中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）05-0082-08

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.012

Purification， Characterization and Bioactivity Exploration of Extracellular Polysaccharides from Bacillus velezensis

LIANG Yue-qi， ZHANG Yu-jiao，DAI Yi-wei， DONG Liang，LIN Xin-ping， ZHANG Su-fang*

（National Key Laboratory of Marine Food Processing and Safety Control，National Engineering Technology Research Center of Seafood，Collaborative Innovation Center for Key Technology of Seafood Deep Processing Co-constructed by Liaoning Province and Ministry of Education， School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University， Dalian 116034，China）

Abstract： The antibacterial Bacillus velexzensis R2 isolated from northeast soybean paste is used as the researchobject，the extracelular polysaccharides are extracted by fermentation culture，the extracelular polysaccharide component EPS BV-1 from B .velezensis is obtained by purification technology of DEAE-Cellulose 52 ion exchange column，and its structure is characterized.The molecular weight of the extracellular polysaccaride EPS BV-1 is 39.4kDa ，which is composed of glucose，mannose，rhamnose and galactose，presents as β pyranose form，has three-dimensional helical structure and a compact cellular network structure microscopically，and represents a kind of extracelllar polysaccharide with new-type structure. The results of in vitro antibacterial and antioxidant tests show that EPS BV-1 shows excellent antibacterial and antioxidant activities. At ?1mg/mL concentration，the scavenging rate of ABTS radical reaches 28.37% and the scavenging rate of hydroxyl radical is 33.19% . In conclusion，the new-type extracellular polysaccharide and its producing strain B.oelezensis R2 not only provide important references for the improvement of traditional fermented food northeast soybean paste and the development of new products，but also provide a scientific basis for the optimization and improvement of fermented condiments.

Key words： northeast soybean paste;antibacterial substances； extracellular polysaccharide； structural analysis;antioxidant activity

傳統(tǒng)東北大醬采用大豆為基礎(chǔ)原料，是利用環(huán)境微生物的自然發(fā)酵過(guò)程形成的調(diào)味品，具有風(fēng)味獨(dú)特、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)[]。大醬是在露天環(huán)境下自然發(fā)酵而成，發(fā)酵過(guò)程較復(fù)雜，涉及多種微生物的協(xié)同作用[2]。傳統(tǒng)大醬的發(fā)酵利用高鹽濃度限制雜菌污染，但高鹽食品不利于人體健康；而低鹽發(fā)酵又容易導(dǎo)致腐敗菌和致病菌污染，故在低鹽發(fā)酵條件下通過(guò)回添能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的菌株，可有效解決這一生產(chǎn)矛盾。

傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品研究主要關(guān)注抗菌肽或抗菌膜的作用，忽略了微生物胞外多糖（extracellularpolysaccharides，EPS）也具有抑菌活性。Zhang等[3在中國(guó)東北地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品大醬中篩選出一株貝萊斯芽孢桿菌，其產(chǎn)生的胞外多糖可作為生物絮凝劑。EPS是微生物重要的代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性[4]，部分細(xì)菌胞外多糖可作為抑制病原菌生物膜、抗氧化劑的替代品應(yīng)用于食品行業(yè)[5。也有研究表明，微生物EPS具有較好的抗氧化能力，能減輕自由基等對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，蔡淼等從傳統(tǒng)酒曲中分離出的高產(chǎn)胞外多糖的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌具有體外抗氧化活性。

基于此，本研究以從大醬中篩選保藏的一株能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）R2為研究對(duì)象，對(duì)其胞外多糖的粗制品進(jìn)行了純化和結(jié)構(gòu)表征，研究了該EPS的構(gòu)型、化學(xué)鍵結(jié)構(gòu)等特征。結(jié)果表明，這些胞外多糖具有良好的抗菌和抗氧化性能。因此，本研究不僅豐富了微生物胞外多糖資源，而且為低鹽發(fā)酵醬類(lèi)調(diào)味品的開(kāi)發(fā)提供了理論支撐，展示了B.velezensisR2及其EPS在發(fā)酵食品工業(yè)中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1材料與方法

1.1材料

指示菌：金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusCICC23656）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ListeriamonocytogenesCICC21635）、糞腸球菌（EnterococcusfaecalisCICC23658），均購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物 5. 0g/L 、胰蛋白肺10.0g/L， 氯化鈉 10.0g/L， 瓊脂粉 20.0g/L ，調(diào)節(jié) pH 至7.0，121 °C 滅菌 15min 。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20.0g/L，Na₂HPO₄ 1.5g/L， NaH₂PO₄ 1.0g/L，MgSO₄ 0.25g/L，F(xiàn)eSO₄?7H₂O 0.05g/L 、 （2號(hào)ZnCl₂0.01g/L ，調(diào)節(jié) pH 至 7.0，121°C 滅菌 15min 。

氫氧化鈉、氯化鈉、三氟乙酸、甲醇、三氯甲烷、氨水：上海麥克林生化科技有限公司；甘油、Tris飽和酚溶液、蛋白酶K、RNase A（10mg/mL） 、TE緩沖液、TAE緩沖液：生工生物工程（上海）股份有限公司；乙腈：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DEAE纖維素柱：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-2CD超凈工作臺(tái)、G154DW高壓蒸汽滅菌鍋上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;Tamp;J-Atype5L迪必爾平行生物反應(yīng)器迪必爾生物工程（上海）有限公司；LeicaDM2500光學(xué)顯微鏡德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；S10OOPCR儀美國(guó)伯樂(lè)公司；ZWY-211B回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床上海知楚儀器有限公司；icount3OF全自動(dòng)超高清菌落計(jì)數(shù)器法國(guó)Interscience公司；InfiniteM2OO多功能酶標(biāo)儀瑞士Tecan公司；Frontier傅里葉變換紅外光譜儀珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 粗胞外多糖的提取

將B.velezensisR2在LB平板上劃線培養(yǎng) 24h 挑選單菌落接入含有 5mL LB液體培養(yǎng)基的 50mL 無(wú)菌離心管中， 37°C.200r/min 培養(yǎng) 24h ，作為種子液。粗多糖的制備采用 5L 發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，裝液量1L，補(bǔ)料1L，種子液按 2% 的比例接入發(fā)酵罐中，37°C，200r/min 培養(yǎng) 144h ，最終發(fā)酵體積為2L，然后在 8 000r/min 、4 ^°C 下離心 10min 除去菌體，發(fā)酵上清液醇沉處理（加入3倍體積預(yù)冷的 75% 乙醇， 4^°C 靜置過(guò)夜）， 8000r/min.4^°C 離心 10min ，棄上清液后使用Sevage試劑（氯仿：正丁醇為 4：1 除去蛋白質(zhì)[，用蒸餾水透析水溶液，冷凍濃縮干燥后獲得粗多糖。

1.4粗胞外多糖的純化

將凍干后的粗多糖粉末溶于蒸餾水中配制成5mg/mL 的溶液，取 5mL 通過(guò)DEAE-Cellulose-52陰離子交換柱 （25mm×45cm） ，依次用 0.2，0.5，0.7mol/L 的 NaCl 溶液洗脫[8]，流速為 10mL/min ，每 4min 收集一管，各收集60管，用苯酚-硫酸法測(cè)定洗脫液餾分，繪制洗脫曲線，收集含有糖的組分，濃縮、透析、冷凍干燥后收集。

1.5 EPS分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量[]。凝膠色譜柱選用TSKgelG5000PWXL（ 7.5mm× 30.0cm' ，柱箱溫度設(shè)置為 ，配備示差折光檢測(cè)器。流動(dòng)相為乙酸銨緩沖液 （0.1mol/L，pH 6. 0） ，流速為 0.6mL/min 。以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品（相對(duì)分子質(zhì)量分別為 溶于流動(dòng)相中，進(jìn)樣量為 10μL ，測(cè)定保留時(shí)間，以色譜峰的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)， -lgMw 為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程。樣品的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定：將樣品用流動(dòng)相配制成濃度為1mg/mL 的溶液，進(jìn)樣量為 10μL ，測(cè)定其色譜峰的保留時(shí)間[10]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.6 EPS紅外光譜分析

多糖樣品的紅外光譜使用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定，將干燥的樣品（ （1mg） 與光譜級(jí)溴化鉀粉末按 1：100 混合，研磨并壓制成顆粒，并且在 4000～400cm^-1 范圍內(nèi)記錄紅外光譜[11]

1.7 EPS三維螺旋結(jié)構(gòu)分析

多糖樣品的剛果紅分析根據(jù)先前的研究方法進(jìn)行修改[12]。將蒸餾水加入到樣品中，配制成 1mg/mL 的溶液，將 2mL 多糖溶液與 100μmol/L 剛果紅試劑（ 2mL） 混合。加入氫氧化鈉溶液至終濃度為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mol/L ，混合溶液反應(yīng) 40min 后，記錄在 400～700nm 處的吸光度值。以最大吸收波長(zhǎng) （λ_max ）為縱坐標(biāo)，氫氧化鈉濃度為橫坐標(biāo)，繪制剛果紅標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 EPS掃描電鏡觀察

根據(jù)郝慧慧等[13]的研究方法，使用掃描電鏡（SEM）對(duì)多糖的形態(tài)進(jìn)行評(píng)估，將干燥的多糖粉末用雙面膠帶置于標(biāo)本架上，用濺射鍍膜機(jī)噴金。在高真空條件下，在 1000V 的加速電勢(shì)下觀察每個(gè)樣品。在1000，2000，5000倍下獲得多糖的微觀圖像。

1.9 EPS單糖組成分析

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生和高效液相色譜法測(cè)定BV-1的單糖組成，參照曹九零[14]的測(cè)定方法并加以修改。

稱(chēng)取樣品 4mg ，加入 1mL 三氟乙酸（TFA）溶液2mol/L 水解 3h ，將水解液冷卻至室溫后氮吹除去溶劑，再向管中加入 1mL 甲醇，渦旋混勻后氮吹除去溶劑，重復(fù)上述操作3次，以除去水解管中的三氟乙酸。將得到的干制水解樣品與8種混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品（1-甘露糖、2-鼠李糖、3-葡萄糖醛酸、4-半乳糖醛酸、5-葡萄糖、6-半乳糖、7-阿拉伯糖、8-巖藻糖以等比例混合）溶解于 400μL 氨水溶液中，加入 400μL PMP甲醇溶液（0.3mol/L） 。將該溶液在 70°C 下水浴加熱 30min 后氮吹除去溶劑，再加入 1mL 甲醇后氮吹，重復(fù)該操作2次。然后加人 1mL 乙酸溶液 1% ），再加入 1mL 三氯甲烷，振蕩30s后除去三氯甲烷，重復(fù)萃取3次，將水相溶液經(jīng) 0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾到進(jìn)樣小瓶中，準(zhǔn)備進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。

檢測(cè)條件：采用SilgreenODS C₁₈ 色譜柱 250mm× 4.6mm×5μm） ，柱箱溫度為 30^°C ，用HPLC-PAD分 析其PMP衍生物。流動(dòng)相為 20mmol/L 乙酸銨-乙腈 （84.5：15.5） ，進(jìn)樣量為 10μL 。

1.10 粗胞外多糖抑菌活性的測(cè)定

將胞外多糖BV-1配制成溶液后，為防止提取的胞外多糖中殘余蛋白的影響，在EPSBV-1溶液中加人 20mg/mL 蛋白酶K，蛋白酶K與EPS的比例為1：20 ，在 37^°C 下溫浴 30min 后取出，對(duì)照組為EPS中不加蛋白酶K，在 37^°C 下溫浴 30min ，空白對(duì)照為蛋白酶K以 1：20 的比例加入無(wú)菌水中在 37^°C 下溫浴 30min 。

采用雙層牛津杯法[15]，對(duì)EPS進(jìn)行抗菌活性分析，步驟如下：

第一層素瓊脂：配制 1% 的素瓊脂，將其傾倒在無(wú)菌平板（按每平板約為 10mL 、厚度約為 2mm ）上，待瓊脂凝固后在其上放置無(wú)菌牛津杯（內(nèi)徑 6mm 、外徑8mm ）。

第二層瓊脂培養(yǎng)基：將LB瓊脂培養(yǎng)基倒入已擺好牛津杯的平板內(nèi)，待其凝固后用無(wú)菌鑷子將牛津杯夾出。

將活化的指示菌稀釋至菌落數(shù)為 10⁴～10⁵CFU/mL 左右，取 100μL 涂布平板，然后將準(zhǔn)備好的3組溶液通過(guò)0.22μm 水系濾膜過(guò)濾后注入涂布后的平板小孔內(nèi)。

置于 37^°C 培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 24h ，抗菌圈直徑使用超高清全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器測(cè)量，測(cè)量3次，取平均值。

1.11胞外多糖抗氧化活性的測(cè)定

DPPH自由基清除率測(cè)定：將多糖配制成溶液，與100% 乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2picrylhydrazylradical，DPPH）溶液 （0.2mmol/L） 混合，在 25°C 黑暗中培養(yǎng) 30min 。單獨(dú)使用多糖溶液和乙醇作為空白組，蒸餾水和DPPH-乙醇溶液作為對(duì)照組，在517nm 處測(cè)量吸光度值[16]，計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率

式中： ??A₀ 為無(wú)樣品的DPPH自由基溶液的吸光度值； .A_s 為樣品的吸光度值。

羥基自由基清除率的測(cè)定參考 Wu 等[17]的方法并加以修改，羥基自由基清除率的計(jì)算公式如下：

羥基自由基清除率

式中： A_s 為含不同濃度胞外多糖/抗壞血酸的吸光度值； A_c 為不含胞外多糖/抗壞血酸的吸光度值；A₀ 為不含胞外多糖/抗壞血酸和 H₂O₂ 的吸光度值。

超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定參考Zhang[18]的方法并加以修改，超氧陰離子自由基清除率的計(jì)算公式如下：

超氧陰離子自由基清除率

式中 Ω_：A00 為不含胞外多糖和鄰苯三酚的吸光度值； A₀₁ 為不含胞外多糖/抗壞血酸、含鄰苯三酚的吸光度值； A₁₀ 為含胞外多糖/抗壞血酸、不含鄰苯三酚的吸光度 值； A₁₁ 為含胞外多糖/抗壞血酸和鄰苯三酚的吸光 度值。

ABTS自由基清除率測(cè)定方法[16]：將 2，2^′ -聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽 （14mmol/L 和過(guò)硫酸鉀 （5mmol/L） 以 1：1 的比例混合，在 25°C 下反應(yīng) ^16h 。然后用 80% 無(wú)水乙醇將吸光度值調(diào)至0.7左右，將 100μL 多糖溶液添加到 900μL ABTS溶液中，在 25°C 黑暗中培養(yǎng) 15min ，在 734nm 處測(cè)量吸光度值，計(jì)算公式如下：

ABTS自由基清除率 0

式中： A_o 為無(wú)樣品的ABTS自由基溶液的吸光度值； A_s 為樣品的吸光度值。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析和圖形處理

所有測(cè)定結(jié)果均平行測(cè)定3次，相應(yīng)數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。使用SPSS26.0軟件進(jìn)行方差分析，Plt;0.05 在統(tǒng)計(jì)學(xué)上被認(rèn)為是顯著的，使用Origin8.0進(jìn)行圖形處理。

2 結(jié)果與分析

2.1DEAE離子色譜分級(jí)純化及胞外多糖化學(xué)成分 分析

發(fā)酵 B .velezensisR2后經(jīng)提取發(fā)酵液得到粗多糖，采用苯酚硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1中A）： y= 15.246x+0.061 4 R²=0.999 0） ，測(cè)得粗多糖中總糖含量為 （65.32±0.54）% 。使用DEAE-Cellulose-52陰離子交換柱將其分離純化，使用不同濃度的氯化鈉進(jìn)行洗脫，并且通過(guò)繪制洗脫曲線獲得兩個(gè)組分（分別命名為BV-1和BV-2），見(jiàn)圖1中B。分離后的兩個(gè)組分均呈單一對(duì)稱(chēng)峰，表明二者均為單一且相對(duì)分子質(zhì)量均一的組分，其中BV-2組分得率較低，糖含量太少，難回收，故選擇BV-1進(jìn)行后續(xù)探究。進(jìn)一步分析BV-1的化學(xué)組成，其總糖含量為 （83.39±1.37）% ，采用考馬斯亮藍(lán)法和紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，紫外可見(jiàn)光譜中在 260nm 和 280nm 處無(wú)特征吸收峰，表明BV-1中沒(méi)有核酸或蛋白質(zhì)污染。

2.2 EPS純化組分分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測(cè)定 B velezensisEPSBV-1的純度和相對(duì)平均分子質(zhì)量。首先通過(guò)對(duì)不同分子質(zhì)量的葡聚糖進(jìn)行測(cè)定，繪制相對(duì)平均分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，一lgMw為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線： y=0.2877x-11.017（R²=0.9985） ，具有良好的相關(guān)性。BV-1的HPGPC結(jié)果見(jiàn)圖2，為單一對(duì)稱(chēng)的色譜峰，表明組分較純，為單一多糖，代人標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到BV-1的相對(duì)平均分子質(zhì)量為 39.4kDa 。

2.3EPS純化組分紅外光譜分析和三維螺旋結(jié)構(gòu)分析

B .velezensisR2的紅外光譜圖見(jiàn)圖3中A。在3383.43cm^-1 處的吸收峰較寬，歸因于一OH的伸縮振動(dòng)[19]。在 2928.84cm^-1 處的吸收峰歸因于 CH₃ 、CH₂ 和CH中 C-H 鍵的伸縮振動(dòng)[20]。在 1643.19cm^-1 處的吸收峰歸因于 C=O 的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，表明有—COOH存在[21]。在 1406.38cm^-1 處的譜帶代表O一H的形變振動(dòng)；在 1076.9cm^-1 處的吸收峰代表吡喃環(huán)的C—O伸縮振動(dòng)22」；在 889.04cm^-1 處的吸收峰歸因于 β 糖苷鍵所屬的糖環(huán)上C—H鍵的變角振動(dòng)，在 350～600cm^-1 處的條帶屬于吡喃糖環(huán)的骨架模式，表明BV-1是含有 β -吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)[23]的多糖。

當(dāng)剛果紅加入不同濃度的堿性溶液中后，它能夠與具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖結(jié)合，與純剛果紅進(jìn)行比較，剛果紅與多糖混合堿溶液的波長(zhǎng) λ_max 會(huì)發(fā)生明顯的紅移。因此，可以通過(guò)剛果紅實(shí)驗(yàn)對(duì)多糖溶液的三螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估。目前研究表明多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)顯著影響其生物活性[16]

由圖3中B可知，隨著NaOH濃度的增加，剛果紅和 B .velezensisEPSBV-1復(fù)合物的 λ_max 有一定程度的紅移，而且 0.2mol/L NaOH溶液能夠破壞多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)，但是當(dāng) ΔNaOH 濃度達(dá)到 0.5mol/L 時(shí)，BV-1剛果紅復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng)仍為 491nm ，表明BV-1具有三螺旋結(jié)構(gòu)并呈現(xiàn)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

2.4EPS純化組分掃描電鏡結(jié)果

掃描電子顯微鏡分析對(duì)多糖表面形貌的觀察與研究和物理性質(zhì)的理解與解釋具有重要意義，可以直觀觀察多糖的微觀結(jié)構(gòu)。B.velezensisEPSBV-1在5000，2000，1000放大倍數(shù)下的掃描電鏡圖見(jiàn)圖4中 A～C ，可以清晰地看到BV-1的鏈骨架為疏松多孔的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

注：A為放大5000倍；B為放大2000倍；C為放大1000倍。

由圖4中A可知，在放大5000倍下，可觀察到明顯的分支結(jié)構(gòu)，表面有一些孔洞。由圖4中C可知，在放大1000倍時(shí)，BV-1呈現(xiàn)出蜂窩網(wǎng)狀的3D結(jié)構(gòu)，且周?chē)性S多分支，表明多糖分子間存在相互作用且緊密聚集。Ayyash等[24]研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自格氏乳球菌的EPS呈現(xiàn)出片狀且分層的結(jié)構(gòu)。Vinothkanna等[25]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的EPS呈現(xiàn)出不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些微觀結(jié)構(gòu)的不同可能是單糖組成的差異以及EPS的提取方式不同導(dǎo)致的[26]

2.5 EPS純化組分單糖組成分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單糖色譜和保留時(shí)間，判斷出峰時(shí)間從早到晚排序?yàn)楦事短?（10.52min） 、鼠李糖 （16.58min） ）、葡萄糖醛酸（ 18.48min 、半乳糖醛酸 20.21min ）、葡萄糖 （24.45min） 、半乳糖 （27.4min） 、阿拉伯糖/木糖（29.31min） 、巖藻糖 （33.93min） 。將經(jīng)酸水解得到的B.velezensisEPSBV-1衍生物進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

Fig.5 HPLC chromatograms of monosaccharides of the standard sample （A） and monosaccharides of the component BV-1 （B）

根據(jù)圖5中結(jié)果并結(jié)合單糖標(biāo)準(zhǔn)品在色譜峰上的出峰順序和保留時(shí)間，可以得到BV-1單糖組成：葡萄糖（44. 85% ，是雜多糖BV-1的主要成分）、甘露糖（34. 72% ）、鼠李糖 （10.89% 和半乳糖 （9.54%） 。

2.6 菌株胞外多糖抑菌活性測(cè)定

選取了3株食品中常見(jiàn)的食源性致病菌作為指示 菌，分別為 L . monocytogenes CICC 21635、S. aureus CICC 23656.E ·faecalisCICC23658，本實(shí)驗(yàn)采用雙 層牛津杯法測(cè)定 B .velezensisR2提取的粗多糖溶液 的抗菌活性。

注：1為牛津杯孔中只加入蛋白酶K，2為牛津杯孔中只加入EPS溶液，3為牛津杯孔中加入EPS與蛋白酶K的混合溶液；a為糞腸球菌，b為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，c為金黃色葡萄球菌。

由圖6可知，B.velezensisR2的EPSBV-1對(duì)E. faecalisCICC23658的抑制能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到 （19.83± 1.31）mm ，對(duì)照組的抑菌圈直徑為 （21.27±0.60）mm. 0對(duì) s ．a(chǎn)ureusCICC23656的抑制能力次之，抑菌圈直徑為 （18.97±0.54）mm ，對(duì)照組的抑菌圈直徑為 （22.03± 0.82）mm 。金黃色葡萄球菌是一種廣泛分布于自然界中的常見(jiàn)食源性致病菌，其侵襲性、耐藥性和毒性使其成為導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生多種嚴(yán)重疾病的主要因素。劉東琦等[27]通過(guò)研究植物多糖中的玉米須多糖，發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到 （22.7± 0.2）mm 。周欣[28]研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為 （9.73±0.98）mm ，同樣作為微生物多糖，本研究中B.velezensisR2的EPSBV-1對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于香菇多糖且抗菌效果與植物多糖中的玉米須多糖相近。 L . monocytogenes CICC 2l635的抑菌圈直徑為 （18.07±0.53）mm ，對(duì)照組的抑菌圈直徑為 （20，47±0.75）mm 。所有空白對(duì)照組均未產(chǎn)生抑菌圈，排除了蛋白酶K對(duì)致病菌的抑制作用。與對(duì)照組相比，每株致病菌實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈直徑略小于對(duì)照組，原因可能是蛋白酶K分解EPSBV-1中的殘余蛋白，排除了可能存在的抗菌肽對(duì)抑菌活性的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證B．velezensisR2的EPSBV-1具有良好的抗菌活性。

綜上所述，B.velezensisR2的EPSBV-1展現(xiàn)出對(duì)常見(jiàn)食源性致病菌的顯著抗菌效能，尤其對(duì)糞腸球菌具有顯著的抑制效果，對(duì)食品中易引發(fā)感染的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有很大程度的抑制作用。

2.7胞外多糖抗氧化活性分析

DPPH的單電子被捕獲后其顏色變淺，吸光度值降低，其吸光度降低程度與試樣濃度成正比，反映試樣的抗氧化能力[29]。DPPH自由基清除活性結(jié)果見(jiàn)圖7中A。隨著 B .velezensisR2的EPS組分BV-1濃度升高，DPPH自由基清除活性增加，當(dāng)EPS組分BV-1濃度達(dá)到 2.5mg/mL 時(shí)，DPPH自由基清除活性為 18.27% 低于陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸的清除活性（81. 12% 。同時(shí)對(duì)比海洋復(fù)合多糖巖藻多糖的DPPH自由基清除活性，相同濃度下巖藻多糖的DPPH自由基清除活性在濃度為1.25mg/mL 和 2.5mg/mL 時(shí)變化不大，僅從11. 45% 增加到11. 65% ，可見(jiàn) B .velezensisR2的EPS組分BV-1對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于巖藻多糖。

EPS對(duì)羥基自由基的清除活性見(jiàn)圖7中B，胞外多糖組分BV-1濃度升高，同時(shí)羥基自由基清除活性增加，當(dāng)組分BV-1濃度為 0.2mg/mL 時(shí)，羥基自由基清除活性為 8.17% ；當(dāng)胞外多糖組分BV-1濃度達(dá)到 1mg/mL 時(shí)，羥基自由基清除活性為 33.19% ；當(dāng)巖藻多糖濃度為 0.2mg/mL 時(shí)，羥基自由基清除活性為 7.71% ，但隨著多糖濃度升高到 1mg/mL ，羥基自由基清除活性?xún)H增加到 10.54% ，可見(jiàn) B .velezensis R2的EPS組分BV-1對(duì)羥基自由基的清除能力遠(yuǎn)強(qiáng)于巖藻多糖。

多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性見(jiàn)圖7中C，隨著多糖濃度升高，超氧陰離子自由基清除活性增幅較小，當(dāng)多糖濃度為 0.02mg/mL 時(shí)，B．velezensisR2的EPS組分BV-1超氧陰離子自由基清除活性為 37.18% 當(dāng)多糖濃度達(dá)到 0.1mg/mL 時(shí)，超氧陰離子自由基清除活性為 40.48% ，僅升高了 3.3% 。當(dāng)巖藻多糖濃度為0.02mg/mL 時(shí)，超氧陰離子自由基清除活性為 43.26% 隨著多糖濃度升高到 0.1mg/mL ，其超氧陰離子自由基清除活性增加到 44.24% ，增幅較小，由此可見(jiàn)，B.velezensisR2的EPS組分BV-1對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力與巖藻多糖相差不大。

由圖7中D可知，B.velezensisR2的EPS組分BV-1和巖藻多糖的ABTS自由基清除能力都在測(cè)量范圍內(nèi)隨著濃度的增加而增加，表明所有樣品都具有潛在的吸收自由基的能力。當(dāng)多糖濃度為 0.2mg/mL 時(shí)，B.velezensisR2的EPS組分BV-1的ABTS自由基清除活性為 10.45% ，當(dāng)組分BV-1濃度為 0.6mg/mL 和 1mg/mL 時(shí)，ABTS自由基清除活性分別為 16.83% 和 28.37% 。巖藻多糖的ABTS自由基清除活性明顯低于 B ．velezensisR2的EPS組分BV-1，當(dāng)巖藻多糖濃度為 1mg/mL 時(shí)，ABTS自由基清除活性為 3.75% ，而陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸在濃度為 1mg/mL 時(shí)，ABTS自由基清除活性達(dá)到 93.61% 。

綜上，在多糖濃度升高的條件下，B.velezensisR2的EPS組分BV-1表現(xiàn)出顯著升高的抗氧化能力，且其效果雖弱于抗壞血酸，但強(qiáng)于巖藻多糖，這為細(xì)菌胞外多糖在食品工業(yè)中作為潛在的天然抗氧化劑的應(yīng)用提供了有力支持，展現(xiàn)了其潛在的廣闊前景。

3結(jié)論

本文以傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品東北大醬中保藏的一株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的B．velezensisR2為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)除前期發(fā)現(xiàn)的抗菌肽外，其所產(chǎn)生的胞外多糖具有良好的抑菌活性，對(duì)食品中最常見(jiàn)的食源性致病菌金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到 18.97mm ，對(duì)制備的粗多糖使用DEAE纖維素柱純化，組分BV-1分子質(zhì)量為39.4kDa ，由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖和半乳糖組成，為β 型吡喃糖且具有三維螺旋結(jié)構(gòu)，微觀呈現(xiàn)緊密的蜂窩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是一種具有新型結(jié)構(gòu)的胞外多糖。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，B.velezensisR2的EPS組分BV-1具有良好的抗氧化活性，當(dāng)EPS濃度為 1mg/mL 時(shí)，其ABTS自由基清除活性為 28.37% ，羥基自由基清除活性為 33.19% 。本文揭示了源自 B .velezensis的微生物胞外多糖在發(fā)酵調(diào)味品中的作用，同時(shí)也為發(fā)酵調(diào)味品的優(yōu)化提供了理論基礎(chǔ)。

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