[關(guān)鍵詞]腦缺血再灌注損傷；芒柄花素；鐵死亡；ACSL4/LPCAT3/GPX4軸；神經(jīng)保護 [中圖分類號]R285.5 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.06.001

Formononetin alleviates neuronal ferroptosis in cerebral ischemiareperfusion injury by modulating ACSL4/LPCAT3/GPX4 expression

MA Qiang'， OUYANG Xinyi'， YAN Siyang2， LIU Lijuan2， ZHOU Desheng2* 1.HunanUniversityofChineseMedicine，ChangshaHunan41O2O8，China;2.TheFirstHospitalofHunanUniersityof Chinese Medicine，Changsha， Hunan 41ooo7，China

[Abstract]Objective Toinvestigatewhetherformononetinexertsneuroprotectivefectsincerebral ischemia-reperfusion injury（CIRI）byregulatingtheACSL4/LPCAT3/GPX4signalingaxistoinhibitneuronalferoptosis.MethodsThemodifiedsuture methodwasused to establish aratmodel of midlecerebral arteryocclusion/reperfusion （MCAO/R）.Ashamoperationgroup，a model group，low-，medium-，andhigh-doseformononetin （FMN）groups，andanedaravonecontrolgroupweresetup.Neurological functionwasasessedusingtemodifiedurologcalseveritycoe（m）Hstopathologicalchangesinbraintisseeeaated byHE，Nissl，and silver staining.Neuronal apoptosis was detected by TUNEL staining.The levels of Fe²⁺ MDA，LPO，GSH/GSSG， andROSweresiultaneouslymeasuredtoessferoptosishileWsternblotfocyometryndiunofluorescnceere usedtodetecttheexpressonofkeyferoptosis-relatedproteinsResultsComparedwithtemodelgroup，formononetinsignifiantly improvedheurologicaldeficitsandhistopathologicalchangesinatseducedtheproportionofapoptoticcellsandrotosis related indicators （ Fe²⁺ ，MDA， LPO， ROS）， and increased antioxidant level （GSH/GSSG） P- lt;0.05， Plt;0.01 1）.flow cytometry results showed that formononetin significantly reduced the expression ratio of ACSL4/LPCAT3 double-positive cells （Plt;0.01 ；immunofluorescence resultsshowed that formononetin reduced the expression levels of ACSL4 and LPCAT3 in brain tissue（ P- lt;0.05， P?0.01 1）.Conclusion Formononetincaninhibit feroptosis byregulating theexpressionofACSL4/LPCAT3/GPX4，allviatenerveinjuycausedbyCIRI and provide theoretical support for its application in the adjuvant treatment of ischemic stroke.

[Keywords]cerebral ischemia-reperfusion injury;formononetin; feroptosis;ACSL4/LPCAT3/GPX4axis;neuroprotection

腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfu-sioninjury，CIRI是急性腦卒中，特別是缺血性腦卒中的重要發(fā)病機制之一，其發(fā)生機制復(fù)雜，涉及多種細胞死亡方式、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激與自由基損傷等環(huán)節(jié)[1-2]。目前，盡管溶栓和血管再通治療可在一定程度上挽救缺血半暗帶的腦組織，但再灌注過程往往伴隨氧化應(yīng)激加劇、炎癥因子釋放、線粒體功能障礙以及細胞程序性死亡激活等病理過程，進而造成繼發(fā)性神經(jīng)損傷，嚴(yán)重影響預(yù)后[3]。因此，尋找有效的神經(jīng)保護策略以減輕CIRI仍是當(dāng)前中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治研究的熱點和難點。

近年來，鐵死亡作為一種新型細胞程序性死亡方式，在CIRI中的重要作用逐漸受到關(guān)注。鐵死亡不同于凋亡、壞死和自噬，具有鐵離子依賴性和脂質(zhì)過氧化積聚兩大特征，其關(guān)鍵調(diào)控因子包括乙酰輔酶A合成酶長鏈家族成員4（acetyl-CoA synthetaselong-chain familymember4，ACSL4）溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltrans-ferase3，LPCAT3）、15-脂加氧酶（arachidonate15-lipoxygenase，ALOX15）及谷胱甘肽過氧化物酶4（glu-tathioneperoxidase4，GPX4）等[5-。研究表明，ACSL4可促進多不飽和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacids，PUFAs）整合入膜脂質(zhì)，為鐵死亡提供底物基礎(chǔ)[;LPCAT3可進一步將磷脂酰乙醇胺修飾為鐵死亡靶向底物；ALOX15可催化PUFAs氧化生成脂質(zhì)過氧化物；而GPX4則作為抑制鐵死亡的關(guān)鍵酶，能夠清除細胞內(nèi)的過氧化脂質(zhì)8-9。上述因子的動態(tài)變化共同決定了鐵死亡的發(fā)生與進展。因此，從鐵死亡信號通路入手，干預(yù)關(guān)鍵因子表達，有望成為緩解CIRI的重要靶點[10]。

芒柄花素（formononetin，F(xiàn)MN）是一種廣泛存在于豆科植物中的天然異黃酮類化合物，具有良好的脂溶性和生物活性，已在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中顯示出抗氧化、抗炎及抗調(diào)亡等神經(jīng)保護作用。已有研究表明，芒柄花素可通過調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）通路、清除活性氧（reactiveoxygen species，ROS）、穩(wěn)定線粒體功能等機制減輕神經(jīng)元損傷[12-13]。然而，芒柄花素是否可通過調(diào)控鐵死亡通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，目前研究尚不充分，尤其是在腦缺血再灌注背景下對鐵死亡關(guān)鍵靶點的影響仍需進一步明確

本研究以改良線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型，系統(tǒng)評估芒柄花素對神經(jīng)功能、組織形態(tài)及細胞死亡的干預(yù)效果，并結(jié)合TUNEL染色、鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測[亞鐵離子（ferrous ion， Fe²⁺ ）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）脂質(zhì)過氧化物（lipid per-oxidationLPO）還原型/氧化型谷胱甘肽比值（reducedglutathione/Oxidized glutathione ratio， GSH/GSSG ra-tio）]、二氫乙啶熒光探針（dihydroethidium，DHE）檢測ROS，全面揭示其抗氧化及抗鐵死亡潛力。同時，采用流式細胞術(shù)、免疫熒光和Westernblot等多種手段，檢測鐵死亡關(guān)鍵蛋白ACSL4、LPCAT3、ALOX15和GPX4的表達變化，進一步結(jié)合分子對接技術(shù)，預(yù)測芒柄花素與上述蛋白的結(jié)合位點和親和力，以從結(jié)構(gòu)水平驗證其潛在靶向機制。旨在從多層面揭示芒柄花素對CIRI的保護作用及其分子機制，為臨床腦卒中輔助治療提供實驗依據(jù)和理論支持。

1材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量（ 220± 20） g ，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號為SCXK（湘）2021-0002。大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK（湘）2024-0014，室溫控制在 ，相對濕度 50% 260% ，晝夜節(jié)律為 ^12h 光照 /12h 黑暗，自由飲水、進食標(biāo)準(zhǔn)飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開展實驗。動物實驗方案已獲湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（ZYFY20231110-209）。

1.2 實驗試劑

芒柄花素（質(zhì)量分?jǐn)?shù) ?98% ，貨號：HY-N0183）和依達拉奉（Edaravone，EDA，貨號：HY-B0O99）購自美國MedChemExpress公司;MCAO栓線（型號：2636A2，線徑 0.36mm 系列）購自北京西濃科技有限公司；腦組織染色試劑包括HE染色液（貨號：G1120）、尼氏染色液（貨號：G1434）、銀染試劑盒（貨號：G3260），均購自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL細胞凋亡試劑盒（顯色法，貨號：C1098）MDA檢測試劑盒（貨號：S0131）、GSH檢測試劑盒（貨號：S0053）、RIPA裂解液（貨號：P0013B）BCA蛋白定量試劑盒（貨號：P0010）及ECL發(fā)光液（貨號：P0018S）均購自Beyotime公司;DHEROS檢測試劑盒（貨號：HR8821）購自北京百奧萊博科技有限公司； Fe²⁺ 檢測試劑盒（貨號：E-BC-K773-M）購自Elabscience公司;PVDF膜（貨號：IPVH0001O）購自Millipore公司;ACSL4抗體（貨號：ab155282）LPCAT3抗體（貨號：ab189830）、ALOX15抗體（貨號：ab244205）、GPX4抗體（貨號：ab125066） β -actin抗體（貨號：ab8226）及HRP標(biāo)記二抗（貨號分別為：ab205718、ab205719）均購自Abcam公司;免疫熒光相關(guān)抗體Cy3-標(biāo)記羊抗兔IgG（貨號：bs-0295G-Cy3）FITC-標(biāo)記羊抗鼠IgG（貨號：bs-0296G-FITC）及DAPI染色液（貨號：C02-04001）均購自Bioss公司。

1.3 實驗設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（型號：HH-4）購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機（型號：5424R）購自德國Eppendorf公司；全波長酶標(biāo)儀（型號：Multi-skanFC）購自美國ThermoScientific公司;電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（型號：Mini-PROTEAN Tetra System）和凝膠成像系統(tǒng)（型號：ChemiDoc XRS+ 均購自美國Bio-Rad公司；熒光顯微鏡（型號：BX53）購自日本Olympus公司；石蠟切片機（型號：RM2016）與冰凍切片機（型號：CM1950）均購自德國Leica公司；組織勻漿器（型號：Mini-Beadbeater）購自美國Biospec公司，流式細胞儀（BDFACSCantoII）購自BDBio-sciences。

1.4 實驗方法

1.4.1大鼠CIRI（MCAO/R）模型建立及分組處理采用改良線栓法建立MCAO/R模型：使用戊巴比妥鈉L 50mg?kg^-1 麻醉大鼠后取仰臥位，頸部正中切開，鈍性分離暴露右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）頸內(nèi)動脈（internalcarotid artery，ICA）和頸外動脈（external carotid artery，ECA）。在CCA 和ICA近心端暫時夾閉，結(jié)扎ECA遠心端并剪開小口，插入MCAO拴線（線徑為 0.36mm ，從ECA插入ICA，沿ICA緩慢推進至大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）起始部位[約（ 18±0.5 ）mm]，松開動脈夾，固定線栓，維持缺血 2h 后輕柔拔出線栓恢復(fù)ICA血流，再灌注 24h 。假手術(shù)組僅分離血管，不插線栓。術(shù)中保持動物體溫在 （37.0±0.5 ） C 。術(shù)后動物清醒后轉(zhuǎn)移至溫暖籠盒，自由飲水和進食。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為： mNSS 評分 ?1 分，且TTC染色顯示明顯梗死區(qū)域[13]。

實驗大鼠隨機分為6組，每組10只，具體分組及干預(yù)措施如下。1）假手術(shù)組：僅分離頸動脈，不插線栓，每日腹腔注射生理鹽水；（2）模型組：制備MCAO/R模型，每日腹腔注射生理鹽水；（3）芒柄花素低劑量組：MCAO/R模型，每日腹腔注射芒柄花素0 10mg?kg^-1 ）;（4）芒柄花素中劑量組：MCAO/R模型，每日腹腔注射芒柄花素（ 20mg?kg^-1 ;（5）芒柄花素高劑量組：MCAO/R模型，每日腹腔注射芒柄花素 （40mg?kg^-1） [2]；（6）依達拉奉組：MCAO/R模型，每日腹腔注射依達拉奉 ）。各組均連續(xù)給藥 ^7d 。

1.4.2改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurologi-calseverityscore，mNSS）采用mNSS對大鼠CIRI后的神經(jīng)功能進行評估。mNSS評分包括運動功能（0＼～6分）感覺功能（0＼～2分）平衡功能（0＼～6分）和反射（0＼～4分）4個方面，總分為0＼～18分，分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，評分細則詳見參考文獻[13]，并結(jié)合本課題組前期研究實際操作流程加以實施。于治療后1、3、7d，由兩名對實驗分組情況不知情的研究人員分別獨立評分，并取平均值用于統(tǒng)計分析，評分越高表明大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.4.3HE、尼式、鍍銀染色取 4% 多聚甲醛固定保存的5只大鼠腦組織，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并連續(xù)切成 4μm 厚冠狀切片。分別進行HE 染色和尼氏染色。 HE 染色：切片脫蠟水化后，蘇木素染色 5min ，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，流水沖洗后伊紅染色 2min ；尼氏染色：切片脫蠟水化后，置于 0.5% 甲苯胺藍染液37℃孵育 15min ，蒸餾水沖洗；鍍銀染色：切片脫蠟水化后置于銀氨溶液37°C 孵育 甲醛溶液顯色， 5% 硫代硫酸鈉定影。染色后切片均經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄神經(jīng)元形態(tài)、核固縮、壞死、尼氏小體變化以及神經(jīng)元軸突和神經(jīng)纖維損傷情況，綜合評估腦組織病理損傷程度。參照課題組前期[13]，對HE染色切片中的神經(jīng)元排列、形態(tài)、出血、水腫及壞死等指標(biāo)進行綜合判定，評分范圍為0＼～4分，分值越高表示病理損傷越嚴(yán)重。采用ImageJ計算尼式小體數(shù)目和銀染陽性面積比。

1.4.4TUNEL染色取 4% 多聚甲醛固定保存的5只大鼠腦組織，采用TUNEL染色試劑盒檢測腦組織石蠟切片，嚴(yán)格按說明書操作。組織經(jīng) 4% 多聚甲醛固定 24h 后石蠟包埋，切片厚度為 4μm， 。切片經(jīng)二甲苯脫蠟2次（每次 5～10min， ，依次經(jīng)無水乙醇 90% 乙醇、 70% 乙醇及蒸餾水梯度水化。滴加 20μg?mL^-1 無DNA酶污染的蛋白酶 ^K，37 孵育 20min 進行抗原修復(fù)，PBS沖洗3次。隨后于 3% H₂O₂/PBS 中室溫孵育 20min 封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌3次。按比例配制TdT酶與Biotin-dUTP的生物素標(biāo)記液，每張切片滴加 50μL，37 °C 避光孵育 60min 終止液終止反應(yīng)后PBS沖洗3次。滴加Strepta-vidin-HRP工作液，室溫孵育 30min ，PBS洗滌后加DAB顯色 5～10min ，顯色結(jié)束后立即終止并PBS沖洗。可選蘇木素復(fù)染細胞核，脫水、透明后中性樹膠封片。TUNEL陽性細胞核呈棕黃色，非凋亡細胞核呈藍色，通過ImageJ軟件計算陽性率（TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）以定量評估細胞凋亡水平。

1.4.5 Fe²⁺ 、MDA、LPO、GSH含量檢測取 -80°C 冰凍保存的5只大鼠缺血側(cè)腦組織，使用預(yù)冷生理鹽水清洗去血，吸干后稱重。按1：9的組織質(zhì)量與裂解液體積比例，加入試劑盒提供的裂解液制備 10% 腦組織勻漿。于4 C 下勻漿后，以 （半徑8.4cm 離心 10min ，取上清用于各項指標(biāo)檢測。

Fe²⁺ 含量采用亞鐵離子比色法，組織勻槳與顯色液反應(yīng)后于 593nm 波長測定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算鐵離子濃度，評估鐵積聚水平；MDA含量采用硫代巴比妥酸法，勻槳上清與檢測液反應(yīng)后 100^°C 加熱 15min ，離心后于 532nm 波長測定吸光度，反映脂質(zhì)過氧化水平；LPO含量采用比色法，勻漿上清與顯色劑反應(yīng)， 95° 加熱 40min 后在 535nm 處測定吸光度，計算LPO濃度;GSH含量通過GSH/GSSG檢測試劑盒測定，勻漿經(jīng)蛋白去除后與DTNB反應(yīng)， 412nm 測吸光度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線換算GSH濃度，反映組織抗氧化能力。

1.4.6ROS含量檢測取 -80°C 冰凍保存的5只大鼠缺血側(cè)腦組織，于冰凍切片機上切成厚度為 10μm 的冰凍切片，貼附于載玻片上。參照DHE活性氧檢測試劑盒說明書進行操作：切片自然晾干片刻后，滴加10μmol?L^-1 的DHE熒光探針工作液，37 C 避光孵育 30min ;用PBS洗滌3次，每次 5min ，以充分去除未進入組織內(nèi)的多余探針。用抗熒光淬滅封片劑封片后，于熒光顯微鏡下（激發(fā)波長約 518nm ，發(fā)射波長約 605nm ）觀察并拍照記錄紅色熒光信號。采用ImageJ軟件對圖像中平均熒光強度進行半定量分析，平均熒光強度與組織內(nèi)ROS水平呈正相關(guān)。

1.4.7流式細胞術(shù)檢測ACSL4與LPCAT3的共表達取 -80‰ 保存的5只大鼠缺血側(cè)腦組織，加入含蛋白酶抑制劑的預(yù)冷RIPA裂解液按質(zhì)量體積比1：10進行勻漿， 離心 10min 取上清，使用BCA法測定蛋白濃度。細胞懸液經(jīng)PBS重懸、調(diào)整濃度后，封閉液封閉 30min 以減少非特異性結(jié)合。隨后加入兔抗ACSL4抗體（Abcam，1：200）和小鼠抗LPCAT3抗體（Abcam，1：200），4℃避光孵育 ¹h 。PBS洗滌后分別加入PE標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（Bioss，1：300），室溫避光孵育 30min 。經(jīng)PBS充分洗滌、過濾后，使用BDFACSCantoⅡ流式細胞儀進行檢測。數(shù)據(jù)通過FlowJo10.0軟件分析，共表達細胞比例以Q2象限表示，用于評估鐵死亡相關(guān)蛋白ACSL4和LPCAT3的表達變化。

1.4.8ACSL4/LPCAT3免疫熒光染色取 4% 多聚甲醛固定的腦組織石蠟切片（厚度 4μm ），于二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后PBS洗滌。將切片置于pH6.0 檸檬酸緩沖液中微波修復(fù) 15min ，自然冷卻后PBS洗滌， 0.3% Triton _X-l00 處理 10min 以增加通透性。 5% BSA室溫封閉 ¹h 后，加入兔抗ACSL4（1：200）與小鼠抗LPCAT3（1：200）一抗混合液， 4‰ 孵育過夜。次日復(fù)溫 30min 后PBS洗滌，加入Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗（1：300），避光孵育 1h DAPI復(fù)染細胞核 5min PBS洗凈后封片。熒光顯微鏡下觀察，ACSL4陽性呈紅色，LPCAT3陽性呈綠色，細胞核呈藍色。采用ImageJ軟件對熒光強度進行半定量分析。

1.4.9Western blot檢測取 -80°C 冰凍保存的大鼠缺血側(cè)腦組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，按質(zhì)量體積比1：10制備勻漿， 1 84mm 離心 10min ，取上清BCA法測定蛋白濃度。取 等量蛋白加入加載緩沖液，95 C 變性5min 后進行SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。使用 5% 脫脂奶粉在室溫封閉 ¹h ，分別孵育一抗：ACSL4（1：3 000）LPCAT3（1：2 000）、ALOX15（1：2000）、GPX4（1：3000）和 孵育過夜。次日回溫 30min 后用TBST洗膜3次，每次 10min ，加入HRP標(biāo)記二抗（1：8000），室溫孵育 ¹h 。洗膜后使用ECL顯色液顯色，并在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下拍照。使用ImageJ軟件對各條帶灰度值進行分析，以目標(biāo)蛋白/β-actin灰度值比值表示相對表達水平，用于后續(xù)統(tǒng)計分析。

1.4.10統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗數(shù)據(jù)以‘ ”表示。正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗，方差齊性檢驗采用Levene檢驗。對于同時滿足正態(tài)分布和方差齊性的多組數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，并進行Tukey法或其他多重比較法的事后檢驗；對于不滿足正態(tài)性或方差齊性的數(shù)據(jù)，采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，并進行校正后的兩兩比較。mNSS評分在第1、3、7天分別進行組間比較，依據(jù)數(shù)據(jù)特性選擇相應(yīng)方法分析干預(yù)效果。以 Plt;0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1芒柄花素改善CIRI的神經(jīng)功能缺損

與假手術(shù)組相比，模型組在各時間點均顯示mNSS評分顯著升高 （Plt;0.01） ，干預(yù)組中，芒柄花素各劑量組及依達拉奉陽性組在不同程度上均可降低mNSS評分，與模型組比較，芒柄花素中劑量和芒柄花素高劑量組在第3天和第7天均顯著降低mNSS評分0 （Plt;0.01） ，芒柄花素低劑量組在第7天亦明顯降低mNSS評分 （Plt;0.01） ；依達拉奉組在第3天和第7天亦呈現(xiàn) 評分顯著降低 （Plt;0.01） 。此外，芒柄花素中劑量、高劑量組及依達拉奉組在干預(yù)后呈現(xiàn)出時間依賴性的神經(jīng)功能恢復(fù)趨勢（ Plt;0.01 。詳見表1。

2.2芒柄花素減輕CIRI大鼠腦組織病理損傷

假手術(shù)組海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元排列緊密有序，胞體圓整，核染色清晰，無明顯病理損傷；模型組神經(jīng)元排列紊亂，數(shù)量減少，胞體固縮、輪廓模糊，部分細胞出現(xiàn)核固縮、溶解及空泡變性，提示明顯的腦組織病理損傷；芒柄花素低劑量組病理損傷略有緩解，神經(jīng)元數(shù)量略增加，但仍有結(jié)構(gòu)紊亂；芒柄花素中劑量組細胞排列較為規(guī)整，神經(jīng)元密度提高；芒柄花素高劑量組組織結(jié)構(gòu)明顯改善，神經(jīng)元形態(tài)完整，排列接近正常，病理改變顯著減輕；依達拉奉組亦表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護作用，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較為清晰，排列較整齊。詳見圖1。

假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列緊密，胞體飽滿，尼氏小體著色深且分布均勻；模型組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，排列紊亂，尼氏小體染色變淺甚至消失，提示神經(jīng)元受損嚴(yán)重；芒柄花素低劑量組尼氏小體染色略增強，但神經(jīng)元排列仍不規(guī)整；芒柄花素中劑量組神經(jīng)元數(shù)量較模型組明顯增多，染色增強，神經(jīng)元形態(tài)逐漸恢復(fù)；芒柄花素高劑量組尼氏小體顯著增多，染色加深，細胞排列規(guī)整，接近假手術(shù)組水平；依達拉奉組亦表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護作用。詳見圖2。

假手術(shù)組神經(jīng)纖維排列整齊致密，走向規(guī)整，染色均勻，結(jié)構(gòu)完整；模型組神經(jīng)纖維明顯斷裂、排列紊亂，染色不均勻且變淺，出現(xiàn)大量顆粒狀或斑片狀沉積，提示神經(jīng)纖維變性嚴(yán)重。與模型組相比，芒柄花素干預(yù)各組均表現(xiàn)出不同程度的改善，其中芒柄花素低劑量組纖維結(jié)構(gòu)略有修復(fù)，但仍存在斷裂和染色減弱現(xiàn)象；芒柄花素中劑量組神經(jīng)纖維排列較為整齊，染色增強，斷裂減少；而芒柄花素高劑量組神經(jīng)纖維走向清晰、染色加深，與依達拉奉組表現(xiàn)相近，提示其可有效減輕神經(jīng)損傷。詳見圖3。

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織病理學(xué)評分顯著升高（ （Plt;0.01） ，尼氏小體數(shù)目顯著減少（ Plt; 0.01），銀染面積比顯著降低 （Plt;0.01） 。經(jīng)芒柄花素干預(yù)后，各組病理學(xué)評分均不同程度下降，神經(jīng)元數(shù)量和神經(jīng)纖維完整性得到改善。其中，芒柄花素低劑量組病理評分較模型組明顯下降，尼氏小體數(shù)目和銀染面積明顯升高 （Plt;0.01） ；芒柄花素中劑量組病理評分明顯降低（ （Plt;0.01） ，尼氏小體數(shù)目和銀染面積進一步升高（ Plt;0.01） ；芒柄花素高劑量組高劑量組評分下降 （Plt;0.01） ，尼氏小體數(shù)量明顯增多（ Plt; 0.01），銀染陽性面積顯著增加（ （Plt;0.01） ；而依達拉奉組作為陽性對照，亦表現(xiàn)出明顯神經(jīng)保護作用，病理學(xué)評分明顯下降 （Plt;0.01） ，尼氏小體數(shù)量明顯增多 （Plt;0.01） ，銀染陽性面積顯著增加（ Plt;0.01 ）。詳見表2。

2.3芒柄花素抑制CIRI大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡

TUNEL染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦組織中幾乎未見凋亡細胞，細胞核均呈藍色；而模型組則出現(xiàn)大量棕黃色TUNEL陽性細胞（ （Plt;0.01） 。與模型組比較，芒柄花素各劑量組均能有效減少TUNEL陽性細胞，其中高劑量組抑制效果最顯著，且與依達拉奉組接近 （Plt;0.01） 。詳見圖4、表3。

表2各組大鼠病理學(xué)評分、尼氏小體數(shù)目及銀染面積比較

表3各組大鼠TUNEL細胞比例

2.4芒柄花素調(diào)節(jié)CIRI大鼠腦組織鐵死亡相關(guān)指標(biāo)

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中 Fe²⁺ 濃度、MDA及LPO水平顯著升高 （Plt;0.01） ，而GSH/GSSG比值明顯下降 （Plt;0.01） 。芒柄花素干預(yù)后，各劑量組均可不同程度降低 Fe²⁺ 、MDA及LPO水平，提高GSH/GSSG 比值 （Plt;0.05，Plt;0.01） ，其中高劑量組在降低 Fe²⁺ 、MDA、LPO水平及提高GSH/GSSG比值方面效果最佳，與模型組相比差異顯著 （Plt;0.01） 。詳見表4。

2.5 芒柄花素降低CIRI大鼠腦組織ROS積累

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中ROS平均熒光強度顯著升高 （Plt;0.01） ）。芒柄花素干預(yù)后，各劑量組ROS水平均明顯下降，芒柄花素低劑量、芒柄花素中劑量和芒柄花素高劑量，均顯著低于模型組 （Plt;0.01） 。陽性對照組依達拉奉亦顯著降低ROS表達水平 （Plt;0.01） ，與芒柄花素高劑量組接近。詳見圖5、表5。

2.6芒柄花素調(diào)控ACSL4/LPCAT3信號通路的表達

與假手術(shù)組相比，模型組腦組織ACSL4/LPCAT3雙陽性細胞比例顯著升高（ （Plt;0.01） 。芒柄花素干預(yù)后，芒柄花素低劑量、芒柄花素中劑量、芒柄花素高劑量組雙陽性表達水平均顯著低于模型組 （Plt;0.01） 。依達拉奉組亦降低至 52.30%±0.16% ，與芒柄花素高劑量組接近。詳見圖6、表6。

假手術(shù)組中ACSL4與LPCAT3表達均較弱，熒光信號稀疏、分布均勻。與假手術(shù)組相比，模型組腦組織中ACSL4和LPCAT3表達水平顯著增強，熒光強度明顯升高 （Plt;0.01） ，提示MCAO/R可誘導(dǎo)鐵死亡相關(guān)分子上調(diào)。芒柄花素干預(yù)后，兩者熒光強度顯著下降，芒柄花素各劑量組ACSL4、LPCAT3熒光強度均明顯低于模型組（ Plt;0.01 或 Plt;0.05 ）。依達拉奉組ACSL4和LPCAT3熒光強度與芒柄花素高劑量組相近。詳見圖7、表 6

表4各組大鼠腦組織中鐵死亡相關(guān)指標(biāo)比較

2.7芒柄花素調(diào)控鐵死亡相關(guān)蛋白的表達

與假手術(shù)組相比，模型組中ACSL4、LPCAT3和ALOX15蛋白表達顯著上調(diào) （Plt;0.01 ，而GPX4表達顯著下調(diào) （Plt;0.01） ，提示鐵死亡通路被激活。經(jīng)芒柄花素干預(yù)后，ACSL4、LPCAT3和ALOX15表達下降（Plt;0.01） ，GPX4表達水平上調(diào) （Plt;0.01 ）。詳見圖8。

3討論

CIRI作為缺血性腦卒中治療中不可避免的繼發(fā)性病理過程，是導(dǎo)致卒中后神經(jīng)功能持續(xù)惡化和恢復(fù)受限的重要原因[4]。缺血性腦卒中占全部腦卒中的 80% 以上，且卒中后1年致殘率高達 70% ，復(fù)發(fā)率超過 25%^[15-17] 。盡管現(xiàn)有以阿替普酶溶栓、機械取栓為代表的血管再通治療在急性期發(fā)揮一定作用，但隨后的氧化應(yīng)激、炎癥級聯(lián)反應(yīng)與細胞程序性死亡激活所導(dǎo)致的二次損傷仍未被有效遏制[8]。近年來，鐵死亡作為一種新型程序性細胞死亡方式，因其在CIRI中介導(dǎo)繼發(fā)性神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵作用，逐漸成為該領(lǐng)域研究的熱點[2，19]。在CIRI早期，細胞內(nèi)鐵負荷迅速升高，GPX4表達下調(diào)，脂質(zhì)ROS大量積聚，協(xié)同驅(qū)動鐵死亡過程，是繼發(fā)性神經(jīng)損傷的重要推力之一[4，20]

本研究以MCAO/R動物模型為基礎(chǔ)，從行為學(xué)、組織學(xué)、生化和分子水平系統(tǒng)評估了芒柄花素在緩解CIRI中的神經(jīng)保護作用。mNSS評分顯示，芒柄花素可顯著改善神經(jīng)功能缺損，尤其在術(shù)后第3天和第7天療效持續(xù)。組織學(xué)結(jié)果進一步證實其病理保護效應(yīng)：高劑量芒柄花素可顯著減輕神經(jīng)元排列紊亂、尼氏小體丟失及神經(jīng)纖維斷裂，神經(jīng)結(jié)構(gòu)接近假手術(shù)組，提示其具備促進組織修復(fù)的潛力。TUNEL染色進一步表明，芒柄花素可有效抑制CIRI所致的神經(jīng)元凋亡，表現(xiàn)出良好的抗細胞死亡能力，且中高劑量效果接近陽性藥物依達拉奉。此外，芒柄花素顯著降低Fe2+濃度、MDA與LPO等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物水平，同時提升GSH/GSSG比值，提示其具有調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)與抗氧化應(yīng)激的雙重作用。ROS熒光檢測進一步佐證了其清除氧自由基、緩解氧化應(yīng)激的能力，且表現(xiàn)出劑量依賴性。與前期報道的芒柄花素具有抗凋亡、抗氧化的多重神經(jīng)保護作用一致[21-22]

在機制層面，本研究發(fā)現(xiàn)芒柄花素可顯著下調(diào)ACSL4、LPCAT3、ALOX15鐵死亡正調(diào)因子的表達，并上調(diào)GPX4這一關(guān)鍵抗鐵死亡蛋白的表達，形成“調(diào)脂-抗氧-抑鐵\"多靶點調(diào)控機制網(wǎng)絡(luò)。流式細胞術(shù)與免疫熒光染色結(jié)果一致性地證實了其在蛋白表達與細胞共表達水平上的抑制作用。

研究發(fā)現(xiàn)，GPX4基因過表達可顯著抑制MCAO/R模型中神經(jīng)元鐵死亡進程，并提高動物生存率[23]；ACSL4敲減可逆轉(zhuǎn)缺血誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷并改善神經(jīng)功能24。此外，研究表明，芒柄花素可通過激活Nrf2/血紅素氧合酶-1通路緩解氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙[25-26]。本研究則進一步在鐵死亡通路深度上拓展了其作用機制，首次系統(tǒng)驗證其對ACSL4/LPCAT3/ALOX15/GPX4軸的調(diào)控潛力。本研究結(jié)果支持芒柄花素具有傳統(tǒng)抗氧化、抗凋亡的特性，且可直接靶向鐵死亡核心因子，是一種兼具多靶點、低毒性和天然來源優(yōu)勢的潛在神經(jīng)保護候選藥物。其良好的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及穩(wěn)定的親靶能力，使其在“天然小分子抑鐵死亡藥物\"開發(fā)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[27]。

綜上所述，本研究從行為學(xué)、病理學(xué)、生化指標(biāo)、信號蛋白調(diào)控及結(jié)構(gòu)結(jié)合等多個層面系統(tǒng)驗證了芒柄花素通過調(diào)控鐵死亡通路緩解CIRI的作用機制，豐富了CIRI鐵死亡病理機制的研究內(nèi)涵，也為芒柄花素在腦卒中后的輔助治療提供了堅實的理論基礎(chǔ)與應(yīng)用前景。

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