[關(guān)鍵詞]I型單純皰疹病毒;單純皰疹病毒性角膜炎;鉤藤提取物;Bcl-2相關(guān)X蛋白;B細(xì)胞淋巴瘤因子-2；胱天蛋白酶-3

[中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.06.004

Effects of Uncaria rhynchophylla extracts on recurrent herpes simplex keratitis in experimental rabbits via the Bax/Bcl-2 signaling pathway

JIA NG Zhi ^I，2 ，WANG Lei， LIU Xuewu2， ZHANG Xiaodong2， PENG Dongdong2，CHEN Xiangchi2， WANG Xiaoqing2， JIA NG Dejian2， XIA Xinhua'*

1.Schoolof Pharmacy，Hunan UniversityofChinese Medicine，Changsha，Hunan41O2O8，China;2.HunanKeyLaboratoryof PharmacodynamicsandSafety Evaluationof New Drugsamp; HunanPrima Drug Research CenterCo.，Ltd.，Changsha，Hunan 410331，China; 3.Xiangya Schol ofBasicMedical Sciences，CentralSouth University， Changsha， Hunan41Ool3，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsofUncariarhynchophyllextractsonrecurentherpessimplexkeratitis （HSK）inexperimentalabbitsbasedontecl-2asoiatedXprotein（BaxBcellympoafactor2（Bcl-2）signalingpathway MethodsFortycommon-gradebig-earedwhiterabitswererandomlydividedintonormalcontrol group，modelcontrol group， acyclovirgroupaqueousextractof Uncariarhchophyllagroup，andalcoolicextractofUncariahychophyllagroup，witheight rabbits ineachgroup.Exceptforthenormalcontrol group，allothergroups were infectedocularlywithherpessimplexvirus typeI （HSV-I.Twentyonedaysafterinfection（henocularinfectionsymptomshadresolved），recuentinfectionwasinducedusing ultravioletlighttoestablisharecurentHSKmodelThemodelcontrolgroupwasadministeredanequalvolumeofnormalsaline viaoculardrops，theacyclovirgroupreceivedoralgavageofacyclovirdaily，andTheaqueousextractof Uncaria rhynchophyla groupandthealcohlicextractof Uncariahynchophyllgroupweretreatedwiththecorrespondingextractsviaoculardropsdaily for14consecutivedays.Comeal fluorescencestainingscoreswereassessedonthedayafterrecurrnce induction （before administration），onthe7thand14thdayofadministration.Tearviralitersweremeasuredbeforeadministrationandonthe14th dayofdmistaalopatologialaioseducedndeoteinpesilevelsofad Caspase-3incoealtisue werecheckedbyWestern blotonthe14thdayafteradministration.Results Comparedwiththenormal control group，themodel control group showed a significant increase in cornealfluorescein staining scores （ Plt; O.O1），tearviral titers，and corneal histopathological scores （ Plt; O.01）.After 14 days of administration，compared with the model control group，the alcoholic extract ofUncariarhynchophyllgroup，andtheacyclovirgoupallexhibiteddecreasedcornealfluoresceinstainingscoresandtearviral titers （ P lt;0.05or P?0.01 ）.The acyclovir group and the alcoholic extract of Uncaria rhynchophylla group had significantly reduced corneal histopathological scores （ P lt;0.01）.Compared with the normal control group，the model control group showed significantly increased protein expression levels of Bax and Caspase- ³ （ Plt;0.01 ）and significantly decreased protein expression level of Bcl-2（ Plt; （20 0.01） ntecornea.Comparedwiththe modelcontrolgroup，theaqueous extractof Uncaria rhynchophyll groupandthealcoholic extractof Uncaria rhynchophylla group had significantlyreduced protein expression levelsof Caspase-3and Bax （ P lt;0.05， Plt;0.01） and significantly increased protein expression level of Bcl-2 （ Pe O.05） in the cornea Compared with the water extract group of Uncaria， the alcoholicextractgroupof Uncariashowedsignificantlylowercorealfluoresceinstaiingscoresat7and14daysofadministration（ Plt; （204號(hào) O.01）.Thealcoholicextract groupof Uncariahadsignificantlylower tear virus titersandcormeal tisue pathological scores |P_- lt;0.01）. ConclusionDfereneractsofUnciahchohyllvesiicanttrapeutcfctsnurrentHSKandtepacolical mechanismmayberelatedtoeirregulationof teBaxBcl-2Caspase-3apoptoticsignalingpathaytherebyiibitingvirusduced cornealcllapoptosis.Moreover，thealcoholicextractofUncariarhychophylldemonstratesstrongerpharmacologicaleficacy.

[Keywords]herpessimplexvirustypeI;herpessimplexkeraitis；Uncariarhynchophyllaextracts;Bcl-2-associatedX protein;B-cell lymphoma factor 2;Caspase-3

I型單純皰疹病毒（herpes simplex virus typeI，HSV-I）主要感染面部，可通過直接接觸或體內(nèi)重復(fù)侵襲感染眼部導(dǎo)致單純皰疹病毒性角膜炎（herpessimplex keratitis，HSK）HSV-I因其具有較強(qiáng)的免疫逃逸能力[I-3]，在急性感染后常潛伏于宿主的三叉神經(jīng)元3-5]，使其在體內(nèi)不易被徹底清除，并導(dǎo)致條件性的反復(fù)發(fā)作性感染[4-，最終造成角膜白斑而致盲，是引起全球致盲的主要原因[4-5]。臨床治療藥物以DNA多聚酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為代表，且多聯(lián)合用藥。但藥物聯(lián)用增加了不良反應(yīng)和毒性反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，如長(zhǎng)期口服抗病毒藥物存在腎毒性等不良反應(yīng)，長(zhǎng)期局部使用糖皮質(zhì)激素可能引起眼壓升高、白內(nèi)障、黃斑變性等并發(fā)癥8]。因此，同時(shí)兼具多重藥理活性的藥物將具有更高的開發(fā)價(jià)值。鉤藤作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有清熱平肝、熄風(fēng)定驚的功效，藥理作用研究主要集中于降壓、抗氧化應(yīng)激、抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡、抗炎和抗纖維化、抗抑郁等，較少有研究涉及直接抗菌及抗病毒作用[9-10]。本研究通過觀察鉤藤提取物對(duì)復(fù)發(fā)性HSK模型的治療作用，為鉤藤提取物的新用途和進(jìn)一步的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)日本大耳白兔40只，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.0kg ，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：42010000006435；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2021-0011，購(gòu)于武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司。在普瑞瑪藥物研究中心有限公司普通環(huán)境生物安全實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2020-0015，生物安全實(shí)驗(yàn)室備案編號(hào)：[202405312]BSL2-04。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)普瑞瑪藥物研究中心有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：IACUC-2021（2）045，實(shí)驗(yàn)過程遵循3R原則

1.2主要藥品及試劑

鉤藤飲片（通道湘春中藥材專業(yè)合作社，批號(hào)：20210506）；阿昔洛韋片（廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20210502）。

中性紅染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20210813）；熒光素鈉（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10642034）;兔抗胱天蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（愛博泰克生物科技有限公司，貨號(hào)：A0214）;兔抗B細(xì)胞淋巴瘤因子-2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）抗體、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated Xprotein，Bax）抗體（美國(guó) Cell Signaling Technology，貨號(hào)：2872S、277S）；人胚胎腎細(xì)胞293（HEK293T）（武漢普諾賽生命科技有限公，批號(hào)：202017）；HSV-I（美國(guó)模式菌種收集中心，編號(hào)：ATCCVR-773）。

1.3 主要儀器

HOPE-MED8130B型皮膚光毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)儀（天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司）；KJ5S1型手持裂隙燈顯微鏡（蘇州康捷醫(yī)療股份有限公司）；3111型CO₂ 培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisher公司）;DMIL型倒置顯微鏡、DFC420C型病理成像系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）；YXQ-50A型立式壓力滅菌器（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.4 藥液制備

取鉤藤帶鉤莖枝，按1：1加水或 75% 乙醇浸泡30min 制備鉤藤水提取物或醇提取物，加熱煮沸提取 2h ，得到提取液，過濾，60 C 減壓濃縮成水提取浸膏（每克浸膏含 4.1385g 生藥材）或醇提取浸膏（每克浸膏含 2.9835g 生藥材），均采用生理鹽水溶解配制成每毫升藥液含 0.1g 生藥材，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹]。

1.5 造模方法

參考文獻(xiàn)[1O]培養(yǎng)方法進(jìn)行HSV-I的培養(yǎng)，并制備成半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量為 10^-4.88/0.1mL （相當(dāng)于 5.3×10⁵PFU/mL ）的病毒液，用于大耳白兔眼部感染。參照文獻(xiàn)[12-13]建立兔復(fù)發(fā)性HSK模型。日本大耳白兔采用乙醚吸入輕微麻醉，用 6mm 環(huán)鉆在左眼角膜中央作一壓痕，并以6.5號(hào)針頭在壓痕內(nèi)作“#\"劃痕（深度僅限上皮層），向兔左眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入單純性皰疹病毒原液 100μL/ 眼 5.3×10⁴PFU/眼）誘導(dǎo)原發(fā)性感染，以眼部出現(xiàn)感染癥狀（眼臉腫脹，淚液及分泌物增加）為原發(fā)性感染造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[3，10]

于原發(fā)性感染后繼續(xù)觀察21d（D1＼～D21），直至眼部感染癥狀均消失。于觀察期結(jié)束后當(dāng)天（D21）采用紫外線（光源TW20，波長(zhǎng) 302nm ，照射劑量 照射角膜 3min ，以誘導(dǎo)HSK復(fù)發(fā)[12-13]。于誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后次日進(jìn)行角膜熒光染色評(píng)分和淚液病毒滴度檢測(cè)，以角膜熒光染色評(píng)分顯著增大，且淚液中能檢出病毒即判定成功制備復(fù)發(fā)性HSK模型[12-13]

1.6 分組及給藥方法

選用檢疫合格日本大耳白兔40只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、阿昔洛韋組、鉤藤水提取物組、鉤藤醇提取物組，每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組均建立復(fù)發(fā)性HSK模型。正常對(duì)照組不予干預(yù)，模型對(duì)照組經(jīng)眼滴入等量生理鹽水，鉤藤水提取物組、鉤藤醇提取物組均于誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后次日開始連續(xù) 14d（D22～D35） 經(jīng)眼滴入鉤藤提取物藥液 50μL 眼，阿昔洛韋組灌胃阿昔洛韋 46.7mg/kg^[14] 。分別于誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后次日（D22，給藥前）、給藥7d、給藥14d后（D29、D36）進(jìn)行角膜熒光染色評(píng)分；于誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后次日和給藥 14d 進(jìn)行淚液采集和病毒滴度檢測(cè)。進(jìn)一步于給藥結(jié)束后解剖，取眼球，分離角膜組織，分別進(jìn)行組織病理學(xué)檢查和組織蛋白表達(dá)檢測(cè)

1.7熒光染色法觀察角膜損傷情況

采用熒光素鈉 0.1mL/ 只滴注眼部，進(jìn)行角膜熒光素染色，并采用裂隙燈進(jìn)行角膜損傷的病變?cè)u(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[7，15-16]：0分，正常的透明角膜；0.1＼～0.9分，角膜熒光素鈉染色呈點(diǎn)狀，上皮病變數(shù)為1到9個(gè)；1分，角膜熒光素鈉染色呈點(diǎn)狀，點(diǎn)狀上皮病變10個(gè)以上，或小潰瘍面積在 25% 以下；2分，角膜熒光素鈉染色呈片狀，角膜潰瘍面積在 25% 250% ；3分，角膜熒光素鈉染色呈片狀，角膜潰瘍面積在 50%～75%;4 分，角膜熒光素鈉染色呈片狀，角膜潰瘍面積在 75%～100% 。得分越高，表明角膜損傷程度越嚴(yán)重。

1.8 空斑法觀察淚液病毒滴度

采用蘸有DMEM培養(yǎng)液的棉簽擦拭左右兩側(cè)角膜，將其放人裝有 1mL DMEM的無(wú)酶EP管中，將3次擦拭液均勻混合后，按10倍梯度稀釋5個(gè)稀釋度，采用空斑計(jì)數(shù)法進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)，觀察空斑形態(tài)并記錄空斑數(shù)，計(jì)算病毒滴度（ =（每孔平均空斑個(gè)數(shù) × 病毒稀釋度倒數(shù)）/每孔病毒接種量（mL）。病毒滴度越大，表明淚液中的病毒數(shù)量越多，角膜感染病毒程度越嚴(yán)重。

1.9 HE染色觀察角膜組織的病理變化

大耳白兔按 15mg/kg 靜脈注射 10mg/mL 丙泊酚乳狀注射液麻醉，解剖取角膜組織，福爾馬林固定，石蠟包埋、切片、HE染色，置于光鏡下觀察角膜組織病理學(xué)變化，分別按角膜上皮細(xì)胞壞死和缺損、上皮細(xì)胞增生、基質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行分級(jí)和評(píng)分，并將總分進(jìn)行加和作為角膜病變的整體病變?cè)u(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[7：無(wú)異常（NSL），計(jì)0分；輕度病變 （+） ，計(jì)1分；中度病變 （++） ，計(jì)2分；重度病變 （+++） ，計(jì)3分。病理評(píng)分越高，表示角膜病變?cè)絿?yán)重。

1.10Westernblot檢測(cè)角膜組織中的相關(guān)蛋白表達(dá)

取新鮮的角膜組織，在預(yù)冷的RIPA緩沖液中進(jìn)行勻漿，離心去除未裂解的組織，收集離心上清液總蛋白，進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)。取角膜總蛋白 50μg 上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。用一抗（Caspase-3、Bax ）按1：1O00稀釋，并與PVDF膜 4°C 孵育過夜，TBST洗3次，每次 15min 。用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育 90min ，TBST洗3次，每次 15min ，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光掃描拍照，用QuantityOne4.6.8軟件定量灰度值，以 β -actin為內(nèi)參對(duì)照，測(cè)量各組的Caspase- ³?Bax，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，體外試驗(yàn)采用Bliss法進(jìn)行 IC₅₀ 和 EC₅₀ 的計(jì)算。各組數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以‘ ”表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示。兩組均數(shù)比較采用 χ_t 檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組角膜熒光染色評(píng)分情況

正常對(duì)照組大耳白兔給藥期間的眼部均未見異常，模型對(duì)照組、阿昔洛韋組、鉤藤水提取物組、鉤藤醇提取物組大耳白兔在誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后次日的角膜均可見片狀染色，且各組動(dòng)物間的染色面積基本一致。鉤藤醇提取物組和阿昔洛韋組給藥7d和14d的角膜可見點(diǎn)狀染色；鉤藤醇提取物組給藥7d和 14d 的角膜仍可見片狀染色，但染色面積顯著減小。詳見圖1A＼～E。

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、阿昔洛韋組、鉤藤水提取物組、鉤藤醇提取物組在誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后次日均可見角膜熒光染色評(píng)分顯著升高 （Plt;0.01） 。與模型對(duì)照組比較，阿昔洛韋組和鉤藤醇提取物組給藥7d和 14d 后的角膜熒光染色評(píng)分均降低（ Plt; 0.05，Plt;0.01 ，鉤藤水提取物組給藥14d后的角膜熒光染色評(píng)分降低（ （Plt;0.05 ）。與阿昔洛韋組比較，鉤藤水提取物組給藥7d的角膜熒光染色評(píng)分升高（Plt;0.05） ；與鉤藤水提取物組比較，鉤藤醇提取物組給藥7d和14d后的角膜熒光染色評(píng)分均顯著降低 （Plt;0.01） 。詳見圖 1F 。

Fig.1Changes in corneal fluorescein sodium staining and corneal scoring in recurrent HSK model of experimental rabbits

注：A、B、C、D、E分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、阿昔洛韋組、鉤藤水提取物組、鉤藤醇提取物組的角膜熒光素鈉染色圖，箭頭指向處顯示為熒光染料聚集；F為角膜評(píng)分柱形圖。與正常對(duì)照組比較， ⁺⁺Plt;0.01 ；與模型對(duì)照組比較， ^*Plt;0.05 **Plt;0.01 ;與阿昔洛韋組比較， ^?Plt;0.05 ；與鉤藤水提取物組比較， ^##Plt;0.01 。

2.2 各組淚液病毒滴度情況

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、阿昔洛韋組、鉤藤水提取物組、鉤藤醇提取物組誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后次日的淚液病毒滴度均顯著升高 （Plt;0.01） ；與模型對(duì)照組比較，阿昔洛韋組、鉤藤水提取物組和鉤藤醇提取物組淚液病毒滴度均顯著降低 （Plt;0.01） ；與阿昔洛韋組比較，鉤藤水提取物組淚液病毒滴度顯著升高（Plt;0.01） ；與鉤藤水提取物組比較，鉤藤醇提取物組淚液病毒滴度顯著減少 （Plt;0.01） 。詳見圖2。

2.3 各組角膜組織病理變化

正常對(duì)照組動(dòng)物角膜未見上皮細(xì)胞缺損、變性壞死、增生和基質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組角膜可見中度角膜病變，包括角膜上皮細(xì)胞變性壞死、缺損和增生，以及基質(zhì)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮缺損發(fā)生率為 100% ;阿昔洛韋組角膜可見輕度角膜病變，但病變類型僅包括輕度的上皮增生和少量的基質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；鉤藤水提取物組角膜上皮細(xì)胞可見輕度的變性和增生，伴有大量的基質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；鉤藤醇提取物組角膜僅見輕度的上皮增生和少量的基質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見圖 3A～E □

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組角膜病理評(píng)分顯著增大（ （Plt;0.01） ；與模型對(duì)照組比較，阿昔洛韋組和鉤藤醇提取物組角膜病理評(píng)分均顯著減?。?Plt; 0.01）；與阿昔洛韋組比較，鉤藤水提取物組角膜病理評(píng)分增加（ _{（Plt;0.05）} ；與鉤藤水提取物組比較，鉤藤醇提取物組的角膜病理評(píng)分顯著降低（ （Plt;0.01）. 。詳見圖 3F 。

2.4各組角膜組織相關(guān)蛋白表達(dá)水平情況

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組角膜的Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著增加（ Plt;0.01 ），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少 （Plt;0.01） ；與模型對(duì)照組比較，鉤藤水提取物組、鉤藤醇提取物組Caspase ^-3 Bax蛋白表達(dá)減少 （Plt;0.05，Plt;0.01 ），Bcl-2蛋白表達(dá)增加（ Plt; 0.05）。詳見圖4。

3討論

HSK是由HSV-I感染引起的病毒性角膜病變[1，15]，其病變類型包括上皮型、基質(zhì)型和內(nèi)皮型，其中基質(zhì)型HSK通常分為基質(zhì)免疫型和基質(zhì)壞死型[15-17]?；|(zhì)免疫型HSK由角膜基質(zhì)對(duì)HSV-I抗原的遲發(fā)超敏反應(yīng)引起，其角膜上皮通常完好無(wú)損；基質(zhì)壞死型HSK在基質(zhì)炎癥浸潤(rùn)的基礎(chǔ)上伴有角膜上皮細(xì)胞的缺損、壞死，可能是由HSV-I活動(dòng)性感染和免疫性炎癥共同引起的[18]

Fig.2Tear virus titers in recurrent HSK model of experimental rabbits（ ?×100^? 注;A、B、C、D、E分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、阿昔洛韋組、鉤藤水提取物組、鉤藤醇提取物組的淚液病毒空斑法培養(yǎng)圖；F為淚液病毒滴度計(jì)數(shù)的柱形圖。與正常對(duì)照組比較， ⁺⁺Plt;0.01 ;與模型對(duì)照組比較， ^**Plt;0.01 ；與阿昔洛韋組比較，p＜ 0.01；與鉤藤水提取物組比較， ^##Plt;0.01 。

Fig.3Pathological examinationofcorneal tissueinrecurrent HSKmodel of experimental rabbits（ ×200 ））注：A、B、C、D、E分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、阿昔洛韋組、鉤藤水提取物組、鉤藤醇提取物組的角膜組織病理圖，B圖的橢圓形框?yàn)榻悄と睋p部位;F為角膜病理評(píng)分柱形圖。與正常對(duì)照組比較， ^++Plt;0.01 ；與模型對(duì)照組比較， **P_lt; 0.01；與阿昔洛韋組比較， ^?Plt;0.05 ；與鉤藤水提取物組比較， ^##Plt;0.01 。

本研究結(jié)果顯示，HSV-I以 5.3×10⁴ PFU/眼的感染造模劑量能構(gòu)建至少持續(xù)時(shí)間14d的兔HSK模型，表現(xiàn)為角膜呈點(diǎn)狀和樹枝狀熒光染色，且淚液中病毒滴度顯著增加，提示角膜存在組織缺損和活動(dòng)性的病毒感染，角膜損傷符合基質(zhì)壞死型HSK的病變特征，病變類型包括角膜上皮細(xì)胞變性壞死、缺損和增生，以及基質(zhì)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)β，15-1σ]。鉤藤水提取物和鉤藤醇提取物能降低HSK家兔模型的角膜熒光染色評(píng)分，降低模型的淚液病毒滴度。鉤藤醇提取物能顯著改善角膜組織病變，鉤藤水提取物對(duì)角膜組織病變的改善作用不明顯，提示鉤藤提取物對(duì)家兔HSK模型具有顯著治療作用，且鉤藤醇提取物的治療作用顯著優(yōu)于鉤藤水提取物。

角膜上皮細(xì)胞（corneal epithelial cells，CEC）是角膜的初始防御層，對(duì)于防止HSV-1穿透更深并與基質(zhì)神經(jīng)叢相互作用至關(guān)重要[7-19]。感染后，HSV-I觸發(fā)CEC凋亡，破壞上皮屏障并加重感染[10，19-21]。鉤藤及其提取物則能抑制不同疾病的組織細(xì)胞凋亡，如寨旭等22的研究顯示，異鉤藤堿能通過胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路調(diào)控大鼠急性胰腺炎細(xì)胞的炎癥和凋亡。侯叢嶺等[23研究顯示，異鉤藤堿通過上調(diào)miR-19205p調(diào)控腫瘤壞死因子- σ_?∝ 誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞凋亡。因此，本研究將鉤藤提取物針對(duì)HSK的機(jī)制研究聚焦于細(xì)胞凋亡，通過檢測(cè)角膜組織中經(jīng)典的凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)量探索鉤藤不同工藝提取物對(duì)角膜細(xì)胞凋亡的影響[24-25]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組角膜組織的Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少；經(jīng)鉤藤提取物干預(yù)后，與模型對(duì)照組比較，鉤藤水提取物組和醇提取物組的促凋亡Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)減少，抑凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)增加，且醇提取物對(duì)上述3個(gè)蛋白的調(diào)節(jié)程度更強(qiáng)。上述結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)兔HSK模型的角膜損傷可能與角膜組織Bax/Bcl-2/Caspase-3凋亡信號(hào)通路改變有關(guān)，而鉤藤提取物改善HSK角膜病變的作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平來抑制角膜細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，鉤藤不同工藝提取物對(duì)復(fù)發(fā)性HSK具有治療作用，其藥理作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2/Caspase-3凋亡信號(hào)通路，抑制病毒感染引起的角膜細(xì)胞凋亡有關(guān)，且鉤藤醇提取物的藥效作用更強(qiáng)。

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（本文編輯 田夢(mèng)妍）