DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.020

中圖分類號：TS205.5 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）05-0144-08

Optimization of Fermentation Process of “Flame Seedless”Grape Fruit Vinegar Based on Response Surface Methodology and Fuzzy Mathematics

CAO Ying1，ZHANG Wen² ，LIN Jing² ，LIU Yu¹ ，NIAN Qing-yu1，WANG Xin- ?xin¹ CUI Xiang-long1，ZHANG Zhen-zhen1 * （1.College of Food Science and Pharmacy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi ， China；2.Horticultural Crops Research Institute，Xinjiang Academy of Agricultural Science，Urumqi 83oooo，China）

Abstract： In this experiment，with local fresh grape“flame seedless”from Xinjiang as the research object，single factor test is conducted on fermentation temperature，initial pH value and initial alcohol content，response surface optimization test is conducted with fuzzy mathematics sensory score and total acid content as the evaluation indexes，and the optimal combination of parameters in the acetic acid fermentation process of “flame seedless” grape fruit vinegar is determined to be fermentation temperature of 35°C ，initial pH value of 4.6，and initial alcohol content of 7.3% vol. Under these conditions，the sensory score is 87.18 points. After this treatment，the obtained grape fruit vinegar has strong fruit vinegar flavor，presenting clear and transparent light amber hue with a slight dark color，and the aroma is mild.

Key words：“flame seedless\"; fruit vinegar; fuzzy mathematics method; response surface

“火焰無核\"葡萄果實口感酸甜適中，果肉松脆，果皮易消化，因此深受消費者喜愛[。而隨著鮮食葡萄種植面積的不斷增加和產(chǎn)量的不斷提高，常存在滯銷的狀況，嚴(yán)重影響了農(nóng)民收入水平的提高和鮮食葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而葡萄果醋已有成功的生產(chǎn)經(jīng)驗，在國內(nèi)也有廣闊的市場前景[2」。

葡萄果醋是一種富含有機酸的調(diào)味品或醋酸飲料[3]，經(jīng)過現(xiàn)代生物發(fā)酵工藝制作而成。它不僅含有原料“火焰無核”中的檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等有機酸，而且含有乙酸、乳酸、丙酮酸等[4發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸?！盎鹧鏌o核\"果醋中的有機酸有助于人體內(nèi)的新陳代謝，促進有氧代謝，消除和緩解疲勞[5]。此外，乙酸的高濃度也能產(chǎn)生某種程度的抑菌效果[6]。

以新疆當(dāng)?shù)仄贩N“火焰無核\"葡萄作為基礎(chǔ)材料，經(jīng)過酵母菌與醋酸菌發(fā)酵過程，成功制成了一種新型的葡萄果醋產(chǎn)品。在此基礎(chǔ)上，運用模糊數(shù)學(xué)法對其進行更公正的評估。同時，使用Box-Behnken試驗設(shè)計進行響應(yīng)面分析，以此進一步優(yōu)化“火焰無核\"葡萄果醋中的醋酸發(fā)酵環(huán)節(jié)，從而構(gòu)建一整套提高鮮食“火焰無核”葡萄果醋質(zhì)量的生產(chǎn)流程。

1材料與方法

1.1材料

“火焰無核\"葡萄：新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗場葡萄示范園。

1.2試劑

偏重亞硫酸鈉、葡萄糖：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；果膠酶：法國Laffort公司；酵母：安琪酵母股份有限公司；滬釀1.01凍干菌種、滬釀1.01液體培養(yǎng)基：上海市工業(yè)微生物研究所；氫氧化鈉、酚酞：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；酵母膏、瓊脂：北京市奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水乙醇：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈣：天津市鑫鉑特化工有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

E203E/O2電子天平、FE28FiveEasy PluspH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;BC/BD-320HK海爾臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜青島海爾特種電冰柜有限公司；PAL-2手持糖度計日本ATAGO公司；ZSHPS-2葡萄除梗破碎機新鄉(xiāng)市衛(wèi)濱區(qū)中食環(huán)機械有限公司；GQS-80-1螺桿泵新鄉(xiāng)市新輕機械有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1“火焰無核\"葡萄果醋釀造工藝流程

原料 $$ 除梗、破碎 $$ 酒精發(fā)酵 $$ 醋酸發(fā)酵 $$ 殺菌 $$ 成品。

1.4.2 操作要點

原料挑選：挑選新鮮且表面無病蟲害的鮮食葡萄。

酒精發(fā)酵：將原料破碎后加偏重亞硫酸鉀 Ω?80mg/L） 處理， 30min 后加入果膠酶（ 20mg/L） ，然后進行活化酵母（加原汁在 35～38^°C 活化 后加入酵母 200mg/L 并攪拌，發(fā)酵數(shù)天，直至酒精度示數(shù)增加緩慢。

醋酸發(fā)酵：醋酸菌活化：將滬釀1.01凍干菌種從無菌超凈臺上接種到液體培養(yǎng)基中。在 30°C 條件下以2 000r/min 振蕩活化 3d_。

醋酸菌擴培：在滅菌后的葡萄酒中添加 15% 的一級菌種培養(yǎng)液，將醋酸菌接種到含有葡萄糖 10.0g/L. 酵母膏 10.0g/L. 碳酸鈣 15.0g/L， 無水乙醇 20.0mL/L 、瓊脂 20.0g/L 和蒸餾水 1.0L/L 的液體培養(yǎng)基中。接種后用4層紗布封口，在 2 000r/min?30°C 下振蕩培養(yǎng)2d，總酸度需達到2%以上[7]。

殺菌：在醋酸發(fā)酵結(jié)束后，將醋液在 100^°C 下進行30s的殺菌處理。

1. 4.3 單因素試驗

通過觀察總酸變化規(guī)律和趨勢來判斷不同處理間的差異，為后續(xù)響應(yīng)面試驗提供最優(yōu)條件范圍。

1. 4.3. 1 發(fā)酵溫度

依照1.4.2中的方法進行發(fā)酵，初始酒精度為 7%vol 同時調(diào)整起始pH值至4.5，然后將其置于20，25，30，35，40^°C 的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保持恒定溫度進行發(fā)酵，每24h 測量一次總酸含量，直至總酸含量達到穩(wěn)定的水平，即發(fā)酵完成。最后，通過對總酸含量的分析選擇最適宜的發(fā)酵溫度。

1.4.3.2 初始pH值

依據(jù)1.4.2中的方法進行發(fā)酵，初始酒精度為 7%01 同時對該產(chǎn)品在不同初始 pH 值（3.5，4，4.5，5，5.5）和 恒定溫度下進行發(fā)酵，并在每個階段間隔 24h 測量一次總酸含量，直至總酸含量達到穩(wěn)定的水平后停止發(fā)酵，通過觀察總酸含量的變化，選擇最優(yōu)的初始 pH 值。

1. 4.3.3 初始酒精度

按照1.4.2中的方法進行發(fā)酵，設(shè)置初始酒精度分別為 5%vol.6%vol.7%vol.8%vol 和 9%vol ，同時保持初始pH值為4.5，并在 下持續(xù)發(fā)酵，每 24h 測量一次總酸含量，直至總酸含量的變化趨于平穩(wěn)，即發(fā)酵完成。依據(jù)總酸含量選擇最優(yōu)的初始酒精度。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

通過單一變量試驗研究和分析“火焰無核\"葡萄果醋酸度的變化情況，采用Box-Behnken法進行試驗設(shè)計的優(yōu)化，從而明確影響發(fā)酵過程的各種參數(shù)值，并且構(gòu)建預(yù)測模型。響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果見表1。

表1響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平

1.4.5 模糊數(shù)學(xué)法評價標(biāo)準(zhǔn)

以色澤、香氣、組織狀態(tài)和滋味來評價果醋的優(yōu)劣，其中色澤和組織狀態(tài)的權(quán)重各占0.15，而香氣和滋味的權(quán)重各占0.35。得到的因素權(quán)重集 X={0.15 0.35，0.15，0.35} 。評估結(jié)果劃分為優(yōu)秀（90分）、良好（70分）與較差（50分）3個級別，從而構(gòu)建了包含這3個級別的評估等級集合 T={90，70，50} 。邀請10名評審人員依照預(yù)設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)和評分方式對各單因素的鮮食“火焰無核\"葡萄果醋進行主觀評價。感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

對數(shù)據(jù)進行計算和評估后，運用模糊數(shù)學(xué)理論對結(jié)論進行深人研究。首先，將4個項目中3個級別中每個等級所對應(yīng)的人數(shù)與所有參與評分的總?cè)藬?shù)（即10人）相除，從而得到模糊數(shù)學(xué)關(guān)系的矩陣 R 。然后，從該矩陣中得出模糊的關(guān)系評價集 Y=X×R ，最終算出“火焰無核\"葡萄果醋的模糊數(shù)學(xué)綜合評分 Z=Y+T 。

1.4.6理化指標(biāo)的測定

理化指標(biāo)的測定是評估食品質(zhì)量的重要步驟。參考GB12456—2021標(biāo)準(zhǔn)測定總酸含量[8]。參考GB5009.225——2023標(biāo)準(zhǔn)測定酒精度[9]。使用 pH 計測定 pH 值。根據(jù)GB5009.7—2016標(biāo)準(zhǔn)，對葡萄果醋中的還原糖含量進行測定[10]?？扇苄怨绦挝锖坎捎檬殖终酃鈨x測定。通過以上方法可以準(zhǔn)確評估果醋的理化指標(biāo)，確保食品質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1發(fā)酵溫度對總酸含量的影響

根據(jù)1.4.3.1單因素試驗中的方法，不同發(fā)酵溫度下，隨著發(fā)酵時間的延長總酸含量的變化情況見圖1。

發(fā)酵溫度可以通過影響醋酸菌細胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與酶活性來影響其生長代謝和發(fā)酵性能，是果醋發(fā)酵的重要影響因素之一[1]。不同發(fā)酵溫度對“火焰無核\"葡萄果醋總酸含量的影響見圖1。

由圖1可知，當(dāng)溫度為 時，隨著發(fā)酵溫度的升高，產(chǎn)酸量逐漸升高，但當(dāng)發(fā)酵溫度進一步升高時，結(jié)果則相反，可能是高溫加速了醋酸菌的老化，導(dǎo)致其產(chǎn)酸量降低。在不同發(fā)酵溫度下，味覺評分與總酸含量的變化趨勢一致，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。高溫發(fā)酵導(dǎo)致醋酸菌內(nèi)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性降低，同時加速了醋中風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)，從而使味覺評分受到負(fù)面影響[12]。

2.1.2初始 pH 值對總酸含量的影響

適宜的 pH 值能維持醋酸菌的生長代謝，從而保證其有氧發(fā)酵和產(chǎn)酸的正常進行[13]。根據(jù)1.4.3.2單因素試驗中的方法，在不同 pH 值條件下，隨著發(fā)酵時間的增加，總酸含量的變化情況見圖2。

由圖2可知，隨著初始 pH 值的升高，產(chǎn)酸量呈現(xiàn)上升趨勢，但當(dāng)初始 ΔpH 值繼續(xù)升高時，總酸含量下降。初始pH值過高對醋酸菌生長不利，且會解除NADPH₂ 和 NADH₂ 對乙酰CoA合成酶的抑制作用，導(dǎo)致過氧化現(xiàn)象的發(fā)生[13]。當(dāng)發(fā)酵液的初始pH值過低時，會抑制菌種的新陳代謝，從而導(dǎo)致菌種發(fā)酵速率降低和產(chǎn)酸量下降[13]。通過分析圖2中數(shù)據(jù)，得出初始 ΔpH 值為4.5最合適。

2.1.3不同初始酒精度對總酸含量的影響

根據(jù)1.4.3.3中的方法對不同初始酒精度進行測試以觀察其對總酸含量的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著初始酒精度的增加，總酸含量隨之先增加，直至在 7%vol 時達到最高值后下降。這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因在于適宜的酒精度有利于微生物的產(chǎn)生和繁殖，從而創(chuàng)造了適合它們生長的理想條件。通過分析圖3中數(shù)據(jù)，得出最佳的初始酒精度為 7% 。

2.2模糊數(shù)學(xué)評價結(jié)果

利用模糊數(shù)學(xué)綜合評價法，依據(jù)表2中的感官評價標(biāo)準(zhǔn)對“火焰無核\"葡萄果醋在各參數(shù)條件下進行感官評價，其評分情況見表3。

表3“火焰無核\"葡萄果醋的感官評分結(jié)果

通過對10位評價人員的評分結(jié)果進行分析，建立一個模糊矩陣來呈現(xiàn)不同樣品在色澤、香氣、組織狀態(tài)和滋味方面的評分差異。例如，1號樣品在色澤方面8位評價人員認(rèn)為優(yōu)秀，2位評價人員認(rèn)為良好，沒有人認(rèn)為差；在香氣方面，7位認(rèn)為優(yōu)秀，3位認(rèn)為良好，沒有人認(rèn)為差；在組織狀態(tài)和滋味方面也有相似的評價結(jié)果。這種差異性分析有助于更全面地了解樣品在不同方面的表現(xiàn)。

因此 （204號

0.000} ，最后計算出該樣品的感官評分 Z_?1=T×Y_?1= {90，70，50}×{0.765，0.235，0.000}=85.3 日

同理可得到評價結(jié)果集，見表4。

表4“火焰無核\"葡萄果醋的評價結(jié)果集

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計，進行三因素三水平試驗，共構(gòu)建了17組試驗。詳細的試驗設(shè)計與結(jié)果見表5[14-15]。

表6總酸含量的回歸模型方差分析及顯著性檢驗

注：“ ? \"表示影響顯著 （Plt;0.05） ；“ times? ”表示影響極顯著（ Plt;0.05） ；“一”表示影響不顯著 （Pgt;0.05） ，下表同。

根據(jù)表5中總酸含量的試驗數(shù)據(jù)對其進行二次多項回歸擬合，得到的回歸方程為 Y₁=61.61+1.20A+ 1.82B+1.77C+0.50AB+0.79AC+0.77BC-4.60A²- 3.83B²-4.62C² 。根據(jù)回歸方程，不同因素的變化對總酸含量的影響程度不同，其中 A，B，C 代表不同的因素，AB、AC、BC代表交互作用， A²，B²，C² 代表每個因素的平方項，這些參數(shù)可以幫助我們更好地理解不同因素對總酸含量的影響規(guī)律。

由表6可知，對于總酸含量而言，模型的 P 值 lt;0.01 表明模型極顯著。同時發(fā)酵溫度（A）和初始酒精度 （C） 之間存在顯著的交互作用；而初始 pH 值（B）和初始酒精度（C）也呈現(xiàn)顯著的交互作用。此外， R_Adj² 和 R_pred² 之間的差異小于0.2，表明模型有較高的精確性和穩(wěn)定性[16]。失擬項的 P 值 gt;0.05 ，不顯著，進一步證明模型的擬合效果良好[16]。 R²=0.9951 表示模型能夠解釋高達 99.51% 的響應(yīng)值變化。 F 值反映總酸含量受各因素的影響情況， F 值越高，表明該因素對總酸含量的影響越明顯。由此可見，各種因素對復(fù)合果醋總酸含量的影響主次順序為初始 pH 值 （B）gt; 初始酒精度 （C）gt; 發(fā)酵溫度（A）。

由圖4中的等高線圖和3D響應(yīng)面圖可知，3種單因素對總酸含量有一定的影響，且各因素間的相互作用較大。從輪廓線和形態(tài)上看，線條密集度增加，形狀趨向橢圓形時，其影響程度也相應(yīng)增加。在三維圖像上，傾斜度越大，交互作用越明顯。相反，各因素的交互作用較弱。

比較3個因素的等高線圖和3D響應(yīng)面圖可知，發(fā)酵溫度（A）與初始酒精度（C）之間的交互作用較強，發(fā)酵溫度（A）與初始pH值 （B 及初始 pH 值 （B ）與初始酒精度（C）之間的相互作用較弱。

經(jīng)優(yōu)化試驗，發(fā)酵溫度 、初始酒精度7.218% vol、初始 ΔpH 值4.632為最佳工藝條件，此時總酸含量為 62.15g/L 。隨后的驗證試驗和模糊數(shù)學(xué)感官評分結(jié)果表明，總酸含量為 62.12g/L ，與預(yù)測值接近，驗證了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表7感官評分的回歸模型方差分析及顯著性檢驗

根據(jù)表7中感官評分的試驗數(shù)據(jù)對其進行二次多項回歸擬合，得到的回歸方程為 Y₂=88.76+1.90A+1.91B+ 1.66C-0.425AB+0.975AC+0.15BC-3.61A²-3.73B²- 3.83C² 。根據(jù)回歸方程，不同因素的變化對感官評分的影響程度不同，其中 A，B，C 代表不同的因素， 、BC代表交互作用， A²，B²，C² 代表每個因素的平方項，這些參數(shù)可以幫助我們更好地理解不同因素對感官評分的影響規(guī)律。

由表7可知，對于感官評分，模型的 P 值 lt;0.01 ，表明模型極顯著。同時發(fā)酵溫度與初始酒精度的交互作用顯著，而初始 pH 值與初始酒精度及發(fā)酵溫度與初始pH 值的交互作用不顯著。此外， R_Adj² 和 R_Pred² 之間的差異小于0.2，表示模型的精確性和變異性都比較高[16]。失擬項的 P 值 gt;0.05 ，不顯著，表明該模型有良好的擬合效果[16]。 R²=0.9899 顯示模型能夠解釋 98.99% 的響應(yīng)值變化。 F 值反映感官評分的影響情況， F 值越高，表明對感官評分的影響越明顯。因此，各因素對復(fù)合果醋感官評分的影響主次順序為初始 ΔpH 值 （B）gt; 發(fā)酵溫度 （A）gt; 初始酒精度 （C） 。

由圖5中等高線圖和3D響應(yīng)面圖可知，3個單因素對感官評分有一定的影響，且各因素間的交互作用較強。從輪廓線和形態(tài)上看，線條密集度增加，形狀趨向橢圓形時，其影響程度也相應(yīng)增加。在三維圖像上，傾斜度越大，交互作用越明顯。相反，各因素的交互作用較弱。

比較3個因素的等高線圖和3D響應(yīng)面圖可知，發(fā)酵溫度（A）與初始酒精度 （C） 之間的交互作用較強，發(fā)酵溫度（A）與初始 pH 值（B）及初始 pH 值（B）與初始酒精度（C）之間的交互作用較弱。

以感官評分為指標(biāo)，發(fā)酵溫度 35°C 、初始酒精度7.348%vol 、初始pH值4.604為最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，此時感官評分為87.67分。

2.4 響應(yīng)面驗證試驗

以感官評分作為評價標(biāo)準(zhǔn)，對響應(yīng)面的預(yù)估效果進行了測試。試驗在理想狀態(tài)下重復(fù)3次并設(shè)定以下條件：發(fā)酵溫度為 35°C ，初始 pH 值為4.604，初始酒精度為 7.348%vol 。考慮到實際情況，將這些條件調(diào)整為發(fā)酵溫度 35°C 、初始 pH 值4.6、初始酒精度 7.3% vol。為了檢驗優(yōu)化方案是否有效，共進行3組試驗。最終結(jié)果顯示，經(jīng)過該處理后的“火焰無核”葡萄果醋的感官評分達到87.18分，比預(yù)期的高，所以確定該優(yōu)化方案可以應(yīng)用于實際生產(chǎn)過程。對于總酸含量的響應(yīng)面驗證試驗來說，最優(yōu)評分為80.13分，表明僅憑總酸含量無法完全反映“火焰無核”葡萄果醋的味道特性。

3產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

3.1 感官指標(biāo)

由最佳工藝條件制成的葡萄果醋呈現(xiàn)紅褐色，光澤明亮，散發(fā)濃郁的葡萄果香和醋香，醋液清澈透亮，無任何懸浮物和雜質(zhì)，口感酸而不澀，醇厚柔和。

3.2 理化指標(biāo)

通過測定葡萄醋的 ΔpH 值、總酸含量、還原糖含量和可溶性固形物含量發(fā)現(xiàn)，“火焰無核”葡萄果醋的pH 值為 3.95±0.79 ，總酸含量為 （57.38±0.67）g/L 還原糖含量為（ 1.85±0.40 ） mg/mL ，可溶性固形物含量為 （9.51±0.31 ） g/100mL ，經(jīng)檢測，“火焰無核\"葡萄果醋的理化指標(biāo)符合NY/T2987—2016《綠色食品果醋飲品》[17]的要求。

4結(jié)論

本研究首先通過單因素試驗考察了“火焰無核”葡萄果醋的發(fā)酵溫度、初始pH值、初始酒精度對總酸含量的影響，然后以“火焰無核”葡萄果醋的總酸含量和感官評分為指標(biāo)進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，發(fā)現(xiàn)不能用總酸含量來判斷“火焰無核”葡萄果醋的風(fēng)味品質(zhì)。最后，確定以感官評分作為衡量葡萄果醋風(fēng)味品質(zhì)的指標(biāo)，制備該“火焰無核\"葡萄果醋的最佳條件為發(fā)酵溫度35°C 、初始pH值4.604、初始酒精度 7.348%vol ，此條件下感官評分為87.67分。發(fā)酵的葡萄果醋的果醋味道較濃厚，為澄清明亮的淡琥珀色，香氣較柔和。

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