摘要：目的探討阿福豆苷（AFZ）在克羅恩病樣結(jié)腸炎中的作用機制。方法建立2，4，6-三硝基苯磺酸（TN-BS）誘導的小鼠模型，體內(nèi)評估AFZ對實驗性結(jié)腸炎小鼠的作用；體外建立腫瘤壞死因子- （TNF- ）誘導的Caco-2模型，評估AFZ對腸屏障功能、腸上皮細胞凋亡和線粒體功能的影響。體內(nèi)外研究驗證腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）/過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 輔激活子 1 α （ P G C - 1α ）通路在AFZ治療結(jié)腸炎中的調(diào)控作用。結(jié)果AFZ顯著改善TNBS小鼠的疾病活動指數(shù)（ P = 0 . 0 0 3 ）、體重下降（ P lt; 0 . 0 0 1 ）、結(jié)腸縮短（ P lt; 0 . 0 0 1 ）、結(jié)腸炎癥評分（ ）和促炎因子（白細胞介素-6： P lt; 0 . 0 0 1 ；TNF- α ： P = 0 . 0 1 0 ）水平，以及腸屏障通透性（異硫氰酸熒光素葡聚糖4： P lt; 0 . 0 0 1 ；腸型脂肪酸結(jié)合蛋白： P = 0 . 0 1 3 ）、結(jié)腸上皮電阻（ P = 0 . 0 0 1 ）、細菌移位（ P lt; 0 . 0 0 1 ）和緊密連接蛋白［閉鎖小帶蛋白1（ P = 0 . 0 0 5 ）和緊密連接蛋白-1（ P = 0 . 0 2 4 ? ］的定位與表達。在TNF 誘導的Caco-2模型中，AFZ對腸上皮細胞的通透性（ P = 0 . 0 1 7 ）、跨上皮電阻（ P = 0 . 0 1 4 ）和緊密連接蛋白［閉鎖小帶蛋白1（ P = 0 . 0 1 4 ）和緊密連接蛋白-1（ P = 0 . 0 0 6 ） ］的定位與表達具有保護作用。體外和體內(nèi)研究結(jié)果證實，AFZ減少腸上皮細胞的凋亡比例（ Plt;0 . 0 0 1 ， P = 0 . 0 1 3 ）、裂解型半胱氨酸蛋白酶3（ P = 0 . 0 2 8 ， P = 0 . 0 0 4 ）和Bax（ P = 0 . 0 0 4 ， P = 0 . 0 2 0 ）的表達，且上調(diào)Bcl2（ P = 0 . 0 2 0 ， P = 0 . 0 0 6 ）的水平。AFZ增加腸上皮細胞中線粒體數(shù)量和線粒體膜電位，增加線粒體DNA拷貝數(shù)（ ），增強線粒體呼吸鏈復合體I（ P = 0 . 0 0 5 ）和V（ P = 0 . 0 0 1 ）的活性。AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 通路的激活參與了AFZ對腸上皮細胞線粒體功能和凋亡的保護作用。結(jié)論AFZ可改善腸屏障功能障礙和實驗性結(jié)腸炎，這與其激活AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 通路保護腸上皮細胞免受線粒體功能障礙和細胞凋亡有關(guān)。

通信作者：電話：0552-3086267，電子郵件：lijingbyfy@bbmu.edu.cn

關(guān)鍵詞：克羅恩?。话⒏６管?；腸屏障功能；線粒體功能

中圖分類號：R574.1文獻標識碼：A 文章編號：1000-503X（2025）02-0207-12

DOI：10.3881/j. issn.1000-503X.1612

Effect of Afzelin on 2， 4， 6- Trinitrobenzene Sulfonic Acid- Induced Colitis in Mice

GENG Zhijun ，YIN Lixia3，NIU Minzhu4，YANG Jingjing§， ZHANG Xiaofeng ，LI Jing

（20 Central Laboratory，The FirstAfliated Hospital of Bengbu Medical University，Bengbu，Anhui 233O03，China AnhuiProvinceKeyLaboratoryofBasicandTranslationalResearchofInflammation-RelatedDiseases，BengbuMedicalUniversityBengb Anhui，China （2號 Departmentof Clinical Laboratory，The FirstAfliated Hospitalof Bengbu Medical University，Bengbu，Anhui，China （20 Department of Immunology，Scholof Laboratory Medicine，Bengbu Medical University，Bengbu，Anhui ，China （204號 DepartmentofGastrointestinalSurgery，TheFirstAfiliated HospitalofBengbu Medical University，Bengbu，Anhui230，Cina

ABSTRACT： ObjectiveTo investigate the role and mechanism of afzelin （AFZ） in treating Crohn’s disease-like colitis.MethodsA mouse model of 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis was established toassess theefectofAFZonexperimentalcolitis in vivo.A Caco-2cell model of tumor necrosis factor （TNF）- α -induced inflammation was established to evaluate the effects of AFZ on the intestinal barrier function， intestinal epithelial cellapoptosis，and mitochondrial function in vitro.The animalandcell experiments were performed to validate the regulatory role of the adenosine monophosphate-activated protein kinase（AMPK）/silent information regulater 1（SIRT1）/peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator（PGC）- pathway in the treatment of colitis with AFZ.ResultsAFZ reduced the disease activity index （ P = 0 . 0 0 3 ）， weight loss （ P lt; 0 . 0 0 1 ），colon shortening （ Plt;0 . 0 0 1 ） ，inflammation score （ P = 0 . 0 0 2 ），pro-inflammatory cytokine release（interleukin-6： P lt; 0 . 0 0 1 ； TNF- α ： P = 0 . 0 1 0 ），and intestinal barrier permeability（fluorescein isothiocyanate dextran 4： P lt; 0 . 0 0 1 ；intestinal-type fatty acid- binding protein： P = 0 . 0 1 3 ）. Meanwhile，AFZ increased the colonic transepithelial electric resistance（ P = 0 . 0 0 1 ），reduced bacterial translocation （ P lt; 0 . 0 0 1 ），and promoted the localization and up-regulated the expression of tight junction proteins [ zonula occluden-1（ P = 0 . 0 0 5 ）and Claudin-1（ P = 0 . 0 2 4 ）] .AFZ exerted a protective efect on the Caco-2 cells exposed to TNF- α in terms of intestinal epithelial cell permeability（ P = 0 . 0 1 7 ），transepithelial electric resistance（ P = 0 . 0 1 4 ），and tight junction protein［zonula occluden-1（ P = 0 . 0 1 4 ）andClaudin-1（ P = 0.006）]localization and expression.Furthermore，the celland animal experiments confirmed that AFZ reduced the percentage of apoptosis（ P lt; 0 . 0 0 1 ， P = 0 . 0 1 3 ） and the expression of cleaved-caspase 3 （ P = （204號 0.004）and Bax（ P = 0 . 0 0 4 ， P = 0 . 0 2 0 ），and upregulated the Bcl2（ P = 0 . 0 2 0 ， P = 0 . 0 0 6 ， level in intestinal epithelial cells.Additionally，AFZ increased the number of mitochondria，mitochondrial membrane potential，and copy number of mitochondrial DNA （ P = 0 . 0 0 7 ）in intestinal epithelial cells，while enhancing the activities of mitochondrial respiratory chain complex I（ P = 0 . 0 0 5 ）and complex I V （ P = 0 . 0 0 1 ）. The activation of the AMPK/SIRT1/PGC- pathway was involved in the protective effects of AFZ on mitochondrial function and apoptosis in intestinal epithelial cells.ConclusionAFZ alleviates mitochondrial dysfunction and apoptosis in intestinal epithelial cells by activating the AMPK/SIRT1/PGC- 1 α pathway，thereby ameliorating intestinal barrier dysfunction and experimental colitis.

KeyWords：Crohn’s disease；afzelin；intestinal barrier function；mitochondrial function

ActaAcadMedSin，2025，47（2）：207-218

克羅恩?。–rohn‘sdisease，CD）是一種無法治愈、反復發(fā)作的慢性透壁性炎癥性腸病，雖然生物制劑等抗炎藥物可以控制病情，但伴隨著不良反應（如嘔吐、免疫抑制和過敏反應等）[1-2]。腸屏障功能障礙是CD發(fā)病和進展的重要因素之一，而恢復腸屏障功能是減輕炎癥反應、降低復發(fā)風險和改善患者生活質(zhì)量的方法之一[3]。腸上皮細胞作為腸黏膜的主要結(jié)構(gòu)之一，在維持腸道屏障功能和抵御外界人侵物質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用，其過度凋亡會導致屏障功能受損[4]。線粒體主要負責產(chǎn)生ATP和調(diào)節(jié)細胞凋亡，其功能受損會導致細胞能量代謝紊亂，進而促進CD患者腸上皮細胞的凋亡。研究表明平衡線粒體功能有助于減少腸上皮細胞的過度凋亡，因此，這可能是改善CD 癥狀和腸炎的一種潛在治療策略[5-6]。近年來，天然植物單體在治療炎癥相關(guān)疾病方面顯示出巨大潛力，阿福豆苷（afzelin，AFZ）是從魚腥草提取的一種黃酮醇苷[7]。據(jù)報道，AFZ不僅具有抗炎、抗細胞凋亡、抗氧化和保護肝損傷等多種藥理活性，而且無毒[7-9]。肝衰竭中，AFZ 能改善線粒體膜電位破壞和調(diào)節(jié)線粒體功能，抑制肝細胞凋亡[8]。但是AFZ 在CD中的作用報道較少，本研究通過建立2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid，TNBS）誘導的實驗性結(jié)腸炎模型和腫瘤壞死因子- （tumor necrosis factor- α ，TNF- α ）誘導的Caco-2模型，分析AFZ對腸炎、腸屏障功能、腸上皮細胞凋亡和線粒體功能障礙的作用及可能的分子機制。

1材料和方法

1.1小鼠結(jié)腸炎模型建立和分組

50只野生型 C 5 7 B L/ 6 小鼠購于江蘇省集萃藥康生物科技股份有限公司，小鼠干預包括兩部分：（1）驗證AFZ抗腸炎作用。將小鼠隨機分成野生型、TNBS和AFZ組，每組10只。TNBS組小鼠建模如下：禁食2 4 h 后，小鼠經(jīng) 5 0 m g / k g 戊巴比妥鈉麻醉，給予 1 0 0 μ L 含有 2 . 5 % 的 TNBS和 5 0 % 乙醇混合溶液灌腸[10]AFZ組小鼠在TNBS建模后，每日通過灌胃給予 2 0 0 μ L 的AFZ（乙醇配置， ）治療[9]；TNBS組小鼠在TNBS建模后，每日給予 2 0 0 μ L 的乙醇干預；野生型組小鼠每日給予 1 0 0 μ L 的 5 0 % 乙醇灌腸和 2 0 0 μ L 的乙醇灌胃處理。（2）驗證 -磷酸腺苷激活的蛋白激酶（ - adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/沉默調(diào)節(jié)蛋白1（silent information regulator1，SIRT1）/過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 輔激活子1 α （peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator1alpha， P G C -1 α ）通路。將小鼠分成AFZ組和SR-18292（ P G C -1 α 抑制劑）組，每組10只。AFZ組小鼠在TNBS建模后，每日通過灌胃給予 2 0 0 μ L 的AFZ （ 1 0 m g / k g ）治療；SR-18292組小鼠在TNBS建模后，每日給予腹腔注射SR-18292（ 5 0 m g / k g [1]和灌胃AFZ（ ）干預，造模第7天后處死小鼠，取血清和結(jié)腸、腸系膜淋巴結(jié)、脾、肝臟等組織，用于后續(xù)檢測。

1.2TNF- 誘導Caco-2模型建立和分組

Caco-2細胞培養(yǎng)于含有 20 % 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。細胞干預包括兩部分：（1）驗證AFZ抗腸上皮細胞凋亡作用。將Caco-2細胞分成對照組、TNF- α - C 組和AFZ-C組。TNF- 組細胞經(jīng)TNF- 重組蛋白（ 2 0 n g / m L ）處理 ；AFZ-C 組細胞先與 AFZ（ ）預孵育 ，再經(jīng) 2 0 n g / m L 的TNF- 處理 2 4 h ；將正常培養(yǎng)的Caco-2細胞作為對照組。（2）驗證AMPK/SIRT1/PGC- 通路。將Caco-2細胞分成AFZ-C 組和SR-18292（ P G C - 1α 抑制劑）組，AFZ-C組細胞先與AFZ（ 4 0 μ m o l / L ）預孵育3 0 m i n ，再經(jīng) 2 0 n g / m L 的TNF- α 處理 2 4 h ；SR-18292組細胞先與SR-18292（ ）[13]和AFZ（ ）預孵育 3 0 m i n ，再經(jīng) 2 0 n g / m L 的TNF- 處理 2 4 h 。

1.3評估AFZ對小鼠結(jié)腸炎的影響

1.3.1 評估腸炎癥狀

于處死小鼠當日和建立TNBS模型當日分別稱取小鼠的體重，兩者之間的差值認為是體重變化。取檢當日測量結(jié)腸長度，疾病活動指數(shù)（diseaseactivityin-dex，DAI）評分主要根據(jù)小鼠體重指數(shù)、糞便形狀和便血情況的標準進行評估[14]

1.3.2結(jié)腸組織HE染色和炎癥評分

小鼠結(jié)腸組織經(jīng) 4 % 多聚甲醛固定 后，經(jīng)石蠟包埋、切片（ 4 μ m 厚）、脫蠟、蘇木素和伊紅染色，中性樹脂封片，置于顯微鏡下采集圖片。依據(jù)文獻報道標準[15]對結(jié)腸組織進行炎癥評分。

1.3.3實時熒光定量PCR檢測腸黏膜組織中炎癥因子表達水平

取新鮮的結(jié)腸組織，刮去腸黏膜組織，通過Trizol法提取RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)和熒光定量PCR說明書，檢測白細胞介素-6（interleukin6，IL-6）和TNF- mR-NA水平。IL-6上游引物： - TCTATACCACTTCA-CAAGTCGGA- ，下游引物： - GAATTGCCATTG-CACAACTCTTT-3’；TNF- 上游引物： -CAGGCG-GTGCCTATGTCTC- ，下游引物： - CGATCAC-CCCGAAGTTCAGTAG- ；GAPDH上游引物： 1TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3’，下游引物： 1CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3’。

1.3.4ELISA評估黏膜組織中IL-6和TNF- 的含量刮取新鮮的腸黏膜組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白。根據(jù)ELISA試劑盒操作說明書檢測腸黏膜組織中IL-6和TNF- 的水平。

1.4評估AFZ對腸屏障的影響

1.4.1ELISA檢測血清中腸脂肪酸結(jié)合蛋白的水平

收集小鼠的血清，依據(jù)ELISA試劑盒操作說明書，分析腸脂肪酸結(jié)合蛋白（intestinalfattyacid-bind-ingprotein，I-FABP）的含量。

1.4.2腸道菌群移位至腸系膜淋巴結(jié)、脾和肝臟組織中陽性率的分析

取新鮮的腸系膜淋巴結(jié)、脾和肝臟，通過無菌方式從各個器官中取 的樣本，研磨勻漿后用 生理鹽水稀釋，取 1 0 0 μ L 培養(yǎng)于MacConkey培養(yǎng)板上，超過 個菌落數(shù)/ 判斷為陽性。

1.4.3體內(nèi)外通透性檢測

體內(nèi)異硫氰酸熒光素葡聚糖4（fluoresceinisothio-cyanatedextran4，F(xiàn)D4）通透性評估：小鼠禁食 灌胃 4 0 0 m g / k g 的FD4（相對分子質(zhì)量4000）， 后通過摘眼球方式收集小鼠血清，檢測FD4的熒光濃度。體外FD4分析單層細胞通透性：細胞長成單層后，用PBS洗滌3次，加人 2 0 0 μ L 的FD4（ mL），孵育 后，檢測FD4的熒光濃度。

1.4.4結(jié)腸組織和Caco-2細胞的跨上皮電阻檢測

結(jié)腸組織跨上皮電阻（transepithelialelectricresist-ance，TEER）檢測[16]：小鼠新鮮結(jié)腸經(jīng)管腔內(nèi)容物清除后，沿腸系膜軸線裁剪為 ，并置于Krebs緩沖液中，放入尤斯灌流室（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）中測量TEER。細胞TEER檢測[17]：將Caco-2細胞（ 個 ）接種到Tran-swell小室（ 0 . 4 μ m ，康寧公司）中，上室和下室加入培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，經(jīng)TNF- 和AFZ干預后，經(jīng)MillicellERS-2電壓電阻表（默克密理博公司）測定TEER。

1.4.5免疫熒光檢測結(jié)腸組織和Caco-2細胞中緊密連接蛋白的表達與定位

4 μ m 厚的石蠟結(jié)腸組織切片經(jīng)脫蠟、抗原修復和封閉后，再與一抗［抗閉鎖小帶蛋白1（ 1 ： 4 0 0 ，賽默飛世爾科技公司）、抗緊密連接蛋白-1（ 1 ： 5 0 0 ，艾博抗貿(mào)易有限公司）、抗線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（ 1 ： 8 0 0 ，武漢賽維爾生物科技有限公司）」、二抗［山羊抗小鼠IgG（重鏈 + 輕鏈）（異硫氰酸熒光素）（ ，艾博抗貿(mào)易有限公司）、山羊抗兔IgG（重鏈 + 輕鏈）（異硫氰酸熒光素）（ ，艾博抗貿(mào)易有限公司）]和 ，6-二胱基-2-苯基吲哚（ 2 μ g/ m L ，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）孵育，最后經(jīng)激光共聚焦顯微鏡采集圖片。Caco-2細胞經(jīng)固定、破膜和封閉后，其余操作同結(jié)腸組織石蠟切片步驟。

1.4.6免疫印跡分析腸黏膜組織和Caco-2細胞中緊密連接蛋白的水平

腸黏膜組織和細胞經(jīng)RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白經(jīng)定量、變性、電泳和轉(zhuǎn)膜。膜再經(jīng)封閉、一抗[抗閉鎖小帶蛋白1（ ）和抗緊密連接蛋白-1（ 丁和二抗［辣根過氧化物酶標記山羊抗兔/鼠 I g G （重鏈 + 輕鏈），中杉金橋生物有限公司； 孵育以及底物顯色且采集圖片。

1.5評估AFZ對腸上皮細胞凋亡的影響

1.5.1流式細胞術(shù)檢測Caco-2細胞的凋亡水平

熒光素標記膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶細胞凋亡檢測試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）用于檢測細胞凋亡，根據(jù)試劑盒操作說明書，使用流式細胞儀對細胞進行檢測。

1.5.2Tunel染色分析結(jié)腸組織中腸上皮細胞的凋亡率

依據(jù)Tunel染色試劑盒（瑞士霍夫曼-羅氏有限公司）的操作說明書，對結(jié)腸組織和Caco-2細胞進行染色，經(jīng)熒光顯微鏡采集圖片。

1.5.3免疫印跡分析黏膜組織和細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達

提取的總蛋白經(jīng)定量、變性、電泳和轉(zhuǎn)膜，膜再經(jīng)封閉、抗體［抗裂解型半胱氨酸蛋白酶3（1： ，賽信通生物試劑有限公司）、抗Bcl-2相關(guān)X蛋白（ ，艾博抗貿(mào)易有限公司）、抗B細胞淋巴瘤/白血病-2（ 1 ： 1 0 0 0 ，艾博抗貿(mào)易有限公司）］孵育及底物顯色且采集圖片。

1.6評估AFZ對線粒體功能障礙的影響

1.6.1 JC-1線粒體膜電位檢測

棄去Caco-2細胞培養(yǎng)基，Caco-2細胞經(jīng) 1 m L 的JC-1染色緩沖液洗滌2次后，與 1 m L 的JC-1染色工作液在 培養(yǎng)箱中孵育 3 0 m i n 。孵育結(jié)束后，吸棄上清液，加入JC-1染色緩沖液洗滌2次，置于激光共聚焦顯微鏡中采集圖片。

1.6.2 線粒體DNA的檢測

提取結(jié)腸組織和Caco-2細胞中線粒體DNA（mi-tochondrialDNA，mtDNA），根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書檢測mtDNA水平，引物如下：小鼠mtDNA上游引物： "，下游引物： - CCTTGACGGCTATGTTGATG- ；小鼠 β -珠蛋白上游引物：，下游引物： -’；人 mtDNA上游引物：5’-’，下游引物：；人 β -珠蛋白上游引物：" ，下游引物：5’-。

1.6.3線粒體呼吸鏈復合物的檢測

提取結(jié)腸組織或Caco-2細胞蛋白，并進行定量分析，依據(jù)復合體I活性檢測試劑盒和復合體V活性檢測試劑盒的操作說明書，分別評估線粒體復合物活性I和V的活性。

1. 7 驗證AMPK/SIRT1/PGC- 1αα 通路

1.7.1 體內(nèi)外通過免疫印跡評估對AMPK/SIRT1/ PGC- 1 α 通路的影響

提取的總蛋白經(jīng)定量、變性、電泳和轉(zhuǎn)膜，膜再經(jīng)封閉、抗體［抗磷酸化AMPK（ ，艾博抗貿(mào)易有限公司）、抗AMPK（ ，艾博抗貿(mào)易有限公司）、抗SIRT1（ ，艾博抗貿(mào)易有限公司）和抗人PGC- 1 α （ ，艾博抗貿(mào)易有限公司）］孵育及底物顯色且采集圖片。

1.7.2體內(nèi)評估AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 通路對調(diào)控腸炎和腸屏障功能障礙的作用

通過小鼠體重變化、DAI評分、結(jié)腸組織炎癥評分和黏膜組織中炎癥因子的表達水平評估AMPKSIRT1/PGC- 1 α 信號在AFZ調(diào)控小腸實驗性結(jié)腸炎和腸屏障功能中的作用。

1.7.3 體外評估AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 通路在AFZ調(diào)節(jié)線粒體功能和腸上皮細胞凋亡中的作用

經(jīng)JC-1線粒體膜電位染色、mtDNA拷貝數(shù)、線粒體呼吸鏈I和V活性以及凋亡相關(guān)蛋白表達水平分析AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 通路對AFZ調(diào)控線粒體功能障礙和腸上皮細胞凋亡的影響。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料表示為 ，組間差異采用 檢驗或單因素方差分析，細菌移位率的計算采用卡方檢驗。 P lt; 0 . 0 5 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1AFZ對TNBS誘導小鼠結(jié)腸炎的影響

AFZ顯著緩解了TNBS誘導小鼠的體重下降（ P lt; 0.001）（圖1A）。與TNBS小鼠相比，AFZ治療后的小鼠DAI評分明顯降低（ P = 0 . 0 0 3 ）（圖1B），結(jié)腸的長度顯著增加（ P lt; 0 . 0 0 1 ）（圖1C）。對小鼠的結(jié)腸組織進一步病理學分析顯示，AFZ組小鼠的結(jié)腸組織中炎癥細胞的浸潤和炎癥評分得到顯著改善（ P = 0.002）（圖1D、1E）。實時熒光定量PCR和ELISA檢測結(jié)果顯示，AFZ組小鼠腸黏膜中IL-6（ P 均 lt; 0.001） （圖1F、1H）和TNF- （ P = 0 . 0 1 0 ， P =

0.019）的水平均顯著低于TNBS組（圖1G、1I）。

2.2AFZ對TNBS小鼠腸屏障功能的影響

腸屏障通透性分析顯示，AFZ治療后顯著改善了TNBS誘導小鼠腸屏障通透性，表現(xiàn)為血清中FD4（ P lt; 0.001）（圖2A）和I-FABP（ P = 0 . 0 1 3 ）（圖2B）水平均顯著降低，結(jié)腸組織電阻抗顯著升高（ P = 0 . 0 0 1 ）（圖2C），從腸道移位至腸系膜淋巴結(jié)（ P lt; 0 . 0 0 1 ）（圖2D）、脾臟（ P lt; 0 . 0 0 1 ）（圖2E）和肝臟（ P lt; 0.001）（圖2F）細菌比例均顯著下降。免疫熒光染色顯示，TNBS組小鼠結(jié)腸組織中ZO1和Claudin1移位且表達水平降低，而其在AFZ組中部分恢復于上皮細胞表面，并且表達有所增多（圖2G）。免疫印跡結(jié)果顯示，ZO1（ P = 0 . 0 0 5 ）和Claudin1（ P = 0 . 0 2 4 ）在AFZ組腸黏膜中的水平均顯著高于TNBS組（圖 2 H～ 2 J ）。

2.3體外探索AFZ 對TNF- 誘導腸上皮細胞腸屏障功能的影響

相較于TNF- 組，Caco-2細胞經(jīng)AFZ治療后FD4水平顯著降低（ P = 0 . 0 1 7 ）（圖3A），TEER值顯著增高（ P = 0 . 0 1 4 ）（圖3B）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，TNF- α 導致Caco-2細胞中ZO1和Claudin1細胞表面上表達減少，而經(jīng)AFZ治療后，ZO1和Claudin1表達增多（圖3C）。免疫印跡檢測顯示，AFZ-C組Caco-2細胞中ZO1（ P=0 . 0 1 4 ）和Claudin1（ P = 0 . 0 0 6 ） 的表達較TNF- 組均顯著升高（圖 3 D～ 3 F ）。

4-Plt;0.001 15Plt;0.001 WT TNBS AFZ Plt;0.001 Plt;0.001 EAH T 2 1 0 5 1 -2 0 0 M 公 S AFZ 公 P 2 AFZ 公 A B C D 5Plt;0.001 Plt;0.001 - 9-Plt;0.001 H E 茶 P=0.002 Plt;0.001 P=0.010 Plt;0.001 P=0.019 8 6 工 工 T 4 3 工 0 0 0 W WT 7 5 1 WT B S FZ WT 5 E WT S F 1 F 7 Y Y Y E F G H I

WT：野生型小鼠；TNBS：2，4，6-三硝基苯磺酸誘導小鼠；AFZ：阿福豆苷治療2，4，6-三硝基苯磺酸誘導小鼠；IL-6：白細胞介素-6；TNF- ：腫瘤壞死因子-

A.小鼠體重變化；B.小鼠疾病活動指數(shù)評分；C.小鼠結(jié)腸長度；D.小鼠結(jié)腸組織的HE 染色結(jié)果（箭頭指示病變部位）；E.小鼠結(jié)腸組織炎癥評分；F、G.結(jié)腸黏膜組織中IL-6（F）和TNF- α （G）的mRNA表達水平；H、I結(jié)腸黏膜組織中IL-6（H）和TNF-（204號 （I）的蛋白表達水平FD4：異硫氰酸熒光素葡聚糖4；I-FABP：腸型脂肪酸結(jié)合蛋白；TEER：跨上皮電阻；Mr：相對分子質(zhì)量A、B.小鼠血清中FD4（A）和I-FABP（B）水平；C.小鼠結(jié)腸組織的TEER；D＼～F.腸道細菌移位至腸系膜淋巴結(jié)（D）、脾臟（E）和肝臟（F）的陽性率；G.免疫熒光分析閉鎖小帶蛋白1和緊密連接蛋白-1在結(jié)腸黏膜組織中定位與水平；H＼～J.免疫印跡評估結(jié)腸黏膜組織中閉鎖小帶蛋白1和緊密連接蛋白-1的水平

鼠結(jié)腸組織中增多，而在AFZ治療后顯著降低（ P lt; 0.001）（圖4A、4B）。免疫印跡檢測顯示，相較于TNBS組，AFZ組小鼠腸黏膜組織中裂解型半胱氨酸

蛋白酶3（Cleaved-caspase 3，C-caspase3）（ P = 0 . 0 2 8 ）和Bax（ P = 0 . 0 0 4 ）水平均顯著降低，Bcl2（ P = 0.020）水平顯著升高（圖4C＼～4F）。

2.5AFZ在體外對TNF- 誘導腸上皮細胞凋亡的 影響

Tunel染色結(jié)果顯示，相較于TNF- 組，Tunel陽性細胞數(shù)量在AFZ治療后顯著降低（ P = 0 . 0 1 3 ）（圖5A、5B）。免疫印跡檢測顯示，C-caspase3（ P = 0.004）和Bax（ P = 0 . 0 2 0 ）在AFZ-C組的水平均顯著低于TNF- σ? α?α?α?α -C組，而Bcl2（ P = 0 . 0 0 6 ）水平則顯著高于TNF- 組（圖5C＼～5F）。

2.6AFZ對TNBS小鼠腸上皮細胞線粒體功能的影響

免疫熒光染色顯示，相對于野生型組，TOMM20陽性細胞在TNBS組小鼠結(jié)腸組織中的數(shù)量顯著減少，在AFZ組中的數(shù)量顯著增加（圖6A）。腸黏膜組織中的線粒體經(jīng)AFZ治療后mtDNA的拷貝數(shù)顯著增多（ P = 0.007）（圖6B），線粒體呼吸鏈復合體I（ P = 0 . 0 0 5 ）（圖6C）和V（ ）（圖6D）的活性均明顯增強。

A.小鼠結(jié)腸組織的Tunel染色結(jié)果；B.小鼠結(jié)腸組織中細胞凋亡率；C＼～F.免疫印跡評估結(jié)腸黏膜組織中C-caspase 3、Bax 和 Bel2的水平

2.7探索AFZ在體外對腸上皮細胞線粒體功能的調(diào)控作用

JC-1檢測顯示，相較于對照組，TNF- 組中表達綠色熒光JC-1單體的Caco-2細胞數(shù)量顯著增多，紅色熒光JC-1聚合物的細胞數(shù)量顯著減少，經(jīng)AFZ治療后表達綠色熒光JC-1單體的細胞數(shù)量顯著減少，紅色熒光JC-1聚合物的細胞數(shù)量顯著增多（圖7A）。AFZ-C組較TNF- 組mtDNA拷貝數(shù)顯著增多（ P = 0.032）（圖7B），線粒體呼吸鏈復合體I（ P = 0 . 0 2 5 ）

和IV（ P = 0 . 0 0 3 ）的活性均顯著增強（圖7C、7D）。

2.8驗證AMPK/SIRT1/PGC- 通路在AFZ調(diào)控線粒體功能障礙、腸屏障和腸炎中的作用

免疫印跡檢測顯示，p-AMPK、SIRT1和PGC- 1 α 的水平在TNBS小鼠和TNF- 處理的Caco-2細胞中顯著降低，經(jīng)AFZ治療后得到改善（圖8A、8B）。AFZ組小鼠經(jīng) P G C -1 α 抑制劑（SR-18292）干預后加重腸炎癥狀，表現(xiàn)為體重下降（ P lt; 0 . 0 0 1 ）（圖8C）、DAI評分增高（ P = 0 . 0 2 3 ）（圖8D）、結(jié)腸組織中炎癥細胞的浸潤和炎癥評分升高（ P = 0 . 0 3 1 ）（圖8E、8F），腸黏膜中IL-6（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）、TNF- （ P = 0 . 0 0 2 ，P = 0 . 0 0 3 ）的mRNA和蛋白表達水平均顯著增加（圖8G＼～8J）。腸屏障通透性分析顯示，SR-18292干預后小鼠血清中FD4（ ）和I-FABP（ ）水平均顯著升高（圖8K、8L），結(jié)腸組織電阻抗顯著降低（ P = 0 . 0 1 2 ）（圖8M）。AFZ-C組的Caco-2經(jīng)SR-18292干預后，綠色熒光JC-1單體的細胞數(shù)量顯著增多，紅色熒光JC-1聚合物的細胞數(shù)量顯著減少（圖8N），mtDNA拷貝數(shù)顯著降低（ P = 0 . 0 2 4 （圖80），線粒體呼吸鏈復合體I（ P = 0 . 0 0 8 ）和 I V （ P = 0 . 0 1 3 ）的活性均顯著減弱（圖8P、8Q），SR-18292組中C-caspase3（ P = 0 . 0 1 9 ）和Bax（ P = 0 . 0 1 3 ）的水平均顯著升高，而Bcl2（ P = 0 . 0 4 0 ）的水平則顯著降低（圖8R、8S）。

3討論

腸上皮細胞線粒體功能障礙會導致細胞凋亡增加和腸道屏障功能受損，使腸黏膜阻擋有害物質(zhì)的能力下降并引發(fā)腸道炎癥反應。本研究顯示AFZ至少在一定程度上通過激活AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 通路，緩解線粒體功能障礙和抗腸上皮細胞凋亡，進而改善腸屏障受損和實驗性結(jié)腸炎。

TNBS誘導的小鼠模型是研究CD的常用實驗模型[10]，本研究顯示AFZ能顯著改善實驗性結(jié)腸炎。首先，AFZ可改善小鼠實驗性結(jié)腸炎的臨床癥狀，表現(xiàn)為體重減輕和DAI評分均有所改善。其次，組織病理學檢查顯示，AFZ治療減少了炎癥細胞的浸潤、黏膜層和隱窩的破壞及炎癥評分。炎癥因素對腸黏膜的刺激會導致炎癥調(diào)節(jié)信號通路的異常激活，進而促進促炎細胞因子的釋放，AFZ在TNBS誘導的小鼠顯著降低IL-6和TNF- 的水平。腸道屏障功能的破壞是CD的一個公認特征[3]，本研究顯示AFZ能改善腸道屏障的通透性、結(jié)腸TEER和細菌移位，而且緊密連接蛋白不僅表達水平升高，而且部分回到上皮細胞表面。本研究提示，AFZ能保護腸道屏障功能不受破壞和改善腸炎。

腸上皮細胞通過形成細胞連接、分泌黏液、調(diào)節(jié)免疫反應、吸收營養(yǎng)和分泌抗菌物質(zhì)，在建立和維護腸道屏障方面發(fā)揮著不可替代的作用[4]。腸上皮細胞過度凋亡或持續(xù)死亡會造成腸黏膜損傷和潰瘍，從而損害腸道屏障功能，引發(fā)細菌、毒素和其他物質(zhì)穿過腸黏膜，引起腸道炎癥反應[4]。在CD患者、TNBS誘導的結(jié)腸炎模型和TNF- 誘導的Caco-2中觀察到腸道上皮細胞凋亡，但AFZ治療可顯著抑制腸道上皮細胞凋亡，表現(xiàn)為凋亡細胞比例下降和凋亡調(diào)節(jié)通路受到抑制[18-19]。為分析腸上皮細胞凋亡的機制，本研究分析了AFZ對線粒體功能的影響，因為線粒體在維持細胞存活和死亡之間的平衡方面發(fā)揮著重要作用。有研究顯示在CD患者的結(jié)腸上皮細胞中，線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，線粒體呼吸鏈復合物的活性明顯不足，本研究在TNBS小鼠中也觀察到了同樣的情況。本研究AFZ治療緩解了腸上皮細胞的線粒體功能障礙，這與Lee等研究肝衰竭的結(jié)果相似，AFZ可改善肝細胞的線粒體功能障礙。此外，在炎癥誘導的腸上皮細胞中也觀察到同樣的結(jié)果，但潛在的調(diào)控機制仍有待進一步研究。

P G C - 1α 是線粒體生物生成和功能的調(diào)節(jié)因子，在 CD 患者和 TNBS小鼠的結(jié)腸樣本中明顯減少[20]此外， P G C -1 α 的完全激活需要AMPK磷酸化和SIRT1去乙?；?，而AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 途徑在調(diào)節(jié)線粒體功能中起著關(guān)鍵作用[21-23]。AMPK 是細胞內(nèi)能量傳感蛋白激酶，在細胞能量代謝中發(fā)揮著重要作用。在對炎癥性腸病的研究中，AMPK信號可調(diào)控細胞凋亡、屏障功能障礙和腸黏膜炎癥等生物過程[24]。SIRT1是一種依賴于 的去乙?；福湟阴；{(diào)控涉及多種重要的生物功能，包括能量代謝、細胞衰老、DNA 修復、炎癥調(diào)控和細胞周期調(diào)控[23]。本研究顯示，AFZ能激活AMPK/SIRT1/PGC- 通路，AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 的激活參與了AFZ介導的對TNF- 誘導的腸上皮細胞線粒體功能障礙和細胞凋亡的保護，這與Han等[25]在腸上皮細胞和 X u 等[22]在神經(jīng)細胞中的研究結(jié)果一致。

目前，治療CD的傳統(tǒng)藥物具有不同程度的不良反應和耐受性。AFZ是一種從魚腥草中提取的安全無毒的黃酮醇苷，可作為臨床治療CD的首選藥物。此外，AFN具有抗菌、抗炎和保護肝損傷等作用，本研究拓展了其可能的應用領(lǐng)域。

本研究存在一定的局限性：（1）雖然本研究側(cè)重于腸道上皮細胞，但其他細胞（如免疫細胞、神經(jīng)細胞等）也會對腸道上皮細胞產(chǎn)生影響；（2）AFZ具有多種生物學功能，但本研究只評估了其對線粒體功能障礙和抗凋亡的改善作用；（3）AFZ改善線粒體功能和抗凋亡的保護作用可能有多種途徑，本研究只驗證了AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 信號通路。

綜上，本研究表明AFZ可保護腸上皮細胞免受炎

AMPK：腺苷酸活化蛋白激酶；SIRT1：沉默調(diào)節(jié)蛋白1； P G C - 1α ：過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 輔激活子 1 α A、B.免疫印跡檢測小鼠腸黏膜（A）和Caco-2細胞（B）中AMPK/SIRT1/PGC-1α通路相關(guān)蛋白的表達；C.小鼠體重變化；D.小鼠疾病活動指數(shù)；E.小鼠結(jié)腸組織的HE染色結(jié)果；F.小鼠結(jié)腸組織炎癥評分；G、H.結(jié)腸黏膜組織中IL-6（G）和TNF- （H）的mRNA表達水平；I、J.結(jié)腸黏膜組織中IL-6（I）和TNF- （J）的蛋白表達水平；K、L.小鼠血清中FD4（K）和I-FABP（L）水平；M.小鼠結(jié)腸組織的TEER；N.JC-1染色檢測 Caco-2中線粒體膜電位；O.Caco-2細胞中線粒體 mtDNA的表達；P、Q.線粒體呼吸鏈復合體I（P）和IV（Q）的活性；R、S.免疫印跡檢測Caco-2細胞中調(diào)亡相關(guān)蛋白的表達圖8驗證AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 通路是否參與阿福豆苷對線粒體功能障礙、腸屏障和腸炎的調(diào)節(jié)作用

癥誘導的線粒體功能障礙和細胞凋亡，從而改善TNBS誘導的腸屏障功能障礙和實驗性結(jié)腸炎，而這至少部分與AMPK/SIRT1/PGC- 1 α 信號通路的激活有關(guān)。利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明耿志軍、殷麗霞：開展實驗、數(shù)據(jù)分析和論文撰寫；牛民主、楊晶晶、張小鳳：協(xié)助開展實驗和數(shù)據(jù)分析；李靜：修改論文和提供基金支持

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（收稿日期：2024-04-15）