摘要：傳統(tǒng)顯微鏡在生物成像中廣泛采用熒光成像技術(shù)，該技術(shù)在基礎(chǔ)科學(xué)和臨床研究中具有重要意義。然而，傳統(tǒng)熒光檢測系統(tǒng)通常依賴光譜濾波器來分離熒光信號和激發(fā)光，這導(dǎo)致檢測速度和靈敏度下降，同時(shí)限制了可檢測的熒光范圍，增加了系統(tǒng)的光學(xué)復(fù)雜性。為解決這一問題，展示了兩種全波段無濾波顯微成像技術(shù)。第一種技術(shù)利用超快超連續(xù)白光源，無需光譜濾波即可激發(fā)熒光，通過時(shí)間分辨探測器在時(shí)間域中排除激發(fā)光，從而提高了檢測速度和靈敏度。第二種技術(shù)利用熒光發(fā)射的偏振性和相干性，采用線偏振照明和交叉分析器，增強(qiáng)了熒光和散射光之間的對比度，實(shí)現(xiàn)了在450～680 nm 光譜范圍內(nèi)的熒光成像。這兩種全波段無濾波顯微成像技術(shù)簡化了光學(xué)配置，為生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用提供了高效、靈敏的解決方案。

關(guān)鍵詞：熒光成像；光學(xué)濾波；全波段熒光

中圖分類號：TH 742 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

引 言

傳統(tǒng)顯微鏡在生物成像中廣泛地使用熒光顯微成像技術(shù)，如細(xì)胞表型檢測、組織切片檢測[1]，其中，多波段熒光三維成像通常需要與共焦、多光子或光學(xué)切片顯微鏡等方法結(jié)合使用[2]，以獲取更全面的細(xì)胞或組織信息。由于激發(fā)熒光素的激發(fā)光光強(qiáng)往往比熒光素的發(fā)射熒光光強(qiáng)大幾個(gè)數(shù)量級，所以需要將充當(dāng)背景噪聲的激發(fā)熒光與所需信號的發(fā)射熒光分離之后，才可得到理想的熒光圖像。傳統(tǒng)方法通過組裝熒光濾波通道來實(shí)現(xiàn)兩者的分離，熒光濾波通道通常由一個(gè)激發(fā)濾光片、一個(gè)發(fā)射濾光片以及一個(gè)相應(yīng)波段的二向色鏡組成，激發(fā)濾光片用以篩除生物樣品散射的激發(fā)光，發(fā)射濾光片允許樣品的發(fā)射熒光抵達(dá)到探測器。

然而，每種特定的染料只在相對狹窄的光譜范圍內(nèi)被激發(fā)，單一的激發(fā)波長只能激發(fā)有限數(shù)量的熒光物質(zhì)，故傳統(tǒng)顯微鏡無法實(shí)現(xiàn)在單個(gè)圖像中獲得樣品的全部激發(fā)/發(fā)射光譜。同時(shí)，若熒光物質(zhì)的斯托克斯位移沒有足夠大時(shí)，激發(fā)帶和發(fā)射帶存在重疊區(qū)域，即使使用帶寬極小的濾波器篩選掉全部的散射激發(fā)光，也會(huì)不可避免地?fù)p失一些發(fā)射熒光信號。傳統(tǒng)的熒光檢測系統(tǒng)的問題不僅會(huì)降低檢測的速度和靈敏度，還會(huì)限制可檢測熒光標(biāo)記的選擇。此外，對于使用多個(gè)激發(fā)和發(fā)射光譜的多色標(biāo)記染色生物樣品，通常需要多波段同時(shí)熒光成像。同時(shí)檢測多色生物標(biāo)記能夠監(jiān)測復(fù)雜生物系統(tǒng)中的不同生理過程和生物細(xì)胞功能。為滿足多色熒光檢測的需求，傳統(tǒng)的系統(tǒng)已經(jīng)擴(kuò)展到具有多個(gè)激發(fā)?發(fā)射光譜的熒光濾波通道的熒光濾波輪盤，通過切換輪盤中的濾波通道實(shí)現(xiàn)多色熒光檢測。但是，這種輪盤中的光學(xué)配置較為復(fù)雜，為更新與改進(jìn)帶來了困難，并且機(jī)械切換輪盤耗時(shí)較長，不利于同時(shí)成像。

因此，本文展示了兩種全波段無濾波顯微鏡。其一，使用由非線性光子晶體光纖與飛秒激光相結(jié)合生成的單一超連續(xù)光源充當(dāng)激發(fā)光光源同時(shí)激發(fā)各色熒光團(tuán)，這種超連續(xù)白光為一種寬譜光。然后，條紋相機(jī)根據(jù)激發(fā)光與發(fā)射光在時(shí)間域上的差異，濾除散射激發(fā)光。其二，由于熒光發(fā)射通常表現(xiàn)出較大的偏振各向異性，而散射的激發(fā)光則保留偏振狀態(tài)，故使用線偏振照明和光束遮擋器，提高熒光和散射光之間的對比度。本文展示的兩種方案無需多個(gè)帶通濾波器和二向色鏡，從而簡化了光學(xué)配置。

1 基于條紋相機(jī)裝置模型分析

1.1 基于條紋相機(jī)超窄時(shí)間窗的無濾波顯微鏡

圖1 展示了利用超快脈沖激光器（Coherent，Mira 900）產(chǎn)生的超連續(xù)白光作為激發(fā)光源，在800 nm 波長和76 MHz 的重復(fù)頻率下，將70 mW的50 fs 脈沖耦合到一根長度為1 m 的非線性光子晶體光纖，光纖零色散波長為750 nm。非線性相互作用包括自相位調(diào)制、自陡峭化、受激拉曼散射和四波混頻[3-5]，其中自相位調(diào)制導(dǎo)致頻率擴(kuò)展，形成光譜的寬帶；自陡峭化是指高強(qiáng)度光在介質(zhì)中傳播時(shí)傳播速度更快，光波包的前沿會(huì)更陡峭；受激拉曼散射會(huì)使光譜紅移，進(jìn)一步增加了光的頻率范圍；四波混頻即不同頻率的光波在非線性介質(zhì)中相互作用，產(chǎn)生新的頻率成分，導(dǎo)致了頻率的組合和擴(kuò)展，形成更寬的頻譜。這些非線性效應(yīng)相互作用，共同導(dǎo)致了光譜的寬帶，產(chǎn)生一個(gè)寬的亞皮秒連續(xù)體，延伸到460 nm。如圖2 所示，雖然光譜圖顯示出一些結(jié)構(gòu)上的變化：在400～500 nm 范圍內(nèi)，光譜強(qiáng)度較低，并且呈現(xiàn)出一種散亂的模式，但整體上光譜是連續(xù)的；在500～600 nm 范圍內(nèi)，光譜強(qiáng)度開始增加，并在600～700 nm 之間達(dá)到一個(gè)峰值；在700～800 nm 范圍內(nèi)，光譜強(qiáng)度減小，并在800～900 nm 之間再次達(dá)到一個(gè)較高的峰值。因此，該光源可以激發(fā)任何在460 nm 到近紅外波段吸收的熒光物質(zhì)。在460 ～780 nm 之間的平均光譜密度為130 μW/nm，能夠?qū)崿F(xiàn)熒光的高效激發(fā)。超連續(xù)光源的高重復(fù)率能夠?qū)崿F(xiàn)同步檢測來探測微弱信號，并監(jiān)測快速變化的熒光信號，例如流式細(xì)胞儀中的信號。

將超連續(xù)白光聚焦到一個(gè)樣品比色皿中，其中包含不同染料的混合物，如圖1 所示。使用一個(gè)無色差透鏡收集樣品出射光，另一個(gè)無色差透鏡將信號聚焦至分光儀中。其中樣品出射光包含激發(fā)雜散光與熒光，而后經(jīng)由分光儀輸出包含熒光和激發(fā)雜散光的兩個(gè)重疊光譜。由于激發(fā)雜散光和熒光在光譜上是重疊的，因此有必要使用時(shí)間分辨探測器在時(shí)域中分離這兩個(gè)信號。該研究中使用的全光譜的超連續(xù)白光與已有的研究[6-8]有明顯不同，以前的研究中往往采用窄帶通濾波器從超連續(xù)譜中選擇特定波長范圍進(jìn)行熒光激發(fā)。熒光檢測采用了與傳統(tǒng)方法相同的方法，使用發(fā)射濾波器來濾除激發(fā)雜散光，只允許熒光信號通過。相比之下，該方法在不進(jìn)行光譜濾波的情況下使用全波段超連續(xù)白光，可實(shí)現(xiàn)單次激發(fā)寬波長范圍內(nèi)的多種染料。

對于采用的時(shí)間分辨探測器有以下關(guān)鍵要求：第一，具有足夠的時(shí)間分辨率，在時(shí)間域上分辨散射的激發(fā)光和熒光。該方案無需考慮激發(fā)光的波段，只需考慮熒光和激發(fā)光的壽命，從而使散射的激發(fā)光不被探測器探測到。第二，探測器需具有非常高的對比度，確保即使在散射的激發(fā)光可能很強(qiáng)的情況下（例如在組織或細(xì)胞培養(yǎng)中），也能探測到較弱的熒光信號。第三，使用陣列探測器，在光譜上區(qū)分不同的熒光物質(zhì)。

本文使用條紋相機(jī)（Hamamatsu，M1955），該相機(jī)在同步掃描模式下運(yùn)行，相機(jī)內(nèi)的電子束與76 MHz 的激發(fā)脈沖序列同步掃描探測器屏幕。由于條紋跡線與激光脈沖同步，通過調(diào)整條紋相機(jī)掃描電壓相對于激發(fā)光的延遲（相位），可以使散射的激發(fā)光脫離檢測時(shí)間窗口，而熒光位于時(shí)間窗口內(nèi)，從而將散射的激發(fā)光濾除。在這種模式下運(yùn)行的頻帶相機(jī)提供了極高的散射激發(fā)光抑制率，遠(yuǎn)高于實(shí)際檢測動(dòng)態(tài)范圍，同時(shí)保持了極高的熒光檢測靈敏度。

1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

超連續(xù)譜具有典型的光纖源高空間相干性，同時(shí)保留激發(fā)各種熒光團(tuán)所需的寬帶。此外，超連續(xù)譜在時(shí)域上具有超短脈沖的優(yōu)點(diǎn)，故能夠在時(shí)間上實(shí)現(xiàn)將激發(fā)光與熒光分離，從而不再需要激發(fā)濾波器，并實(shí)現(xiàn)全光譜的同時(shí)激發(fā)。為驗(yàn)證超快脈沖激光器生成的超連續(xù)光源強(qiáng)度能夠充分激發(fā)熒光，將超連續(xù)光譜聚焦到一個(gè)玻璃皿中，玻璃皿中含有兩種染料，分別是6?羧基四甲基羅丹明（ 6-TAMRA） 和Deep Red。6-TAMRA是一種廣泛用于自動(dòng)DNA 測序和毛細(xì)管電泳的熒光團(tuán)。其吸收峰在547 nm 左右，發(fā)射峰在573 nm 左右[9]。Deep Red 是一種線粒體染色染料，其最大吸收峰為640 nm，發(fā)射峰約為662 nm[10]。二者的時(shí)間分辨熒光光譜如圖3 所示，盡管它們的吸收光譜明顯分開，但兩種染料均被超連續(xù)光源高效激發(fā)。熒光可以通過上文所提及的條紋相機(jī)收集并在時(shí)間域上進(jìn)行濾波。由于條紋相機(jī)的條紋跡線的時(shí)間延遲被調(diào)整以屏蔽掉散射的激發(fā)光，檢測到的信號僅由兩種染料的熒光組成。時(shí)間積分信號如圖4（a）所示，熒光衰減曲線如圖4（b）所示，該應(yīng)用易于擴(kuò)充至多種染料。

條紋相機(jī)的輸出圖像如圖4 所示，6-TAMRA和Deep Red 兩種染料完整的未經(jīng)濾波的圖像如圖4（a）所示，兩者的熒光衰減曲線如圖4（b）所示。圖4（a）表明測量出的兩種染料的熒光光譜圖與預(yù)期相符合，且兩者的中心波長分離較大，故兩者的熒光衰減曲線可被分離并在其中心波長處使用單一指數(shù)擬合。由圖4（ b）可知，Deep Red 的熒光壽命約為0.6 ns，而6-TAMRA的熒光壽命為2.4 ns，二者與其他文獻(xiàn)所測量的數(shù)據(jù)大致相符[11]。盡管兩種染料的光譜重疊很小，但衰減壽命的差異可以使不同的染料分子在光譜重疊的情況下被區(qū)分。結(jié)果表明，基于條紋相機(jī)超窄時(shí)間窗的無濾波顯微鏡可實(shí)現(xiàn)對超連續(xù)譜激發(fā)的多種染料熒光發(fā)射的時(shí)間分辨測量，并同時(shí)提供光譜和壽命數(shù)據(jù)。但是，該顯微鏡僅能實(shí)現(xiàn)熒光信號的檢測，無法實(shí)現(xiàn)熒光圖像的生成，與成像系統(tǒng)并不兼容，且光譜區(qū)分單獨(dú)染料的能力不足。

2 基于光擋阻隔裝置模型分析

2.1 基于光擋阻隔激發(fā)光的無濾波熒光顯微鏡

本文展示了一種利用熒光發(fā)射的偏振性和相干性開發(fā)的顯微鏡，采用450～680 nm波長光源獲取熒光圖像，并同時(shí)檢測相同范圍內(nèi)完整發(fā)射光譜，再使用偏振濾波器來區(qū)分熒光和背向反射光。熒光發(fā)射通常表現(xiàn)出較大程度的偏振各向異性，而反射光保留了照明的偏振狀態(tài)[12]。通過使用線偏振照明和交叉分析器，可以提高熒光和散射光之間的對比度，因?yàn)榉治銎飨鳒p了相當(dāng)比例的反射照明。例如，來自顯微鏡載玻片或透鏡表面的鏡面反射具有線偏振特性，大部分被濾除。雖然來自小特征的散射表現(xiàn)出一定的去極化[13]，但大部分背向散射光被移除，兩者之間存在一定的關(guān)系，但這種關(guān)系牽涉到較多方面，并不存在直觀的比例關(guān)系，顯微成像對比度取決于多個(gè)因素：樣品的結(jié)構(gòu)特性、偏振濾波器的光學(xué)性質(zhì)、熒光分子的性質(zhì)、成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。

照明和熒光的相干性質(zhì)差異為進(jìn)一步分離提供了可能性。采用空間相干光源照亮物鏡瞳孔中的一點(diǎn)提供均勻?qū)捯晥稣彰?，從平面（如顯微鏡載玻片）反射回來的照明光將沿著物鏡的互逆路徑穿過物鏡，形成瞳孔中的一個(gè)點(diǎn)，該點(diǎn)可通過一個(gè)小的光束阻擋器來屏蔽。熒光發(fā)射主要是非相干和各向同性的。其中只有一小部分會(huì)被光束阻擋器屏蔽。因此，這種空間相干性過濾增加了熒光與照明光之間的對比度。該原理已被用于高速狹縫掃描顯微鏡中產(chǎn)生線性照明，但該方案需與激光照明和發(fā)射濾光結(jié)合使用[14]。

基于光擋阻隔激發(fā)光的無濾波熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)如圖5 所示，采用Fianium SC450?2 WLS 源提供顯微鏡的寬譜照明（450～2 000 nm），輸出光通過濾光片，濾除所有波長超過680 nm 的光。然后，光束被擴(kuò)展并通過Glan Taylor 偏振器，由50 mm 焦距的透鏡聚焦。聚焦后的光束被傾斜放置于靠近物鏡后方，孔徑直徑為3 mm 的反射透鏡（ Zeiss PlanNeoFluar，40×，1.3 NA，油浸）反射。該傾斜鏡放置的位置是特定的，以確保照明光束在物鏡的瞳孔平面形成一個(gè)聚焦斑點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)樣本寬視場照明。樣本發(fā)出的光線由相同的物鏡透鏡收集，通過瞳孔平面的部分光線被光束阻擋器阻擋，其余部分入射至400 mm管狀透鏡并成像到CCD 相機(jī)上，也可以通過將光纖替換CCD相機(jī)的方式將其連接到OceanOptics USB2000分光計(jì)進(jìn)行樣本的光譜測量。

理想情況下，反射鏡和光束阻擋器應(yīng)置于物鏡的瞳孔平面。然而，由于大多數(shù)物鏡的瞳孔平面位于鏡頭筒內(nèi)，因此，反光鏡和光束阻擋器應(yīng)盡量靠近鏡頭的后孔徑。圖6 中標(biāo)出了兩種可能的反射鏡位置。如圖6（a）所示，反射鏡被置于光軸上，同時(shí)充當(dāng)光束阻擋器（假定鏡子的支撐物不會(huì)遮擋瞳孔）。如圖6（b）所示，鏡子被置于瞳孔邊緣，光束阻擋器（直徑3 mm 的塑料圓盤）被置于相對的位置。如圖6（a）所示，配置可使透鏡組件的反向反射減少，這是由于光路入射至透鏡表面角度較大處。照明光和樣品反射由橙色實(shí)線表示，透鏡的雜散反射由綠色虛線表示。在圖6（a）中，照明被聚焦至光軸上的一點(diǎn)；在圖6（b）中，照明被聚焦在物鏡瞳孔的邊緣。本研究比較了照明點(diǎn)位于光軸上與照明點(diǎn)位于透鏡外圍的光路示意圖：當(dāng)照明點(diǎn)位于透鏡外圍時(shí)，透鏡表面傾斜導(dǎo)致反射光在高角度偏轉(zhuǎn)，遠(yuǎn)離瞳孔，因此反射光被透鏡外殼阻擋；當(dāng)光照進(jìn)入光軸上的透鏡時(shí)，反射光穿過瞳孔返回，有助于增強(qiáng)檢測強(qiáng)度。由于遮擋散射光的效果取決于樣品的表面性質(zhì)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及光路上遮擋的尺寸，圖6（a）僅采用單個(gè)反射鏡可同時(shí)起到將光引入路徑以及充當(dāng)光擋的作用。圖6（b）使用反射透鏡引入光照，使用光束阻擋器對散射光進(jìn)行遮擋，可采用的遮擋部分的尺寸更大。故兩種遮擋方式的散射光誤差并不相同。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

為驗(yàn)證光擋阻隔激發(fā)光的無濾波熒光顯微鏡可以與任何探測器或光譜儀通道結(jié)合使用，而不受二向色鏡所允許的波段的限制，采用發(fā)射濾光片（無激發(fā)濾光）驗(yàn)證圖像的全光譜性質(zhì)，該方案具有普適性及多功能性。圖7（a）展示了由全光譜偏振濾波熒光顯微鏡采集的牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的光強(qiáng)圖像，該樣本由兩種不同波段的染料進(jìn)行熒光標(biāo)記，分別為BODIPY FL Phallacidin[15]（其吸收峰值505 nm，發(fā)射峰值512 nm）和MitoTrackerRed CMXRos[16]（其吸收峰值579 nm，發(fā)射峰值599 nm）。為了驗(yàn)證該光強(qiáng)圖像是否由兩種染料的發(fā)射熒光組成，將兩張對應(yīng)波長的窄通帶發(fā)射濾光片分別放置于檢測光路中，將波段為512 nm 綠色通道與波段為599 nm紅色通道記錄的圖像合并。由圖7（b）可知，合并的熒光圖像與全光譜光強(qiáng)圖像對應(yīng)良好，清晰地表明全光譜光強(qiáng)圖像中絕大多數(shù)是發(fā)射熒光，極少部分為散射激發(fā)光。

3 結(jié) 論

本文展示了兩種全波段無光學(xué)濾波熒光顯微鏡，分別是基于條紋相機(jī)超窄時(shí)間窗的無濾波顯微鏡及基于光擋阻隔激發(fā)光的無濾波顯微鏡。針對基于條紋相機(jī)超窄時(shí)間窗無濾波顯微鏡，采用超快超連續(xù)激發(fā)光源，結(jié)合激光脈沖時(shí)間域?yàn)V波技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了無光譜過濾的可見光到近紅外全光譜覆蓋。該檢測機(jī)制可以顯著改善諸如微孔板閱讀器、內(nèi)窺鏡和流式細(xì)胞儀等多色熒光儀器的性能。然而，這一檢測技術(shù)與成像系統(tǒng)并不兼容，無法獲取對應(yīng)的熒光圖像。針對基于光擋阻隔激發(fā)光的無濾波熒光顯微鏡，通過結(jié)合相干照明和瞳孔平面空間濾波，能夠?qū)崿F(xiàn)無光譜濾波器的全光譜熒光顯微成像。采用偏振濾波減弱了熒光強(qiáng)度，但增強(qiáng)了熒光與散射光的對比度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究展示的顯微鏡在無需濾光器的情況下，仍可實(shí)現(xiàn)全波段熒光成像，其適用于成像強(qiáng)熒光信號的低散射樣本，該方案的光學(xué)系統(tǒng)配置簡易，能夠與現(xiàn)有顯微鏡系統(tǒng)相結(jié)合使用。但由于散射過程中的去極化效應(yīng)，無法完全濾除散射光，在弱熒光成像實(shí)驗(yàn)中，聚焦平面若有相對較強(qiáng)的散射光，則無法實(shí)現(xiàn)熒光圖像的獲取。因此，后續(xù)可以結(jié)合一些光譜分離算法，將得到的圖像進(jìn)行光譜分離，進(jìn)一步提高圖像對比度，以應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。