中圖分類號：R446 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2025.04.003

Analysis of nucleic acid detection results of respiratory tract pathogens in Dali area

DUAN Fuhui， LI Siying， YANG Xitong，WANG Guangming （Gene Testing Center，theFirst Affiliated Hospitalof Dali University，Dali 671OoO，Yunnan，China）

【Abstract】ObjectiveToanalyze the distributionof pathogenic bacteria inlowerrespiratory tractinfection in Dali area， soas toprovidediagnosticbasis for clinicallowerrespiratorytractinfection，and guideclinicalrationaluseofantibiotics.

MethodsAtotalof5O39samplesofrespiratorytractpathogenscollctedfromDaliresidentsintheFirstAffliated Hospital ofDaliUniversityfromNovember2O21toFebruary2O23wereanalyzed，andlop-mediated isothermalamplification （LAMP）wasused to detect respiratory tract pathogens andanalyze their distribution.ResultsOverallpositive rate was 45. 68 % （2302/5039），among which the top5infections were Haemophilus influenzae，Streptococus pneumoniae，Mycoplasma pneumoniae，Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae.Themain infection type was singlepathogenic bacteria infection，andthetop3wereHaemophilus influenzae，Mycoplasma pneumoniaeandStreptococus pneumoniae.Theoveralpositive detection rate in adults （ 43.03% ）was significantly lower than that in children（7 2.11% ）. The pathogen detection rate in males was higher than that in females，and difference was statistically significant（ χ²=6.483 P=0.011 ）. Conclusion LAMPcanquicklyandaccuratelydetectthepathogens ofrespiratorytractinfection.InDaliarea，the most widelydistributed pathogen inlowerrespiratorytractinfectionsisHaemophilus influenzae.Theoverallpositiverateofinfectioninmalesishigherthanthat infemales，andthepositivedetectionrate inchildrenis higherthanthatinadults.Theinfectiontype ismainly dominated by single-pathogen infection.

【Keywords】lower respiratory tract infection；isothermal nucleicacidamplification chip method；pathogen distribution; rational use of antimicrobial agents

呼吸道感染是臨床最常見的感染性疾病之一，由病原體侵入呼吸道從而繁殖致病，分為上呼吸道感染和下呼吸道感染[1]。下呼吸道感染（LRIs）是指發(fā)生在氣管、支氣管和肺部等呼吸系統(tǒng)的感染，通常由細菌、病毒、支原體等微生物引起，導(dǎo)致呼吸道黏膜的炎癥反應(yīng)，引發(fā)咳嗽、咳痰、發(fā)熱等癥狀[2]。長期以來，下呼吸道病原體的鑒定依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)、抗原或抗體免疫學(xué)方法檢測，耗時長且檢出率低，通常無法檢測到非典型病原體，如軍團菌、支原體和衣原體[3]。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，晶芯呼吸道病原菌核酸檢測恒溫擴增技術(shù)的敏感度、特異度、檢出率更高，操作簡單，檢測時間相比傳統(tǒng)的方法更短，在臨床抗菌藥物使用中有重要作用[4]。隨著臨床抗生素的濫用，耐藥菌株明顯增多，引起下呼吸道感染的概率日益增加，抗生素的有效選擇和使用已成為所有醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)[5]。由于病原菌分布情況、對臨床抗菌藥物的敏感程度隨時間、地區(qū)而改變，本研究通過恒溫核酸擴增芯片法（LAMP）分析大理地區(qū)不同年齡、性別下呼吸道感染的情況，了解本地區(qū)下呼吸道感染病原菌的分布及流行特點，對促進臨床合理用藥，提高臨床診療質(zhì)量具有重大意義。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2021年11月至2023年2月在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院進行呼吸道13項感染病原菌檢測的大理地區(qū)患者進行回顧性分析。標本數(shù)為5039例，男性3100例，女性1939例，標本類型為痰液。納入標準：研究經(jīng)本院倫理委員會批準；居住地為云南省大理白族自治州的患者。排除標準：咳出、吐出的痰液不合格者；依從性差者。本研究標本連續(xù)多年在同一醫(yī)院采集，篩選大理地區(qū)居民標本，標本來源穩(wěn)定，具有較好的代表性。

1.2實驗儀器與試劑（1）儀器：恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀（RTisochipTM-A）。（2）試劑：細菌基因組DNA提取試劑盒（玻璃珠法）、晶芯°呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增芯片法）。

1.3 檢測方法

1.3.1核酸提取根據(jù)樣本黏稠度加入適量體積的 10%NaOH，37% 液化 30min （根據(jù)樣本黏稠度可適當調(diào)整 NaOH 量或延長液化時間）；取 1mL 液化后樣品至 1.5mL 離心管中， 12 000rpm 離心 5min ，棄上清液；向離心管中加入 1mL 洗液，渦旋振蕩（將管底的沉淀振起來即可，不一定要振散），12000rpm離心 5min ，吸棄上清液，盡量不要碰到沉淀；向離心管中加人 100μL 核酸提取液，用移液器吹吸混勻沉淀，將液體和沉淀一起轉(zhuǎn)移到核酸提取管中；將核酸提取管置于恒溫金屬浴中，最大轉(zhuǎn)速（1500rpm）95^°C 振蕩至少 10min;12 000rpm 離心 5min ，備用[7]。

1.3.2芯片加樣 在芯片包裝上注明樣本編號，打開室溫平衡好的芯片（芯片包裝標簽面為正面），用移液器吸取 53μL 配制好的擴增反應(yīng)體系，加入芯片中，待其充滿芯片即停止加樣，將進出樣口周圍溢出的液體快速擦拭干凈；取1張封口膜，覆蓋于進出樣口上，按壓貼緊封口膜。

1.3.3核酸擴增 核酸分析儀光源預(yù)熱完成后，點擊“出倉\"按鈕，將芯片正面向上平穩(wěn)放入儀器點擊“人倉”按鈕，將芯片送入核酸分析儀中；點擊操作區(qū)域的“開始檢測”按鈕開始樣本檢測，儀器將按照預(yù)設(shè)程序進行樣本檢測。

1.3.4結(jié)果判讀 檢測完成后軟件采用最大二階導(dǎo)數(shù)法結(jié)合其他算法計算出“S型\"擴增曲線進人快速擴增期的第一個拐點，拐點對應(yīng)的時刻與原點時刻的差值定義為Tp值，根據(jù)Tp值并結(jié)合陽性判斷值進行結(jié)果判讀[8]。當檢測指標的Tp值小于或等于該指標的陽性判讀值時，判讀為陽性；當檢測指標的Tp值大于該指標的陽性判讀值時，判讀為陰性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析處理，兩組間的差異比較采用 χ² 檢驗，檢驗水準： α=0.05 ，雙側(cè)檢驗。

2結(jié)果

2.1呼吸道13項病原菌檢測結(jié)果 總陽性檢出率為 45.68%（2302/5039） ，陽性檢出率前五位依次為流感嗜血桿菌（ 26.18% ）、肺炎鏈球菌（ 7.28% ）肺炎支原體 （5.40% ）、金黃色葡萄球菌（ 4.66% ）、肺炎克雷伯菌 （4.37%） 。見表1。

2.2不同性別之間病原菌檢測結(jié)果比較 男性患者陽性檢出率（ 47.10% ）高于女性患者陽性檢出率（ 43.42% ），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.05） 。見表2。2.3呼吸道病原菌單一感染與混合感染檢測結(jié)果分析感染類型主要以單一病原菌感染為主，前3位分別為流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎鏈球菌。見表3。

2.4不同年齡組病原菌檢測結(jié)果 成人有4580例，兒童有459例，成人的陽性檢出率為 43.03% ，明顯低于兒童的陽性檢出率（ 72.11% ），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.001 ）。見表4、表5。

3討論

LRIs主要由肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等細菌以及流感和呼吸道合胞病毒等病毒引起，是全球?qū)е滤劳龅闹饕腥拘栽?，每年造?00多萬人死亡[9]。本次研究結(jié)果顯示檢出 2302 例陽性樣本，陽性率為 45.7%（2302/5039） ，其中流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和肺炎支原體檢出率最高，感染類型主要是以單一病原菌感染為主。相關(guān)研究顯示，肺炎支原體已成為我國下呼吸道感染的主要病因，肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌多年來仍是最常見的下呼吸道感染病原體[10]。肺炎支原體是一種介于細菌和病毒之間，目前已知能夠獨立生存的最小微生物，主要通過飛沫傳播，具有周期性流行和季節(jié)周期的特征，每3＼～7年出現(xiàn)一次流行高峰，四季均可發(fā)生，南方以夏季為主[]。肺炎支原體感染后不僅會引起呼吸道系統(tǒng)癥狀，也可引起肝、腎、心、肺等多臟器功能損傷[10]。傳統(tǒng)的肺炎支原體只能通過檢測 IgM 抗體來判斷， IgM 抗體通?？梢栽诓≡w感染一周左右檢測，對早期診斷和臨床指導(dǎo)藥物的選擇造成了限制[12]。肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌屬于苛養(yǎng)菌，是一類對生長環(huán)境和營養(yǎng)要求較苛刻的細菌，一般送檢到接種不能超過30分鐘，分離培養(yǎng)陽性率低且所需時間長[13]。LAMP作為新型核酸擴增技術(shù)，依賴其檢測特點能在短時間內(nèi)快速檢測多種病原體，檢出率和靈敏度均高于普通痰培養(yǎng)[14]，進一步提高了呼吸道病原體的檢出率。

GBD2019LRICollaborators[15]發(fā)現(xiàn)在全球范圍內(nèi)，LRIs男性的年齡標準化發(fā)病率是女性的1.2倍，病死率是女性的1.3倍，男性比女性更容易感染LRIs，這可能是由于不同性別對感染的免疫反應(yīng)差異和吸煙等行為因素造成的。本研究結(jié)果表明男性呼吸道病原菌感染多于女性，其中男性陽性率為47.10% ，女性陽性率為 43.42% ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與GBD的研究結(jié)果相一致。

肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌均是兒童社區(qū)獲得性肺炎的重要病原菌之一，一年四季均可發(fā)病，可引起嚴重局部感染性疾病者更會演變?yōu)榍忠u性疾病，威脅患兒的生命安全[1]。兒童呼吸免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，對呼吸道病原菌抵抗力差，為呼吸道感染性疾病的易感人群，若未及時處理會導(dǎo)致患兒病情加重、病程延長甚至產(chǎn)生細菌耐藥性[17]。本研究結(jié)果顯示我院成人陽性檢出率（ 43.03% ）低于兒童的陽性檢出率72.11% ），表明在成人與兒童患者間有顯著差異。其中兒童以肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌感染為主，研究結(jié)果與過往相關(guān)報道一致[18]。流感嗜血桿菌是一種無運動力、無芽孢、形態(tài)多樣的革蘭陰性嗜血桿菌屬的短小桿菌。肺炎鏈球菌是一種兼性厭氧革蘭陽性鏈球菌屬的雙球菌。肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌均廣泛分布于自然界，人類均是它們重要的自然宿主，可通過呼吸道飛沫傳播、人體親密接觸傳播或者由定植菌移位導(dǎo)致自體感染[19-20]，主要定植于兒童（特別是5歲以下）鼻咽部，可長期定植在兒童的呼吸道黏膜，當其免疫力較低時，定植菌株可經(jīng)鼻咽部或血液侵入機體導(dǎo)致各種感染性疾病[21]。近年來，大量抗生素的濫用，常用抗菌藥物對肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的敏感性不斷降低，使臨床診斷及治療變得更加困難，常因延誤治療時機，嚴重影響患兒生長發(fā)育及身心健康，甚至可能導(dǎo)致患兒死亡[22]。本次研究也存在一定局限性，研究過程中僅使用了一種檢測方法，檢測了常見的13種呼吸道病原菌，并未覆蓋下呼吸道感染相關(guān)的全部病原體。這些不足將在以后的工作中逐漸完善。

總之，大理地區(qū)下呼吸道送檢標本合格率較高，感染病原菌分布最廣的是流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體；其感染類型以單一病原菌感染為主；男性呼吸道病原菌感染多于女性，在不同性別、不同年齡間差異顯著。本研究為大理地區(qū)下呼吸道感染臨床診斷、合理用藥提供了可靠的參考依據(jù)，減少了廣譜抗生素的濫用，為患者量身定制治療方案，促進患者康復(fù)具有重大意義。

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（收稿日期：2024-10-29修回日期：2025-01-16）

（編輯：潘明志）