摘要：近年來(lái)甲型H1N1 流感、埃博拉、乙型流感、新冠病毒等突發(fā)的具有傳染性的重大疫情，給人類的健康帶來(lái)了很大影響，因此針對(duì)環(huán)境病毒的檢測(cè)和預(yù)防變得至關(guān)重要。而免疫層析試紙條技術(shù)作為一種能夠?qū)崿F(xiàn)病毒快速檢測(cè)的新興技術(shù)，相較于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)具有普適性和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，解決了傳統(tǒng)的病毒抗原檢測(cè)流程復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，同時(shí)也為環(huán)境監(jiān)測(cè)提供了一種新的發(fā)展方向。然而，傳統(tǒng)的免疫層析試紙條存在檢測(cè)指標(biāo)單一、檢測(cè)限高等缺點(diǎn)?；诿庖邔游鲈嚰垪l和量子點(diǎn)熒光納米微球，設(shè)計(jì)了一種量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條，它具有光穩(wěn)定性好、亮度高和檢測(cè)限低的特點(diǎn)。通過(guò)儀器配套的熒光檢測(cè)模塊進(jìn)行分析和檢測(cè)時(shí)，量子點(diǎn)熒光納米微球的激發(fā)光可快速檢測(cè)出環(huán)境中的病毒。該方法操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)穩(wěn)定，為環(huán)境病毒檢測(cè)提供了一種新思路。

關(guān)鍵詞：環(huán)境病毒檢測(cè)；免疫層析技術(shù)；量子點(diǎn)熒光納米微球；試紙條

中圖分類號(hào)：TB 39 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

引 言

全球自2020 年至今，確診新冠病例超過(guò)7.525 億例，其中包括680 萬(wàn)例死亡病例。龐大的數(shù)字令人觸目驚心。而當(dāng)前全球新冠肺炎、甲流、乙流等疫情仍處于大流行階段，每年全球范圍內(nèi)約有10 億例季節(jié)性流感病例，包括300 萬(wàn)～500 萬(wàn)例重癥病例。季節(jié)性流感每年導(dǎo)致約65 萬(wàn)人死亡。5 歲以下兒童中，99% 的下呼吸道感染的流感死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家?？梢?jiàn)呼吸道感染是最簡(jiǎn)單且高效的感染方式。環(huán)境空氣的安全問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重影響到公眾健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)秩序等諸多方面。目前人類越來(lái)越需要重視生物安全，尤其是未知的病毒對(duì)人類健康安全、生態(tài)環(huán)境安全等帶來(lái)的不利影響[1-2]。

生物氣溶膠是指空氣中帶有生物性粒子的顆粒 [3-4]，這些氣溶膠大多數(shù)帶有不同種類的病毒和微生物，因此具有明顯的傳染性與致敏性。而且氣溶膠顆粒懸浮在空氣中很容易被吸入體內(nèi)，通過(guò)呼吸道途徑傳播疾病，即所謂的 “病從鼻入”，對(duì)人類健康有很大影響。在對(duì)抗傳染病的斗爭(zhēng)中，已經(jīng)證實(shí)多種傳染性疾病能夠通過(guò)氣溶膠傳播。因此針對(duì)環(huán)境中攜帶病毒微生物的生物氣溶膠的采集變得至關(guān)重要。近年來(lái)市面上涌現(xiàn)出越來(lái)越多的環(huán)境病毒氣溶膠富集檢測(cè)儀器[5]，給環(huán)境病毒監(jiān)測(cè)領(lǐng)域做出了巨大的貢獻(xiàn)。而配套使用的各種檢測(cè)試紙條也越來(lái)越多[6-9]，原理也不盡相同。在這期間免疫熒光層析技術(shù)脫穎而出，它具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測(cè)，隨著標(biāo)記固相材料技術(shù)的發(fā)展，能夠?qū)崿F(xiàn)定量檢測(cè)、多重檢測(cè)等，具有良好的應(yīng)用前景。

免疫層析技術(shù)[10] 利用免疫學(xué)原理，結(jié)合抗原抗體的特異性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)標(biāo)志物的檢測(cè)。以有固定T 線（檢測(cè)線）、C 線（控制線）的纖維膜材料層析試紙作為固定相，待檢測(cè)的混合液作為流動(dòng)相，當(dāng)流動(dòng)的待測(cè)液流動(dòng)相經(jīng)過(guò)T 線時(shí)，抗原與抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，完成目標(biāo)組分分離。其較低的檢測(cè)成本與快速便攜的特點(diǎn)，使得面向家庭的檢測(cè)成為可能。此外量子點(diǎn)熒光納米微球[11-12] 作為熒光探針標(biāo)記病毒標(biāo)志物，由于其熒光波長(zhǎng)可調(diào)、激發(fā)光譜寬、量子產(chǎn)率高、發(fā)射強(qiáng)度高且穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在過(guò)去的幾十年中已逐漸成為生物領(lǐng)域重要的熒光標(biāo)記材料，其優(yōu)異的發(fā)光性能和獨(dú)特的光穩(wěn)定性可以賦予檢測(cè)結(jié)果高精準(zhǔn)性和靈敏度。

本文設(shè)計(jì)了一種量子點(diǎn)熒光納米微球免疫層析試紙條，其中包括：底板，以及依次設(shè)置在底板上的樣品墊、復(fù)合型結(jié)合墊、反應(yīng)墊以及吸水墊，其中樣品墊用于加載樣本，復(fù)合型結(jié)合墊設(shè)有量子點(diǎn)熒光納米微球標(biāo)記的病毒檢測(cè)克隆抗體。通過(guò)環(huán)境病毒檢測(cè)儀器將空氣中的病毒目標(biāo)物富集到樣品溶液中并加載到試紙條上進(jìn)行檢測(cè)，最終分析出對(duì)應(yīng)的不同病毒目標(biāo)物。本研究選取了3 種病毒作為檢測(cè)目標(biāo)： 新冠病毒（COVID-19）、甲型流感病毒（Influenza A Virus）和乙型流感病毒（Influenza B Virus）。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

N?羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽（磺基?NHS）購(gòu)置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。量子點(diǎn)熒光納米微球?625 由珈源量子點(diǎn)提供。磷酸鹽緩沖溶液（peptone buffered solution ， PBS）購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司。樣品墊與結(jié)合墊購(gòu)于上海杰一生物技術(shù)有限公司，吸水墊與PVC 底板由南京微測(cè)生物科技有限公司提供，硝酸纖維素膜購(gòu)于上海賽多利斯公司。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用到的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）從中國(guó)索萊寶公司購(gòu)買。

實(shí)驗(yàn)中所用的主要儀器有環(huán)境病毒檢測(cè)儀（自研）、Millipore 超純系統(tǒng)（德國(guó)），BeckmanCoulter 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)），超聲波儀器（中國(guó)），Tecan Spark 多功能酶標(biāo)儀（瑞士）。

1.2 樣品的梯度稀釋

首先，使用蒸餾水或去離子水對(duì)樣品稀釋液進(jìn)行1∶10 倍的稀釋；接著，用樣品稀釋液將樣品做1∶5 倍的稀釋；然后制備標(biāo)準(zhǔn)液：提前準(zhǔn)備好8 個(gè)1.5 mL 離心管，第1 管中加入900 μL樣品稀釋液，第2 至第8 管中加入同體積的樣品稀釋液500 μL。將2 000 ng/mL的100 μL 樣品溶液加入第1 管中，在并在漩渦混合器上充分混合，然后用移液槍吸取500 μL加入第2 管中。重復(fù)此操作以作對(duì)半稀釋，在第7 管中吸出500 μL 并丟棄至廢液缸內(nèi)，第8 管則為空白對(duì)照，并在37 ℃ 的黑暗處放置15 min。最后向每個(gè)試紙條的樣品孔加入100～200 μL 的被梯度稀釋的樣品溶液，并充分反應(yīng)。最后，使用成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行曝光以進(jìn)行顯色，并觀察條帶的C 線和T 線。

1.3 量子點(diǎn)熒光納米微球標(biāo)記檢測(cè)抗體

首先將10 μL 量子點(diǎn)熒光納米微球分散至MES（ 2-Morpholinoethanesulphonic acid） 溶液中并離心。離心后分離上層清液再將其重新加入MES 溶液中并進(jìn)行超聲分散。之后分別配置10 mg/mL 的EDC 溶液與NHS 溶液， 加入至MES 溶液中，充分混合后離心。離心結(jié)束后分離上層清液并加入1 mL 抗體稀釋液，與目標(biāo)檢測(cè)抗體溶液混合后孵育1.5 h。孵育完成后加入20% BSA 溶液封閉，再次離心后分離量子點(diǎn)熒光納米微球，并復(fù)溶于含有10% 蔗糖，5% 海藻糖與1% BSA 的混合液中，在4 ℃ 下保存?zhèn)溆?，如圖1 所示。

1.4 免疫層析試紙條的制備

免疫層析試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、硝酸纖維素膜（反應(yīng)墊）與PVC 底板構(gòu)成。首先在PVC 底板上粘貼硝酸纖維素膜，在一端粘貼樣品墊與結(jié)合墊，另一端粘貼樣品墊。預(yù)先配置好由含有0.1% 蔗糖的PBS 緩沖液稀釋的山羊抗小鼠IgG 溶液，使用劃膜噴金儀將上述溶液均勻預(yù)置在硝酸纖維素膜上形成C 線，以同樣過(guò)程處理新冠病毒COVID-19（其余病毒的捕獲抗體均采取本方法）捕獲抗體溶液形成T 線[ 如圖2（a）所示]。將其置于37 ℃ 干燥箱中干燥后裁切為寬度均勻的免疫層析試紙條以備使用。制作好的量子點(diǎn)熒光納米微球免疫層析試紙條配套環(huán)境病毒分析儀使用，試紙條由轉(zhuǎn)盤裝置精準(zhǔn)運(yùn)送到熒光檢測(cè)裝置下方，由該裝置進(jìn)行熒光讀取，由分析裝置分析熒光值并辨別病毒類別[ 見(jiàn)圖2（b）]。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光強(qiáng)度與樣品質(zhì)量濃度的關(guān)系

為檢測(cè)所設(shè)計(jì)研發(fā)的試紙條在不同的樣品濃度下熒光強(qiáng)度的變化情況，選取了COVID-19 重組N 蛋白作為檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化的樣品，初始質(zhì)量濃度為2 μg/mL。梯度稀釋完成后將稀釋樣品逐個(gè)加載到試紙條上，待完全反應(yīng)后記錄試紙條的熒光強(qiáng)度。如圖3 所示，可明顯觀察到不同樣品質(zhì)量濃度下的熒光強(qiáng)度變化。

2.2 最小檢測(cè)時(shí)間

為了檢測(cè)試紙條對(duì)不同病毒樣本檢測(cè)的反應(yīng)速度，本研究選取能夠覆蓋不同檢測(cè)質(zhì)量濃度水平（pg 級(jí)到mg 級(jí)）以及檢測(cè)范圍較寬的檢測(cè)項(xiàng)目，如：COVID-19 重組N 蛋白、甲型流感抗原、乙型流感抗原。這些選擇的檢測(cè)項(xiàng)目涵蓋了當(dāng)前熱點(diǎn)病毒，跨越了不同濃度水平和檢測(cè)范圍。

使用上述3 種標(biāo)準(zhǔn)品作為環(huán)境病毒氣溶膠樣品，并用樣品稀釋液將生物氣溶膠標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，最終得到1 000 倍稀釋的樣本。隨后取100 μL 樣本溶液滴入到試紙條中并由環(huán)境病毒檢測(cè)儀讀取數(shù)值。每隔5 min 檢測(cè)一次，并持續(xù)記錄3 h 內(nèi)所測(cè)的樣本數(shù)值。通過(guò)分析得出數(shù)值穩(wěn)定后的最小時(shí)間作為測(cè)試的時(shí)間，從而確保在不同質(zhì)量濃度水平的準(zhǔn)確檢測(cè)，以及找到恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)時(shí)間窗口。表1、2、3 是測(cè)得的時(shí)間與質(zhì)量濃度的數(shù)據(jù)表，從表中可知1 000 倍稀釋的樣本20 min 后樣本數(shù)值達(dá)到最大值且數(shù)值趨于穩(wěn)定，時(shí)間曲線如圖4 所示。

2.3 重復(fù)性檢測(cè)

為了驗(yàn)證試紙條的可靠性和穩(wěn)定性，本研究進(jìn)行了重復(fù)性測(cè)試。使用樣品稀釋液將3 種環(huán)境病毒氣溶膠標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行1∶100 稀釋，并將標(biāo)準(zhǔn)品溶液滴到試紙條中，待20 min 后使用環(huán)境病毒檢測(cè)儀檢測(cè)20 次，輸出讀取的數(shù)值。圖5 是COVID-19 重組N 蛋白、乙型流感抗原和甲型流感抗原3 種病毒樣品的重復(fù)性測(cè)試結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果顯示重復(fù)20 次的結(jié)果基本趨于平穩(wěn)。

2.4 時(shí)間穩(wěn)定性檢測(cè)

為了驗(yàn)證試紙條的時(shí)間穩(wěn)定性，選取了3 個(gè)不同病毒樣品的1∶100 稀釋濃度樣品溶液進(jìn)行測(cè)試，將溶液分別加載到試紙條上并充分反應(yīng)。待其處于穩(wěn)定狀態(tài)后，重復(fù)測(cè)試并記錄各試紙條的熒光強(qiáng)度讀取數(shù)值。在3 h 內(nèi)重復(fù)測(cè)試各樣品10 次，以第1 輪的測(cè)定結(jié)果作為基準(zhǔn)值。如圖6 所示，（a）、（b）、（c）分別是COVID-19 重組N 蛋白、乙型流感抗原、甲型流感抗原在1∶100 的稀釋濃度下的時(shí)間穩(wěn)定性圖。由圖6可見(jiàn)，20 min 后的測(cè)量熒光強(qiáng)度數(shù)值與20 min時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度數(shù)值波動(dòng)范圍并不劇烈，3 種標(biāo)準(zhǔn)品均有良好的時(shí)間穩(wěn)定性，偏差最大的是乙型流感抗原，在180 min 時(shí)的偏差是0.05%，綜合可見(jiàn)穩(wěn)定性良好。

3 結(jié) 論

本研究利用免疫層析試技術(shù)，采用量子點(diǎn)熒光納米微球作為新型標(biāo)記物，設(shè)計(jì)了一種新型的免疫層析試紙條，并開(kāi)發(fā)出一種環(huán)境病原體檢測(cè)技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)的核心是利用不同顏色的量子點(diǎn)熒光納米微球，每種量子點(diǎn)熒光納米微球都標(biāo)記有特定的抗體，能夠針對(duì)不同的病原體進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)與環(huán)境病毒檢測(cè)儀器的紫外熒光分析模塊配合使用，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出目標(biāo)病原體。選取了3 種常見(jiàn)的病原體作為目標(biāo)物：新冠病毒COVID-19、乙型流感和甲型流感。針對(duì)試紙條的熒光強(qiáng)度、最小檢測(cè)時(shí)間、可重復(fù)性以及時(shí)間穩(wěn)定性進(jìn)行了深入的驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該試紙條具有較小的檢測(cè)時(shí)間，可在不同場(chǎng)所下應(yīng)對(duì)各種突發(fā)情況，能夠提供最大可能性的準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果。由于量子點(diǎn)熒光納米微球標(biāo)記的抗體種類可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇和更換，因此適用于不同的病原體檢測(cè)。此外，量子點(diǎn)熒光納米微球具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，試紙條具有較長(zhǎng)的保存期限。當(dāng)前，環(huán)境中的病原體已經(jīng)成為一項(xiàng)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。本研究所開(kāi)發(fā)的量子點(diǎn)熒光納米微球免疫層析試紙條具有廣闊的應(yīng)用前景。它可以被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、環(huán)境衛(wèi)生、食品安全等領(lǐng)域的病原體檢測(cè)中。在未來(lái)，將繼續(xù)對(duì)該技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，為保護(hù)人民健康和安全做出更大的貢獻(xiàn)。