摘""要：GASA（gibberellic"acid-stimulated"Arabidopsis）是植物體內(nèi)廣泛存在的小分子多肽，在植物生長發(fā)育等過程中起重要作用，尤其在桑樹芽休眠調(diào)控方面具有潛在價值，但目前對桑樹中MaGASA基因在芽休眠過程中的功能了解有限。本研究旨在鑒定桑樹GASA基因家族成員，解析其在芽休眠中的作用。采用生物信息學方法鑒定GASA成員，并分析其理化性質(zhì)等特征，同時利用實時熒光定量PCR和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其表達模式。結(jié)果表明：在桑樹中存在12個MaGASA家族成員（MaGASA1～MaGASA12），分布在8條染色體上；成員間酸堿存在差異、親水性平均系數(shù)有正有負，但均含GASA保守結(jié)構(gòu)域；進化樹顯示其與桃具有較近的親緣關(guān)系；共線性分析顯示，在MaGASA基因家族中存在3條共線性關(guān)系；MaGASAs啟動子區(qū)域含響應(yīng)光照、低溫及多種激素的順式作用元件；MaGASA家族成員具有組織和品種特異性，其中MaGASA12在桑芽中的表達量顯著高于其他部位；轉(zhuǎn)錄組分析表明，在解除休眠過程中，MaGASA12表達量顯著降低，推測該基因是桑樹芽解除休眠的負調(diào)控基因；而MaGASA10表達量急劇上調(diào)，推測該基因可能是桑芽解除休眠的關(guān)鍵基因。通過實時熒光定量PCR技術(shù)對MaGASA10和MaGASA12在不同休眠階段的樣本表達量進行檢測，結(jié)果進一步驗證了轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)論，表明MaGASA10和MaGASA12可能與桑屬冬芽休眠過程相關(guān)。研究結(jié)果為桑樹MaGASA生物功能的深入研究及遺傳育種提供理論參考。

關(guān)鍵詞：桑樹；GASA基因家族；休眠解除；生物信息學；轉(zhuǎn)錄組中圖分類號：S888.2""""""文獻標志碼：A

Genome-wide"Identification"and"Expression"Pattern"Analysis"of"the"GASA"Gene"Family"in"Mulberry

HUANG"Jingjing1，"WANG"Shuchang2，3，"LIN"Peiqun2，3，"LOU"Dezhao2，3，"GENG"Tao2，3，"WU"Huazhou1，2，3*，"YU"Wengang1*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."National"Key"Laboratory"for"Tropical"Crop"Bio-breeding，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"3."Environment"and"Plant"Protection"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Integrated"Pest"Management"of"Tropical"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Key"Laboratory"of"Monitoring"and"Control"of"Tropical"Agricultural"Pests，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："GASA"（gibberellic"acid-stimulated"Arabidopsis）"is"a"small"molecule"polypeptide"widely"presented"in"plants，"playing"an"important"role"in"plant"growth"and"development"processes."It"has"potential"value"especially"in"the"regulation"of"mulberry"bud"dormancy."However，"currently，"the"understanding"of"the"functions"of"MaGASA"genes"in"mulberry"during"the"bud"dormancy"process"is"limited."The"study"aimed"to"identify"the"members"of"the"mulberry"GASA"gene"family"and"analyze"the"roles"in"bud"dormancy."Bioinformatics"methods"were"used"to"identify"the"members"and"analyze"the"physicochemical"properties"and"other"characteristics."Meanwhile，"real-time"fluorescence"quantitative"PCR"and"transcriptome"data"were"utilized"to"analyze"the"expression"patterns."The"results"showed"that"there"were"12"MaGASA"family"members"（MaGASA1-MaGASA12）"in"mulberry，"which"were"distributed"on"eight"chromosomes."There"were"differences"in"acidity"and"alkalinity"among"the"members，"and"the"average"hydrophilicity"coefficients"were"positive"or"negative，"but"all"contained"the"GASA"conserved"domain."The"phylogenetic"tree"showed"that"they"had"a"close"genetic"relationship"with"peach."Collinearity"analysis"revealed"that"there"were"three"collinear"relationships"in"the"MaGASA"gene"family."The"promoter"regions"of"MaGASAs"contained"cis-acting"elements"that"respond"to"light，"low"temperature，"and"various"hormones."The"MaGASA"family"members"showed"tissue-variety"specific"expression."Among"them，"the"expression"level"of"MaGASA12"in"mulberry"buds"was"significantly"higher"than"that"in"other"parts."Transcriptome"analysis"indicated"that"the"expression"level"of"MaGASA12"decreased"significantly"during"the"dormancy"breaking"process，"while"the"expression"level"of"MaGASA10"increased"sharply"during"the"dormancy"breaking"process."The"expression"levels"of"MaGASA10"and"MaGASA12"at"different"dormancy"stages"were"detected"by"real-time"fluorescence"quantitative"PCR"technology，"and"the"results"further"verified"the"conclusions"of"the"transcriptome"analysis，"indicating"that"they"may"be"related"to"the"winter"bud"dormancy"process"of"Morus."The"research"results"would"provide"a"theoretical"reference"for"the"in-depth"study"of"the"biological"functions"of"MaGASA"in"mulberry"and"genetic"breeding.

Keywords："Morus"sp.;"GASA"gene"family;"dormancy"release;"bioinformatics;"transcriptome

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.007

GASA（gibberellic"acid-stimulated"Arabidopsis）基因家族最初在擬南芥（Arabidopsis"thaliana）中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在多種植物中被鑒定，包括番茄（Lycopersicon"esculentum）、馬鈴薯（Solanum"tuberosum）、葡萄（Vitis"vinifera）和桃（Prunus"persica）等[1-4]。該家族編碼的富含半胱氨酸的小分子蛋白質(zhì)主要定位于細胞壁，在植物的生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導以及生物和非生物脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用[5]。

GASA基因家族參與作物生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，包括莖伸長[6]、成花誘導[5]、種子萌發(fā)[7]、側(cè)根形成[8]和果實發(fā)育[9]。還與多種植物激素關(guān)系極為密切，尤其是與赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）共同構(gòu)成了復雜的激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10]。例如，擬南芥中的GASA4和GASA6通過調(diào)節(jié)活性氧（ROS）水平和氧化還原狀態(tài)來促進種子萌發(fā)和莖伸長[6]。在葡萄和桃樹中，GASA基因家族成員對激素的響應(yīng)會因植物的發(fā)育階段以及組織類型的不同而表現(xiàn)出差異[4，"7]。

赤霉素是一類四環(huán)二萜類植物激素，在種子萌發(fā)、細胞伸長和細胞分裂等多個植物生長發(fā)育過程及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要功能[11-12]。外源GA4處理能夠加速青梅（Prunus"mume）休眠的解除，而在葡萄藤的芽休眠解除期間檢測到GA1的增加[13-14]。因此，GA參與果樹冬芽休眠解除，具有正向作用[13-14]。而GASA基因家族作為DELLA蛋白下游的重要靶基因，與赤霉素信號傳導路徑緊密相連，極有可能在植物的休眠起始、維持以及解除等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的功能[11]。

桑樹（Morus"sp.）不僅是傳統(tǒng)養(yǎng)蠶業(yè)的主要飼料來源，同時也是藥食同源的重要植物資源，具有極高的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值。隨著“北桑南移”“立桑為業(yè)，多元發(fā)展”的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，果桑在鄉(xiāng)村振興和人們健康食品來源中發(fā)揮重要作用，但隨著全球溫度升高和產(chǎn)業(yè)南移，低溫不足引起的冬芽萌芽率低和不整齊成為果桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，引種至熱帶地區(qū)的桑樹無法正常萌發(fā)，利用單氰胺涂抹休眠芽可以使其在同一時間萌芽并結(jié)果[15]。已有研究表明，桑樹的DAM基因、ABA合成與分解相關(guān)基因等具有調(diào)控桑樹休眠的功能[16-17]。然而，可能參與休眠調(diào)控的GASA基因在桑樹中仍未被鑒定和分析。這限制了我們在桑樹品種改良中充分利用GASA基因的潛力——即通過調(diào)控其表達、挖掘功能等方式，來提升桑樹抗逆性、改善桑葉品質(zhì)及優(yōu)化休眠特性等重要農(nóng)藝性狀。因此，本研究在全基因組范圍內(nèi)對桑樹MaGASA家族成員進行鑒定，對其基因和蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白特性、系統(tǒng)進化關(guān)系、啟動子順式作用元件等進行分析，并探究MaGASA基因家族在不同組織、不同品種以及單氰胺處理桑芽解除休眠過程中的表達模式，探討桑樹MaGASA基因家族可能的生物學功能，旨在為后續(xù)深入研究桑樹MaGASA基因家族在冬芽休眠中的功能提供參考，同時為桑樹分子育種提供候選基因及分子理論基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""桑樹GASA家族基因成員鑒定

基于NCBI官網(wǎng)（https：//www.ncbi.nlm.nih."gov/）獲取的桑樹基因組數(shù)據(jù)，使用hmmer軟件鑒定基因家族。在InterPro數(shù)據(jù)庫（https：//www."ebi.ac.uk/interpro/）直接搜索關(guān)鍵詞，得到相應(yīng)的pfam號（PF03106），下載hmm文件。用hmmsearch工具鑒定基因家族，提取結(jié)構(gòu)域序列后截取結(jié)構(gòu)域，使用muscle工具對結(jié)構(gòu)域進行比對后建立物種特異性hmm模型，再次搜索。篩選hmmsearch結(jié)果中E-valuelt;0.001的記錄。獲得初步基因家族的基因列表，利用seqkit軟件得到對應(yīng)基因的蛋白序列，通過在線數(shù)據(jù)庫確認結(jié)構(gòu)域是否存在，同時確認結(jié)構(gòu)域長度。最后共鑒定出12個桑樹GASA基因。

1.2""桑樹總RNA提取及基因全長的獲得

取桑樹品種四季果72的莖、葉、果、芽不同部位，四季果72、大十、拐桑等12個桑樹品種的休眠芽，以及單氰胺處理0、72、120、168、216"h的無籽大10的休眠芽，每個樣品設(shè)置3個重復，液氮研磨后使用CTAB法分別提取RNA，利用HiScript"Ⅲ"RT"SuperMix"for"qPCR"（+gDNA"wiper）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.3""桑樹GASA家族成員理化性質(zhì)分析

利用TBtools軟件對得到的蛋白序列文件進行理化性質(zhì)分析，得到GASA基因家族中12個基因的氨基酸、理論等電點及分子量等信息。

1.4""桑樹GASA家族成員的染色體定位

從數(shù)據(jù)庫中得到GASA家族成員的染色體位置信息，利用MapChart軟件（https：//www.wur.nl/"en/show/Mapchart.htm）繪制GASA在染色體中的位置。

1.5""桑樹GASA蛋白進化樹分析

采用鄰接法（neighbor-joining，"NJ），使用MEGA軟件構(gòu)建桑樹、擬南芥、楊樹、桃、葡萄GASA蛋白家族的系統(tǒng)進化樹，檢驗參數(shù)bootstrap重復為1000次，其他參數(shù)均為默認值。

1.6""桑樹GASA基因啟動子順式作用元件分析

利用NCBI網(wǎng)站獲得GASA家族各成員起始密碼子上游2000"bp的序列，將獲得的序列提交至Plant"Care網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent."be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件預測。

1.7""桑樹GASA家族結(jié)構(gòu)域及保守motif分析

利用MEME、GSDS"2.0（http：//gsds.gao-lab."org/）在線工具分析桑樹GASA家族結(jié)構(gòu)域及保守motif。

1.8""桑樹GASA蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

分別利用SOPMA（https：//npsa.lyon.inserm.fr/"cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）及swiss-model在線工具（https：//swissmodel."expasy.org/）預測GASA蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

1.9""轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得

試驗采樣前1"d，對桑樹田進行漫灌，直至土壤充分濕潤，表面可見少量積水。選擇桑樹品種大十樹齡一致的12株植株作為試材，每株植株選取6根生長狀況相近的枝條，先取各枝條上的休眠芽作為0"h（CK0h）的樣本，采后迅速置于液氮中保存；然后將每株植株的6根枝條平均分為2組，其中3根枝條使用2%單氰胺溶液均勻涂抹休眠芽，其余3根枝條使用等量的清水進行涂抹。涂抹處理后，分別在72、120、216"h，從各處理組的枝條上采集休眠芽樣本。用清水處理分別為CK72h、CK120h、CK216h，單氰胺溶液處理分別為HC72h、HC120h、HC216h。樣本采集后，在液氮環(huán)境下迅速進行研磨，樣品送至武漢邁維代謝生物科技股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組檢測。

1.10""桑樹GASA基因的表達分析

根據(jù)GASA各基因序列，設(shè)計特異定量引物（表1），利用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的定量試劑盒（ChamQ"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix），每個樣品設(shè)置3個重復，參照說明書進行GASA的特異擴增，以桑樹的Actin基因作為內(nèi)參，使用熒光定量PCR儀（Thermo"Fisher"Scientific）擴增。反應(yīng)程序：95"℃預變性15"min；95"℃變性10"s，60"℃退火30"s，72"℃延伸30"s，40個循環(huán)。采用2–??CT進行數(shù)據(jù)分析，并使用IBM"SPSS"Statistics"27軟件進行差異顯著性分析，利用origin"2021軟件作圖。

2""結(jié)果與分析

2.1""桑樹GASA家族成員理化性質(zhì)分析以及染色體定位

在InterPro網(wǎng)站下載hmm模型，使用hmmsearch工具鑒定基因家族，通過2次比對，篩選到桑樹12個GASA基因家族成員，使用TBtools軟件進行理化性質(zhì)分析。根據(jù)chr1～chr14染色體從上到下的位置，將其命名為MaGASA1～"MaGASA12。從表2中可以看出，GASA基因家族成員間氨基酸數(shù)量與分子量存在明顯差異，氨基酸數(shù)從87～272不等，分子量相應(yīng)在9232.87～28"043.82"kD之間變化，暗示其功能多樣性。理論等電點范圍為5.02～10.10，MaGASA1等電點為5.02，呈酸性，MaGASA9等電點為10.10，呈堿性，其余成員的等電點分布在二者之間，顯示出成員酸堿性質(zhì)的差異。不穩(wěn)定指數(shù)高低有別，高指數(shù)成員MaGASA1（60.15）可能更易降解，低指數(shù)成員則相對穩(wěn)定，不穩(wěn)定指數(shù)較高的成員可能在體內(nèi)更容易降解，其半衰期較短，可能需要更頻繁地合成來維持其功能；而不穩(wěn)定指數(shù)低的成員相對更穩(wěn)定，可能在細胞內(nèi)長期存在并持續(xù)發(fā)揮作用。脂肪族指數(shù)的差異意味著熱穩(wěn)定性和柔韌性不同。親水性平均系數(shù)反映了成員的親疏水特性，有正有負，MaGASA3的親水性平均系數(shù)為0.141，相對疏水，MaGASA2為–0.447，相對親水。親水性強的可能更多存在于細胞質(zhì)等水環(huán)境，疏水性稍強的可能與細胞膜等疏水結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)更緊密。

通過NCBI檢索得到GASA基因家族成員在染色體中的起始位置和基因長度，并利用Map"Chart軟件繪制染色體分布圖（圖1）。與蘋果[18]、大豆[19]及萵苣[20]類似，GASA基因在桑樹14條染色體上分布不均勻。發(fā)現(xiàn)GASA基因家族成員分別分布于2號、3號、5號、6號、7號、8號、10號、14號等8條染色體上；MaGASA1、MaGASA7、MaGASA3、MaGASA4位于染色體中位區(qū)，其中MaGASA3、MaGASA4可能屬于大片段復制基因?qū)Γ籑aGASA2、MaGASA8、MaGASA6、MaGASA9、MaGASA10、MaGASA12位于染色體上端，其中MaGASA9和MaGASA10基因不僅處于同一染色體上，且二者距離很近，這種緊密的毗鄰關(guān)系強烈暗示它們構(gòu)成了基因簇；MaGASA5、MaGASA11位于染色體下端。

2.2""不同物種GASA基因家族進化樹分析以及基因復制

對擬南芥、桃、葡萄、毛果楊和桑樹共計77個GASA蛋白進行進化樹分析。根據(jù)序列相似性聚類，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可分為3類：Ⅰ類（18個基因）、Ⅱ類（25個基因）、Ⅲ類（34個基因）。系統(tǒng)進化樹顯示，桑樹與桃出現(xiàn)了相對頻繁的基因共支特征。具體表現(xiàn)為：MaGASA11和桃的PRUPE"3G161500處于同一分支，MaGASA9與PRUPE"3G279500在另一分支上匯聚，MaGASA3與PRUPE"1G365600也在另一分支上匯聚（圖2A）。鑒于這些基因在進化樹上的緊密聚類，從進化角度推測，這些處于同一分支的基因很可能具有相似的功能。與本研究所選的其他物種相比，桑樹與桃相關(guān)基因的共支情況表明，這可能是由于二者都是薔薇目植物，也暗示了二者在這些基因所代表的遺傳層面上擁有比本研究所選其他物種更近的親緣關(guān)系以及更為相似的親緣演變軌跡。這意味著在漫長的進化歷程中，這2個物種在這些基因相關(guān)的遺傳信息傳遞與演化上，可能經(jīng)歷了較為相似的選擇壓力和遺傳漂變過程。

基因復制驅(qū)動著基因組和遺傳系統(tǒng)的進化，并促成了基因家族中基因結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。MaGASA基因的3個全基因組重復（WGD）對（MaGASA5/7、MaGASA8/10和MaGASA9/12）分布在5條染色體上（圖2B）。

通過創(chuàng)建多個物種共線性圖揭示MaGASA基因與擬南芥、毛果楊、桃和葡萄的進化關(guān)系（圖2C）。共線性分析顯示，MaGASA基因的多個拷貝存在于其他物種中，其中在桑樹基因組中發(fā)現(xiàn)了6個拷貝，在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)了7個拷貝，在毛果楊基因組中發(fā)現(xiàn)了11個拷貝，桃基因組中發(fā)現(xiàn)7個拷貝。這表明不同物種間MaGASA基因拷貝數(shù)的差異可能反映了它們在進化歷程中經(jīng)歷了不同的選擇壓力和基因復制事件。桑樹、擬南芥、毛果楊、桃以及葡萄中拷貝數(shù)的不同或許暗示著該基因在各物種中的功能分化和適應(yīng)性變化。特別是桑樹的6個拷貝中有3個在5個物種中均存在同源基因，這可能代表著這些拷貝在物種進化過程中具有相對保守的功能和重要的生物學意義。

2.3""桑樹GASA基因結(jié)構(gòu)域及蛋白保守motif分析

保守motif的存在可以進一步用于對基因家族進行分類。在桑樹MaGASA基因結(jié)構(gòu)域及蛋白保守motif分析中，由于motif"1普遍存在于所有MaGASA基因中，推測motif"1所對應(yīng)的氨基酸序列可能執(zhí)行GASA基因家族最基礎(chǔ)和保守的功能；motif"2和motif"4在除MaGASA1之外的所有基因中發(fā)現(xiàn)；而motif"9僅在MaGASA2和MaGASA7中存在（圖3），說明這2個基因在功能上可能存在緊密聯(lián)系，擁有一些區(qū)別于其他成員的特殊功能，或許與特定的生理過程或細胞環(huán)境響應(yīng)有關(guān)。含相同保守motif的蛋白，或形成相似結(jié)構(gòu)域，具備相似功能，參與類似生化反應(yīng)或信號通路[21]。例如，motif"6和motif"8在MaGASA1和MaGASA2中被發(fā)現(xiàn)，可能表明這2個基因在結(jié)構(gòu)和功能上具有相似性。根據(jù)motif的分布和差異，進一步推測基因家族內(nèi)不同亞組的motif差異可能導致它們在生物學功能上的多樣性。這與已有研究一致，已有研究表明，具有相同motif的基因在同一亞組內(nèi)可能執(zhí)行相似的功能，而不同亞組之間的motif差異可能使其具有不同的功能[22]。motif"3僅存在于MaGASA9，這暗示MaGASA9可能在進化過程中獲得了獨特的功能，與其他家族成員有所差異。值得注意的是，4個MaGASA家族蛋白成員同時含有4個motif，這些motif可能共同構(gòu)成特定的蛋白結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域往往具有特定的空間結(jié)構(gòu)和功能，推測這些蛋白在結(jié)構(gòu)上具有相似性，可能在細胞內(nèi)參與類似的生化反應(yīng)或信號通路[23]。不同的motif組合可能決定了MaGASA蛋白與其他蛋白之間的相互作用特異性，不同motif組合的蛋白與另一組蛋白相互作用，從而構(gòu)建起復雜的細胞內(nèi)相互作用網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控生物學過程。這類似于擬南芥中fruitfull（ful）亞家族的MADS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子通過一個關(guān)鍵的氨基酸motif決定其與agamous和sepallata蛋白的相互作用特異性[24]。

2.4""桑樹GASA基因啟動子順式作用元件分析

基因的轉(zhuǎn)錄表達高度依賴于該基因的上游啟動子區(qū)，選取MaGASA上游2000"bp序列作為啟動子，分析其順式作用元件。結(jié)果顯示，12個MaGASA基因啟動子區(qū)包含多種順式作用元件（表3）。選取與桑樹休眠現(xiàn)象相關(guān)的激素類順式作用元件作為研究對象，發(fā)現(xiàn)其中含有脫落酸響應(yīng)元件（ABRE、ABRE2、ABRE3a、ABRE4）、赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif、P-box）、乙烯響應(yīng)元件（ERE），以及其他參與植物激素信號轉(zhuǎn)導的一類順式作用元件（TGA-box、TGACG-motif）。此外，還發(fā)現(xiàn)了與桑樹休眠相關(guān)的低溫響應(yīng)元件（LTR）、光響應(yīng)元件（TCT-motif），這和其他物種中GASA基因啟動子中順式作用元件基本一致[25]。GASA基因啟動子上的順式作用元件分析表明，桑樹可能經(jīng)過低溫春化后，通過調(diào)控激素相關(guān)作用元件，特別是赤霉素響應(yīng)元件，使桑芽萌動伸長。通過進一步研究，如使用CRISPR/Cas基因組編輯系統(tǒng)和過表達等手段，可以闡明這些順式調(diào)節(jié)元件的作用[26]。

2.5""MaGASA蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預測

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)有助于蛋白質(zhì)功能的準確表征[27]?；趯aGASA基因家族的二級空間結(jié)構(gòu)的預測（表4），發(fā)現(xiàn)MaGASA基因家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)卷曲和α-螺旋組成，但也存在延伸鏈。在葡萄[4]、蘋果[18]、白菜[25]和谷子[28]的GASA蛋白中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)構(gòu)特征，并且由于α-螺旋的存在，GASA基因的所有蛋白質(zhì)均具有柔性結(jié)構(gòu)，MaGASA的三級結(jié)構(gòu)如圖4所示。

2.6""GASA基因家族在桑樹不同部位的表達分析

從圖5中可以看出，MaGASA基因家族成員的組織表達模式存在差異。MaGASA1、MaGASA2、MaGASA4、MaGASA6在葉片中表達量最高，其中MaGASA1、MaGASA2、MaGASA6在葉片的相對表達量顯著高于其他部位，MaGASA4顯著高于除芽外的其他部位，值得注意的是，這幾個基因均含有光響應(yīng)順式作用元件，這暗示它們可能在桑樹葉片

的發(fā)育和光合作用中發(fā)揮重要功能。MaGASA3、MaGASA5、MaGASA7、MaGASA8、MaGASA10在莖中的表達量最高，其中MaGASA3、MaGASA7、MaGASA8、MaGASA10的相對表達量顯著高于其他部位，MaGASA5顯著高于除葉片外的其他部位。MaGASA11與MaGASA12在芽中的相對表達量顯著高于其他部位，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，MaGASA12可能在調(diào)控芽活動狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，也暗示MaGASA11與MaGASA12在芽發(fā)育或生理活動中具有重要意義。MaGASA基因家族成員在桑樹不同組織部位呈現(xiàn)顯著的差異表達模式，這種組織特異性表達為深入了解MaGASA基因家族在桑樹不同器官生長發(fā)育中的功能提供線索。

2.7""GASA基因家族在桑樹不同品種芽中的表達分析

通過對四季果72、大十、拐桑等12個具有代表性的桑樹品種展開GASA基因家族成員的表達量分析，結(jié)果顯示，MaGASA基因家族成員在各品種中呈現(xiàn)出豐富多樣的表達模式（圖6）。MaGASA1在強桑5號中的表達量顯著高于其他品種；MaGASA2在強桑5號和四季果72中的表達量顯著高于其他品種；MaGASA3在冀桑和紅瑪瑙中的表達量顯著高于其他品種；MaGASA4在黃金桑中的表達量最高，顯著高于其他品種；MaGASA5在川桑和紅瑪瑙中的表達量最高，顯著高于其他品種；MaGASA6在黑珍珠中的基因表達量顯著高于其他品種；MaGASA7在川桑中的表達量顯著高于除大十外的其他品種；MaGASA8在大十和拐桑中的表達量最高；MaGASA9在紅瑪瑙中的表達量最高；MaGASA10在黑珍珠和拐桑中的表達量顯著高于其他品種，其他品種間則無顯著差異；MaGASA11在冀桑中的表達量顯著高于其他品種，除冀桑外，其他品種之間無顯著差異；MaGASA12在川桑中的表達量顯著高于其他品種。

2.8""GASA基因家族在桑樹休眠解除中的表達分析

GASA基因家族各成員轉(zhuǎn)錄組熱圖表明，在休眠芽經(jīng)單氰胺處理不同時間后，其表達量發(fā)生了明顯變化（圖7）。與對照（CK）相比，經(jīng)單氰胺處理（HC）不同時間后其整體表達量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，MaGASA12和MaGASA10明顯響應(yīng)休眠信號的解除。通過RT-qPCR分析（圖8），單氰胺處

理后MaGASA12的表達量明顯下調(diào)，這種變化模式與番茄成熟過程中SiGASA1表達量的下調(diào)相似[29]，表明該基因可能使桑芽維持休眠狀態(tài)。但MaGASA10的表達量在經(jīng)過單氰胺處理后急劇上調(diào)，對休眠解除信號的響應(yīng)最為強烈，這與梅花的PmGASA16在花芽休眠解除后的高表達情況一致[30]，這充分表明MaGASA10極有可能是桑樹休眠解除過程的重要基因。

3""討論"

赤霉素主要通過降解DELLA蛋白，釋放PIFs轉(zhuǎn)錄因子與GASA基因家族成員的啟動子位點相結(jié)合，從而推進細胞伸長進程[11-12]。GASA蛋白在植物生長發(fā)育、逆境脅迫、激素信號轉(zhuǎn)導等方面起著非常重要的作用[12，"25，"28]。

本研究在桑樹基因組中鑒定了12個GASA基因，并對這些基因的生物信息學和表達模式進行了分析。與其他物種相比，可能由于桑樹與桃均為薔薇目植物，具有更近的親緣關(guān)系，出現(xiàn)了相對頻繁的基因共支特征。部分學者認為果樹休眠受低溫調(diào)控，需要滿足一定的冷量才可解除其休眠狀態(tài)，在解除休眠過程中激素發(fā)揮著重要作用[31]。同時鈣網(wǎng)蛋白被認為是GA信號通路中的關(guān)鍵蛋白，因為其在激素信號通路中具有重要意義，而激素信號通路又可能參與山毛櫸種子休眠的解除及其萌發(fā)[32]?；趯に匦盘柣虮磉_模式的研究，其被認為是休眠調(diào)控的關(guān)鍵因素[33]。在桑樹的MaGASA啟動子區(qū)域篩選出與激素相關(guān)以及低溫和光響應(yīng)順式作用元件，其中赤霉素相關(guān)順式作用元件同樣在其啟動子區(qū)域中被發(fā)現(xiàn)，這和其他物種GASA基因啟動子的順式作用元件基本一致[25]。通過研究GASA基因啟動子的順式作用元件表明，桑樹可能經(jīng)過低溫春化后，通過調(diào)控激素相關(guān)作用元件，特別是赤霉素響應(yīng)元件，使芽萌動伸長。

單氰胺在解除果樹休眠中被廣泛應(yīng)用，在打破桑樹休眠上同樣具有良好效果。其中MaGASA10表達變化劇烈，暗示其在單氰胺誘導的桑芽休眠解除中起關(guān)鍵作用，PmGASA16在梅花花芽休眠解除后具有較強的誘導作用，表明PmGASA16在梅花花芽休眠解除中可能具有促進作用[30]。這或許表明單氰胺激活了這些基因，推動休眠解除相關(guān)生理進程。MaGASA12在單氰胺處理后顯著下調(diào)，伴隨休眠芽的萌動其表達量持續(xù)下降，這表明它極有可能是單氰胺打破桑樹休眠的關(guān)鍵調(diào)控基因；在ZHANG等[34]的研究中，AtGASA4促進擬南芥開花，而AtGASA5延遲或抑制擬南芥開花的情況相符。表明GASA基因家族成員在休眠解除過程中的引導通路較為復雜，而非單一途徑，可能引發(fā)多種信號通路互作，從而調(diào)整基因表達網(wǎng)絡(luò)，啟動休眠解除關(guān)鍵生理過程。

4""結(jié)論

本研究系統(tǒng)鑒定了桑樹MaGASA基因家族成員，分析了其理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育、基因復制和共線性，并對不同組織、品種和解除休眠過程的表達模式等進行了分析。結(jié)果顯示，12個MaGASA基因成員均包含保守的GASA結(jié)構(gòu)域，大多數(shù)基因表現(xiàn)出相似的理化特性，且在系統(tǒng)發(fā)育分析中分為3個類群，表明該基因家族在桑樹中具有較高的多樣性?；驈椭坪凸簿€性分析揭示了MaGASA基因在基因組中的擴增，可能通過基因重復事件推動了基因家族的多樣性。此外，組織特異性表達模式的分析表明，MaGASA12在芽中表達量顯著高于其他部位，提示其在芽發(fā)育過程中可能具有重要作用。同時，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，顯示該基因的表達可能與桑芽休眠有關(guān)。因此，今后將考慮通過敲除或沉默該基因以探究其作用。此外，MaGASA10在單氰胺處理后的表達量急劇上調(diào)，該基因可能是促進桑樹萌芽的關(guān)鍵基因之一。未來的研究可以通過過表達MaGASA10來驗證其功能，以進一步闡明該基因在休眠解除中的作用。

綜上所述，本研究為桑樹MaGASA基因家族的功能研究提供了系統(tǒng)的生物信息學分析，揭示了基因家族成員在基因組中的擴增、進化以及組織特異性表達的特點，并重點關(guān)注了MaGASA10和MaGASA12基因表達量的變化，為今后的研究提供研究思路。

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