取、化學合成和純化等過程的工藝優(yōu)化[15-17]。劉珊珊等[18]利用Box-Behnken響應面法對烤鱈魚片基因組DNA的提取條件進行優(yōu)化，獲得了最佳提取條件，DNA質量滿足后續(xù)實時熒光PCR的檢測要求。本研究以提高烤后煙葉基因組DNA濃度和質量為目標，首先確定基因組DNA的提取方法；之后以DNA 濃度和 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值為響應值，初步確定加樣量、離心時間、水浴時間的最佳范圍；再利用Box-Behnken響應面模型對試驗結果進行擬合，確定最佳提取條件；最后，結合引物集構建烤后煙葉分子鑒定技術，對不同品種的烤后煙葉進行分子鑒定驗證，以期為煙葉原料品種鑒別提供技術支持。

1材料與方法

1.1 試驗材料

K326和中煙100的烤后煙葉用于DNA提取方法優(yōu)化試驗。經優(yōu)化后SLS法提取的K326、中煙100和云煙87烤后煙葉基因組DNA用于分子標記適用性檢測。以上材料來源于中國農業(yè)科學院煙草研究所西南試驗基地。用于烤后煙葉SSR分子鑒定的供試材料及其來源見表1。

1.2 基因組DNA提取方法

1.2.1試劑盒法按照AxyPrep 基因組DNA小量試劑盒（Axygen，AP-MN-MS-GDNA-50）說明書提取。1.2.2CTAB 提取法按照吳時璽等[13]方法進行。1.2.3SLS提取法取 50mg 樣品置于 2mL 離心管，裝入鋼珠，液氮冷激后，用打樣器（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，Tissuelyser-48）研磨；加入SLS提取液 （ 100mL0.2mol/L EDTA+100 mL 1 mol/LTris ?HCl+100mL1mol/LNaCl+10gSLS， ，定容至1000mL ） 800μL ，振蕩 2min ；加入酚-氯仿-異戊醇（ V：V：V=25：24：1）800μL ，振蕩 2min 512000r/min 離心 10min ；吸取上清液 600μL 至一新的 1.5mL 離心管，加等體積預冷的異丙醇0 -20° 沉淀DNA； 12000r/min 離心 10min ，棄上清液，用 75% 乙醇洗滌1次，晾干后加 100μL 溶解。

1.3 基因組DNA提取質量檢測

1.3.1基因組DNA完整性檢測（定性）將 5μL 樣品 +1μL 6× Loadingbuffer點入 1% 瓊脂糖凝膠膠孔中，在 1×TAE 緩沖液、 150V 電壓條件下電泳15min ，EB染色后用凝膠成像儀（北京君意東方電泳設備有限公司，JY04S-3E）成像，分析基因組DNA完整性。Marker為GL5000DNAMarker（艾克瑞生物，AG11906）。

1.3.2基因組DNA濃度和純度檢測（定量）利用紫外分光光度計測定基因組DNA的濃度，記錄A₂₃₀ 1 A₂₆₀ 和 A₂₈₀ ，計算 A₂₆₀/A₂₈₀ 和 A₂₆₀/A₂₃₀ 定量檢測數據采用GraphPadPrism9.0軟件進行方差分析，結果均為平均值 ?± 標準差。

1.4基因組DNA提取條件優(yōu)化試驗

基于1.2.3的基因組DNA提取方法，從加樣量、離心時間、水浴時間3方面分別設計單因素試驗進行提取條件優(yōu)化，其他因素不變。加樣量優(yōu)化：

烤后煙葉的加樣量分別為10、20、40、60、 80mg 。離心時間優(yōu)化：加入酚-氯仿-異戊醇并振蕩 2min 后， 12 000r/min 離心6、8、10、 12min 。水浴時間優(yōu)化：在加入SLS提取液并振蕩 2min 后，增加水浴裂解步驟， 60^°C 水浴0、10、20、 30min 。采用以上方法提取的基因組DNA，均按照1.3方法進行定性及定量檢測。

1.5 響應面試驗

基于1.4的試驗結果，以加樣量 （A） 、離心時間 （B） 、水浴時間 （C）3 個影響因素為自變量，以DNA濃度 （Y₁） 和 為響應值，根據軟件DesignExpert11中的Box-Behnken試驗設計原理，進行3因素3水平試驗，根據響應面法分析結果，確定最佳提取條件。

1.6 分子標記適用性檢測

分別以提取方法優(yōu)化前后的K326、中煙100、云煙87烤后煙葉基因組DNA為模板，分別進行SSR[19]和KASP[20]分子標記適用性檢測。SSR標記采用引物PT51378進行毛細管電泳檢測；KASP標記采用表2中引物進行檢測，每個品種重復6次。

1.7烤后煙葉SSR標記篩選及應用

基于田震等[19]和本實驗室前期建立的引物數據庫，以優(yōu)化后基因組DNA提取方法提取的云煙87、K326和中煙100烤后煙葉基因組DNA為模板，通過毛細管電泳技術檢測擴增產物，篩選出主條帶明顯且具有多態(tài)性的引物用于后續(xù)試驗以優(yōu)化后的基因組DNA提取方法提取表1中烤煙品種的烤后煙葉基因組DNA，利用篩選出的引物對其進行PCR擴增，對PCR產物進行毛細管電泳檢測，使用PROSize3.0軟件分析結果，讀出擴增產物的片段大小。使用PowerMarkerV3.25繪制UPGMA聚類分析圖。

2結果

2.1 基因組DNA提取方法確定

如圖1所示，試劑盒、CTAB和SLS三種方法提取的DNA均存在點樣孔周圍發(fā)亮、主條帶不清晰、條帶彌散且拖尾嚴重的情況。

如表3所示，利用CTAB和SLS提取DNA的 A₂₆₀/A₂₈₀ 低于1.8，說明樣品中存在蛋白質和酚類等雜質的影響；3種方法提取DNA的 A₂₆₀/A₂₃₀ 均低于1.8，說明含有多糖、鹽類或有機溶劑等雜質；試劑盒提取的DNA質量顯著高于CTAB和SLS法；CTAB和SLS法提取的DNA濃度顯著高于試劑盒法。

注：M，Marker；K，K326；Z，中煙100，下同。

Note：M，Marker;K，K326;Z，Zhongyanloo，thesameasbelow.

3種方法提取的烤后煙葉DNA均降解嚴重，其中SLS法比試劑盒提取的DNA濃度更高且成本更低，比CTAB法操作簡單且相對更安全。因此，綜合考慮分子標記所需的DNA濃度、質量以及提取效率、成本和安全等因素，選擇SLS法對其關鍵步驟進行優(yōu)化以提高DNA質量，滿足烤后煙葉分子標記檢測要求。

2.2 基因組DNA提取條件優(yōu)化

2.2.1加樣量的確定圖2A中可以看到明顯的DNA主條帶，有輕微拖尾現象，拖尾現象隨加樣量增加而加重。定量分析表明（圖2B）， 20mg 加樣量提取的DNA濃度顯著大于其他處理； 10mg 加樣量提取的DNA濃度顯著小于其他處理；A₂₆₀/A₂₈₀ 在加樣量為10和 20mg 時無明顯差異，之后隨著加樣量的增加呈現逐步下降的趨勢；且DNA濃度和 A₂₆₀/A₂₈₀ 在K326和中煙100之間差異不顯著。綜上，加樣量為 20mg 時提取的DNA濃度最高且 A₂₆₀/A₂₈₀ 也較高，因此以 20mg 為中心點，選加樣量為10、20、 40mg 進行后續(xù)響應面試驗設計。

2.2.2離心時間的確定K326和中煙100在4個離心時間處理后均可以看到明顯的DNA主條帶和輕微的拖尾現象（圖3A）。定量分析表明（圖3B），離心時間在 6～10min 時，K326和中煙100的DNA濃度和 A₂₆₀/A₂₈₀ 均呈上升趨勢， 10min 后趨于平穩(wěn)，離心時間 12min 與 10min 的DNA濃度差異不顯著；在離心 8min 時K326的DNA濃度顯著高于中煙100，其他處理品種間DNA濃度差異不顯著。綜上，選離心時間為8、10、 12min 進行后續(xù)響應面試驗設計。

2.2.3水浴時間的確定由圖4A可見，水浴時間在 0～20min 時有明顯的DNA主帶，但是到 30min 時條帶呈彌散型。定量分析表明（圖4B），隨著水浴時間的增加，DNA濃度呈先上升后下降的趨勢，在水浴 20min 時DNA濃度最高，且此時K326和中煙100的DNA濃度顯著大于其他水浴時間處理;水浴時間為 30min 時， A₂₆₀/A₂₈₀ 比值明顯下降且顯著低于其他處理；K326和中煙100之間結果差異不顯著。綜上，選擇水浴時間為10、20、 30min 進行后續(xù)響應面試驗設計。

2.3Box-Behnken試驗設計及響應面分析

2.3.1Box-Behnken試驗設計根據上述單因素試驗結果設置因素的各個水平（表4）。根據DesignExpert11軟件中的Box-Behnken試驗設計原理，得出17個試驗點用于后續(xù)分析（表5）。

2.3.2方差分析與響應面分析利用DesignExpert11軟件對試驗結果進行分析（表6），分別得到DNA濃度 （Y₁） 和 A₂₆₀/A₂₈₀（Y₂） 與加樣量 （A） 、離心時間 （B） 、水浴時間 （C） 的三元二次回歸方程：

Y=694.9+134.86A-15.91B-11.55C-29.96AB-36.56A C+25.32BC-300.02A²-133.84B²-203.69C²， 三 Y₂=1.72- 0.165A-0.0136B+0.0046C+0.0012AB-0.0249AC+0.055BC-0.079 3A²-0.083B²-0.128C²"。2個模型 p 值均小于0.0001，說明這2個模型的效應均極顯著；失擬項 p 值分別為0.6415和0.1569，均大于0.05，說明試驗的隨機誤差對優(yōu)化試驗結果影響不顯著；DNA濃度模型 R²=0.981 3 人 R_adj²=0.9572 ，A₂₆₀/A₂₈₀"模型 R²=0.9777 ！ R_adj^"2=0.949 ，二者均較為接近，說明2個模型具有較高的擬合精度，可用于預測實際試驗結果。從各因素交互作用的響應面圖可以看出（圖5＼～6），交互作用的顯著性順序為ACgt;ABgt;BC 。因此3因素的主次順序為加樣量 gt; 水浴時間 gt; 離心時間。

2.3.3提取方法最佳參數驗證以DNA濃度和 A₂₆₀/ A₂₈₀ 的最大值為目標，經DesignExpert11軟件得出提取方法的最佳參數條件為加樣量 20.894mg 、離心時間 10.412min 、水浴時間 16.433min ，DNA提取的理論濃度和 A₂₆₀/A₂₈₀ 分別為 601.005ng/μL 和1.728?？紤]到實際操作的可行性，將得出的最佳提取參數調整為：加樣量 20mg 、離心時間10min 、水浴時間 15min 。按照軟件得出的提取方法最佳參數，進行試驗驗證（5次重復），定性分析表明（圖7），5次重復試驗均可以看到明顯的DNA主條帶；定量分析表明，DNA濃度為 588.16± 27.09ng/μL ， A₂₆₀/A₂₈₀ 為 1.75±0.03 ，與軟件預測結果接近，說明該模型與實際試驗結果擬合程度較高，優(yōu)化方法可靠。

2.4分子標記適用性檢測

2.4.1SSR標記適用性檢測毛細管電泳檢測結果表明（圖8），以優(yōu)化前SLS法提取的DNA為模板，擴增出來的目的片段熒光值極低、出峰不明顯；而利用本試驗優(yōu)化后的SLS法提取的DNA為模板，可以擴增出明顯的目的片段。因此優(yōu)化后SLS法提取的DNA可用于SSR分子標記檢測。

2.4.2KASP標記適用性檢測KASP標記檢測結果表明（圖9），以優(yōu)化前SLS法提取的DNA為模板，基因分型圖中有很多信號點飄離，信號圖較散，未能成功分型；以優(yōu)化后SLS法提取的DNA為模板得到的分型圖可以將供試材料明顯分型。因此優(yōu)化后SLS法提取的DNA可用于KASP分子標記檢測。

2.5不同品種烤煙烤后煙葉SSR分子鑒定

在前人研究結果的基礎上，本研究從50對SSR引物中篩選出13對多態(tài)性高、主條帶明顯且雜帶較少的SSR引物（表7）。用優(yōu)化后SLS法提取表1中煙葉樣品基因組DNA，利用表7中的SSR引物進行PCR擴增和毛細管電泳檢測。結果表明（圖10），以烤后煙葉DNA為模板可以擴增出目的片段；但同一烤煙品種，以烤后煙葉基因組DNA為模板的PCR產物熒光值普遍低于鮮煙葉基因組DNA。聚類分析結果表明（圖11），來源不同的同一烤煙品種均聚為一類。以上結果表明，表7中的13對引物及本研究所確定的優(yōu)化后SLS法可應用于不同烤煙品種的烤后煙葉鑒定。

3討論

本研究分別采用試劑盒、CTAB、SLS三種方法提取烤后煙葉基因組DNA，結果均存在不同程度的降解與雜質污染，這與煙葉烘烤過程導致DNA鏈斷裂及多糖、多酚等代謝產物增加有關[12]。煙葉基因組DNA的降解始于烘烤的干筋期，在烤后煙葉中則降解非常嚴重[21-23]。相較于CTAB 法，SLS法操作更簡單且得到的基因組DNA濃度更高，但SLS法提取產物所含小分子鹽類、多糖等雜質偏多[14]。因此本研究借助Box-Behnken響應面法優(yōu)化SLS法中的加樣量、離心時間、水浴時間這3個試驗步驟，以提升產物質量。結果發(fā)現，隨著加樣量的增加，DNA濃度呈現先上升后下降的趨勢，在加樣量為 20mg 時達到最大值。肖欽之等[24]利用CTAB、試劑盒等方法得出在樣本量為 60mg 時DNA濃度最高。這可能是由于DNA提取時用到的裂解液不同，導致裂解效率有所差異。CTAB法中采用水浴裂解來破壞細胞壁，使內部DNA裸露出來，因此本試驗增加了水浴裂解步驟并對水浴時間進行了進一步研究，結果發(fā)現，水浴 20min 可以提高DNA得率，但隨著水浴時間的增加，DNA質量也有所下降，這可能是因為烤后煙葉的細胞結構本身比較脆弱，長時間水浴會導致DNA降解，雜質增多，與前人得出的結論相同[12-13]。

SSR分子標記具有穩(wěn)定性高、重復性好、操作簡單且成本較低等優(yōu)點，廣泛應用于煙草種質資源鑒定、遺傳多樣性分析等方面的研究，多種農作物基于 SSR標記法制定了品種鑒定技術規(guī)程[25-28]。但是，相對于新鮮煙葉，烤后煙葉提取的基因組DNA均存在不同程度的降解，從而影響后續(xù)的PCR反應。因此以鮮煙葉為材料篩選出的SSR引物不一定適用于烤后煙葉的鑒定[10]。肖欽之等[24]采用非液氮輔助的CTAB法提取烤后煙葉基因組DNA并進行了SSR引物驗證，經瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現，以烤后煙葉為模板擴增出的條帶明顯減少，但大多數與新鮮煙葉的主條帶是一致的，極個別條帶不一致。本研究在前人篩選出來的SSR引物的基礎上，利用烤后煙葉DNA進行復篩，最終從50對引物中篩選出13對具有多態(tài)性且主帶明顯的SSR引物，可將供試的5個烤煙品種進行有效區(qū)分，從而為烤后煙葉原料的品種鑒定提供參考。本研究優(yōu)化的SLS法提取的烤后煙葉基因組DNA也可用于KASP分子標記檢測，因此下一步可對KASP標記進行篩選，形成一套成熟、可靠、高效的烤后煙葉原料分子鑒定技術體系，實現從田間管理到收購采樣全流程跟蹤，為原料質量的穩(wěn)定性和可靠性提供保障。

4結論

基于加樣量 20mg 、離心時間 10min 、水浴時間 15min 的SLS法提取的烤后煙葉基因組DNA濃度高、質量較好，可用于不同烤煙品種的SSR和KASP標記檢測。優(yōu)化后的SLS法及篩選出的13對SSR引物構建的烤后煙葉分子鑒定技術體系，可用于不同品種烤后煙葉的品種鑒定。

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