摘要：目的探討生地黃提取物（RRE）調(diào)控 m i R - 4 8 5 - 5 p / 熱休克蛋白90β家族成員1（ H s p 9 0 b l ）軸對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響。方法將新西蘭兔隨機(jī)分為對(duì)照組、KOA組、RRE 低劑量組、RRE中劑量組、RRE 高劑量組、塞來(lái)昔布組、RRE高劑量 + 拮抗劑對(duì)照組、RRE高劑量 拮抗劑組，每組12只。除對(duì)照組外，其他組兔均按照改良Hulth法構(gòu)建KOA兔模型，建模8周后持續(xù)給藥處理4周。檢測(cè)兔活動(dòng)評(píng)分的變化，ELISA檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子 （TNF- ）、白細(xì)胞介素（IL）-6水平，番紅O-固綠染色檢測(cè)軟骨組織病理變化并進(jìn)行Mankin評(píng)分，TUNEL染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)軟骨組織中miR-485-5p表達(dá)，Westerm blot檢測(cè)軟骨組織中 H s p 9 0 b l 、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、Bcl2相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-485-5p與 H s p 9 0 b l 的關(guān)系。結(jié)果與對(duì)照組比較，KOA組miR-485-5p表達(dá)顯著降低，血清中TNF- 、IL-6水平均顯著升高，軟骨組織表現(xiàn)出明顯的軟骨侵蝕和丟失，活動(dòng)評(píng)分、Mankin評(píng)分、軟骨細(xì)胞凋亡率及 H s p 9 0 b l 、活化的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)均顯著升高（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）。與KOA組比較，RRE低劑量組、RRE中劑量組、RRE高劑量組、塞來(lái)昔布組miR-485-5p表達(dá)均顯著升高，血清中TNF- α 、IL-6水平均顯著降低，軟骨組織病理?yè)p傷減輕，活動(dòng)評(píng)分、Mankin評(píng)分、軟骨細(xì)胞凋亡率及 H s p 9 0 b l 、活化的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)均顯著降低（ P 均 lt; 0 . 0 5 ）。與RRE高劑量組、RRE高劑量 + 拮抗劑對(duì)照組比較，RRE高劑量 拮抗劑組 m i R - 4 8 5 - 5 p 表達(dá)均顯著降低，血清中TNF- α 、IL-6水平均顯著升高，軟骨組織病理?yè)p傷加劇，活動(dòng)評(píng)分、Mankin評(píng)分、軟骨細(xì)胞凋亡率及 H s p 9 0 b l 、活化的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)均顯著升高（ P 均 lt; 0 . 0 5 ）， m i R - 4 8 5 - 5 p 與 H s p 9 0 b l 存在靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)論RRE可能通過(guò)上調(diào) m i R -4 8 5-5 p 抑制 H s p 9 0 b l 表達(dá)，進(jìn)而抑制KOA兔軟骨細(xì)胞凋亡。

楊彬1，王上增23，楊順，許俊杰3，陶廣義河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院） 1疼痛科2關(guān)節(jié)病科，鄭州4500533河南中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院，鄭州450046

通信作者：王上增電話：0371-60908724，電子郵件：wangsz74@163.com

關(guān)鍵詞：生地黃提取物； m i R - 4 8 5 - 5 p ；熱休克蛋白 9 0 β 家族成員1；膝骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；凋亡中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-503X（2025）02-0198-09DOI：10.3881/j. issn.1000-503X.16163

Effect of Rehmanniae Radix Extract on Chondrocyte Apoptosis in the Rabbit Model of Knee Osteoarthritis

YANG Bin1，WANG Shangzeng2，3，YANG Shun'， XU Junjie ， TAO Guangyi3 Department of Pain， Department of Arthropathy，Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine （the Second Afliated Hospital of Henan Universityof Chinese Medicine），Zhengzhou 45Oo53，China （20 School of Osteopathy，Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 45O046，China

Correspondingauthor：WANG Shangzeng Tel：0371-60908724，E-mail：wangsz74@163.com

ABSTRACT： ObjectiveTo explore the efect of rehmanniae radix extract （RRE） on chondrocyte apoptosis in the rabit model of knee osteoarthritis （KOA）by regulating the miR-485-5p/heat shock protein 90 beta family member1（ H s p 9 0 b l ）axis.MethodsNew Zealand rabbits were randomly assigned into control，KOA， low- dose RRE，medium-dose RRE，high-dose RRE，celecoxib，high-dose RRE + antagonist control，and high-dose RRE + miR-485-5p antagonist groups， with 12 rabbits in each group. Rabbits in other groups except the control group were modeled for KOA with the improved Hulth method.After modeling for8 weeks，therabbits wereadministrated with coresponding agents for 4 weeks.The changes in the activityrating of rabbits were recorded.ELISA was employed to measure the levels of tumor necrosis factor- α （TNF- α ）and interleukin（IL）-6 in the serum.Safranine O-fast green staining was conducted to reveal the pathological changes in the cartilage tissue and Mankin scoring was performed. TUNEL was employed to detect chondrocyte apoptosis. Real-time fluorescence quantitative PCR was performed to determine the expressionof miR-485-5p inthe cartilage tissue.Western blot was employed to determine the protein levels of Hsp9Ob1，cleaved cysteinyl aspartate-specific proteinase-3 （Caspase-3），and Bcl2-assciated-X （Bax） in the cartilage tissue. The dual-luciferase reporter assy was employed to examine the relationship between miR-485-5p and Hsp9Ob1.ResultsCompared with the control group，the KOA group showed down-regulated expresson of miR-485-5p，elevated levels of TNF- α and IL-6 in the serum，cartilage erosion and losses，and increases in activity rating，Mankin score，chondrocyte apoptosis rate，and proteinlevelsofHsp9Ob1，cleaved Caspase-3，and Bax（all P lt; 0 . 0 0 1 ）．Compared with the KOA group，RRE at low，medium，and high doses，and celecoxib up-regulated the expresion of miR-485-5p，lowered the levels of TNF- α and IL-6 in the serum，alleviated the pathological damage to the cartilage tissue，and decreased the activity rating，Mankin score，chondrocyte apoptosisrate，and protein levelsof Hsp90b1， cleaved Caspase-3，and Bax（all P lt; 0 . 0 5 ）.Compared with the high-dose RRE group and the high-dose RRE + （204號(hào) antagonist control group，high-dose RRE + miR-485-5p antagonist down-regulated the expression of miR-485- ，elevated the levels of TNF- α and IL-6 in the serum，exacerbated the pathological damage to the cartilage tissue，and increased the activity rating，Mankin score，chondrocyte apoptosisrate，and protein levels of Hsp90b1， cleaved Caspase-3，and Bax （all P lt; 0 . 0 5 ）.The results indicated that there was a targeted regulatory relationship between miR-485-5p and Hsp90b1. ConclusionRRE may inhibit the expresion of Hsp90b1 by up-regulating miR-485-5p，thereby inhibiting chondrocyte apoptosis in the rabbit model of KOA.

KeyWords：rehmaniaeradix extract；miR-485-5p；heatshockprotein90betafamilymember1；kneeosteoarthritis；chondrocyte；apoptosis

ActaAcadMedSin，2025，47（2）：198-206

膝骨關(guān)節(jié)炎（kneeosteoarthritis，KOA）是一種慢性進(jìn)行性疾病，以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹甚至畸形為主要臨床表現(xiàn)[1]。目前KOA的治療方法包括口服和外用非甾體抗炎藥、曲馬多以及外用辣椒素，盡管這些藥物可以緩解相應(yīng)的癥狀，但這些藥物會(huì)引起一系列的不良反應(yīng)，如增加胃潰瘍和皮下黏膜出血的風(fēng)險(xiǎn)[2]此外，大量研究表明，在KOA的進(jìn)展過(guò)程中，關(guān)節(jié)軟骨表現(xiàn)出較高的細(xì)胞凋亡率[3]。因此，開(kāi)發(fā)更安全、更有效的藥物抑制軟骨細(xì)胞凋亡對(duì)改善KOA意義重大。生地黃提取物（rehmanniaeradixextract，RRE）是從玄參科植物地黃的塊根提取而來(lái)，具有抗氧化、抗炎等特性[4]。有報(bào)道地黃提取物可改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨病理?yè)p傷[5]，表明地黃提取物可對(duì)骨組織發(fā)揮保護(hù)作用。但RRE能否通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞凋亡對(duì)KOA兔軟骨發(fā)揮保護(hù)作用尚不可知。研究顯示，巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-485-5p后，其分泌炎性因子減少，進(jìn)而可抑制關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[6]。熱休克蛋白90β家族成員1（heatshock protein 9Obeta familymember1，H s p 9 0 b l ）又名GRP94，其在實(shí)驗(yàn)性誘發(fā)的骨關(guān)節(jié)炎馬外周白細(xì)胞中高表達(dá)[7]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-4 8 5 - 5 p 與 H s p 9 0 b l 存在靶向關(guān)系，但RRE能否通過(guò)調(diào)控 m i R - 4 8 5 - 5 p / H s p 9 0 b l 軸抑制KOA兔軟骨細(xì)胞凋亡尚不清楚。因此，本研究主要探討RRE對(duì)KOA兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響及其作用的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

96只SPF級(jí)雄性新西蘭兔購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2022-0003，6月齡，體重 2 . 2 ～ 2 . 4 k g ，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)，

使用許可證號(hào)SYXK（豫）2021-0015。本研究獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審批（倫理審查編號(hào)：IACUC-202302039）。

1.2 主要試劑

RRE（生地黃塊根的乙醇提取物主要成分為地黃苷、 β -谷甾醇、梓醇、菜油甾醇等，批號(hào)YYR-008）購(gòu)自陜西永源生物技術(shù)有限公司，塞來(lái)昔布購(gòu)自默克化工技術(shù)（上海）有限公司，miR-485-5p拮抗劑及其陰性對(duì)照購(gòu)自安必奇生物科技有限公司，兔腫瘤壞死因子 α （tumor necrosis factor- α ，TNF- α ）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6ELISA試劑盒均購(gòu)自依科賽生物科技有限公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，一抗 H s p 9 0 b l 、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinylaspartate-specificproteinase-3，Caspase-3）、Bcl2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associatedX，Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glycer-aldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）及二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3KOA兔模型的構(gòu)建

通過(guò)改良Hulth法構(gòu)建KOA兔模型：耳緣靜脈注射 3 0 m g / k g 戊巴比妥納麻醉兔，切開(kāi)兔右膝鯙腱內(nèi)側(cè)的關(guān)節(jié)囊，再利用顯微外科剪刀切除內(nèi)側(cè)半月板、內(nèi)側(cè)副韌帶前及交叉韌帶[8]

1.4 動(dòng)物分組及處理

將96只新西蘭兔隨機(jī)分為對(duì)照組、KOA組、RRE低劑量組、RRE中劑量組、RRE高劑量組、塞來(lái)昔布組、RRE高劑量 + 拮抗劑對(duì)照組、RRE高劑量 + miR-485-5p拮抗劑組，每組12只。對(duì)照組兔僅切開(kāi)右膝關(guān)節(jié)，暴露但不切除韌帶與半月板。除對(duì)照組外，其他組兔均按照改良Hulth法構(gòu)建KOA兔模型，建模8周后，進(jìn)行給藥處理，RRE低、中、高劑量組兔分別需灌胃8.33、16.66、 3 3 . 3 2 m g / m L RRE（灌胄體積 0 . 2 m L ）[9]，且均需尾靜脈注射等體積的生理鹽水；塞來(lái)昔布組兔需灌胃 塞來(lái)昔布[10]，且還需尾靜脈注射等體積的生理鹽水；RRE高劑量 + 拮抗劑對(duì)照組兔需灌胃 3 3 . 3 2 m g / m L RRE（灌胃體積 0 . 2 m L ），且還需尾靜脈注射 0 . 4 2 n g / 次antagomirNC；RRE高劑量 拮抗劑組[兔需灌胃 3 3 . 3 2 m g / m L RRE（灌胃體積 0 . 2 m L ），且還需尾靜脈注射 0 . 4 2 n g / 次miR-485-5p antagomir；對(duì)照組、KOA組兔均需灌胃且尾靜脈注射等量的生理鹽水。藥物antagomir NC、miR-485-5pantagomir的給藥頻次為每周1次，其他藥物均為每天1次，持續(xù)給藥4周。

1. 5 兔活動(dòng)評(píng)分的檢測(cè)

末次處理結(jié)束后，觀察兔步行情況，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)分：0分表示步態(tài)正常，1分表示步態(tài)呈輕度跛行，2分表示步態(tài)呈中度跛行。

1. 6 標(biāo)本收集

耳緣靜脈注射 3 0 m g / k g 戊巴比妥納麻醉兔，收集兔靜脈血液，離心后血清用于ELISA檢測(cè)。血清收集完畢后，處死兔，收集兔右膝關(guān)節(jié)軟骨組織，分為兩部分（每部分包含每組6只兔的軟骨組織），一部分固定于 4 % 多聚甲醛中用于番紅O-固綠染色和TUNEL染色，一部分保存于 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot實(shí)驗(yàn)。

1. 7 ELISA檢測(cè)兔血清中TNF- 、IL-6水平

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)兔血清中TNF- 、IL-6水平。

1.8番紅O-固綠染色檢測(cè)兔軟骨組織病理變化

將 4 % 多聚甲醛固定的兔右膝關(guān)節(jié)軟骨組織用EDTA脫鈣并包埋在石蠟中。將關(guān)節(jié)軟骨切成 的切片，用番紅O-固綠染色，并參考Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]對(duì)兔軟骨組織進(jìn)行病理評(píng)分，Mankin評(píng)分越高，表明KOA越嚴(yán)重。

1.9TUNEL染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡

取石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)后，再加入TUNEL反應(yīng)混合物孵育 1 . 5 h 。用 ，6-二基-2-苯基吲哚對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色 1 5 m i n 后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞凋亡情況。

1.10實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)軟骨組織中miR-485-5p的表達(dá)

使用TRIzol試劑提取軟骨組織勻漿總蛋白，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以U6為內(nèi)參，通過(guò) 法計(jì)算 相對(duì)表達(dá)量。引物序列為：miR-485-5p正向引物： -TGCGCTCAGCAAACATTTATTG-3’，反向引物： 1TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6正向引物： 5 % CTCGCT-TCGGCAGCACA-3'，反向引物： -AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3'。

1.11Western blot檢測(cè)軟骨組織中 H s p 9 0 b 1 、活化的Caspase-3、Bax的蛋白表達(dá)

使用放射性免疫沉淀測(cè)定裂解液提取軟骨組織總蛋白，將蛋白質(zhì)經(jīng)定量、電泳分離、轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜、 5 % 脫脂牛奶封閉后，將膜在 下與一抗H s p 9 0 b l （1：4000）、活化的Caspase-3（1：5000）、Bax（1：5000）、GAPDH（1：3000）一起孵育過(guò)夜，再與二抗共同孵育 1 . 5 h 。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑觀察蛋白印跡。蛋白成像系統(tǒng)用于捕獲蛋白表達(dá)的圖像。

1.12 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

分別構(gòu)建 H s p 9 0 b l 突變型質(zhì)粒Hsp90b1-MUT和野生型質(zhì)粒Hsp90b1-WT，將Hsp90b1-WT和Hsp90b1-MUT分別與模擬物對(duì)照或miR-485-5p模擬物共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞， 后，觀察熒光素酶活性變化

1. 13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS27.0和GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以Shapiro-Wilk法對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)Levene檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間的比較采用SNK- q 檢驗(yàn);兔活動(dòng)評(píng)分為計(jì)數(shù)資料，以有序多分類變量的形式表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗(yàn)，總體有差異進(jìn)一步通過(guò)Nemenyi法進(jìn)行多重比較。雙側(cè)P lt; 0 . 0 5 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RRE對(duì)兔活動(dòng)評(píng)分的影響

與對(duì)照組比較，KOA組兔活動(dòng)評(píng)分顯著升高（ P lt; 0.001）；與KOA組比較，RRE低劑量組（ P = 0 . 0 3 7 ）、RRE中劑量組（ P = 0 . 0 1 4 ）、RRE高劑量組（ P lt; 0.001）、塞來(lái)昔布組（ P lt; 0 . 0 0 1 ）兔活動(dòng)評(píng)分均顯著降低；與RRE高劑量組、RRE高劑量 + 拮抗劑對(duì)照組比較，RRE高劑量 拮抗劑組兔活動(dòng)評(píng)分均顯著升高（ P 均 = 0 . 0 4 5 ）（表1）。

2.2 RRE對(duì)兔血清中 T N F -αα 、IL-6水平變化的影響

與對(duì)照組比較，KOA組兔血清中TNF- 、IL-6水平均顯著升高（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）；與KOA組比較，RRE低劑量組、RRE中劑量組、RRE高劑量組、塞來(lái)昔布組兔血清中TNF- 、IL-6水平均顯著降低（ P 均 lt; 0.001）；與RRE高劑量組、RRE高劑量 + 拮抗劑對(duì)照組比較，RRE高劑量 拮抗劑組兔血清中TNF- 、IL-6水平均顯著升高（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）（表2）。

2.3RRE對(duì)兔軟骨組織病理變化的影響

對(duì)照組兔軟骨組織結(jié)構(gòu)完整，表面光滑；KOA組兔軟骨組織表現(xiàn)出明顯的軟骨侵蝕和丟失；與對(duì)照組比較，KOA組兔Mankin評(píng)分顯著升高（ P lt; 0 . 0 0 1 ；與KOA組比較，RRE低劑量組、RRE中劑量組、RRE高劑量組、塞來(lái)昔布組兔軟骨組織病理?yè)p傷減輕，Mankin評(píng)分均顯著降低（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）；與RRE高劑量組、RRE高劑量 + 拮抗劑對(duì)照組比較，RRE高劑量 括抗劑組兔軟骨組織病理?yè)p傷加劇，Mankin評(píng)分均顯著升高（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）（圖1、表3）。

2.4RRE對(duì)各組兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，KOA組兔軟骨細(xì)胞凋亡率顯著升高（ P lt; 0 . 0 0 1 ）；與KOA組比較，RRE低劑量組、RRE中劑量組、RRE高劑量組、塞來(lái)昔布組兔軟骨細(xì)胞凋亡率均顯著降低（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）；與RRE高劑量組、RRE高劑量 + 拮抗劑對(duì)照組比較，RRE高劑量 + m i R 485-5p拮抗劑組兔軟骨細(xì)胞凋亡率均顯著升高（ P 均 lt; 0.001）（表4、圖2）。

2.5RRE對(duì)兔軟骨組織中miR-485-5p表達(dá)及 H s p 9 0 b 1 /活化的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，KOA 組兔軟骨組織中 表達(dá)顯著降低， H s p 9 0 b l 、活化的Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)均顯著升高（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）；與KOA組比較，RRE低劑量組、RRE中劑量組、RRE高劑量組、塞來(lái)昔布組兔軟骨組織中 m i R - 4 8 5 - 5 p 表達(dá)均顯著升高，H s p 9 0 b l 、活化的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)均顯著降低（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）；與RRE高劑量組、RRE高劑量 + 拮抗劑對(duì)照組比較，RRE高劑量 拮抗劑組兔軟骨組織中miR-485-5p表達(dá)均顯著降低，H s p 9 0 b 1 、活化的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)均顯著升高（ P 均 lt; 0 . 0 0 1 ）（圖3、表5）。

2.6miR-485-5p靶向調(diào)控 H s p 9 0 b 1

StarBase 網(wǎng)站（https：//rnasysu.com/encori/agoClipRNA.php？）預(yù)測(cè) 與 H s p 9 0 b l 的結(jié)合位點(diǎn)（圖4）。與模擬物對(duì)照和 H s p 9 0 b l - W T 共轉(zhuǎn)染組相比， 模擬物和Hsp90b1-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（ 0 . 3 6 ± 0 . 0 2 比 1 . 0 2 ± 0 . 1 1 P lt; 0 . 0 0 1 ）；與模擬物對(duì)照和Hsp90b1-MUT共轉(zhuǎn)染組相比， m i R - 4 8 5 - 5 p 模擬物和 H s p 9 0 b l -MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 1 . 2 1 ± 0 . 1 6 比 1 . 0 5 ± 0.14， P = 0 . 0 9 5 ）。

3討論

代生活方式變化的推動(dòng)下，KOA成為影響全球中老年人口的主要健康威脅之一[13]。由于 KOA病因復(fù)雜，病變部位廣泛，KOA的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[14]。因此，探索KOA的發(fā)病機(jī)制，尋求方便、有效、經(jīng)濟(jì)的治療方法，緩解KOA帶來(lái)的健康危機(jī)具有重要意義。KOA受多種致病因素的影響，其中炎癥被KOA是一種常見(jiàn)的臨床疾病，在人口老齡化和現(xiàn)認(rèn)為是KOA發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，炎癥因子水平升高與KOA進(jìn)展密切相關(guān)[15]；有報(bào)道顯示，在KOA的病理?xiàng)l件下，軟骨細(xì)胞過(guò)度表達(dá)炎癥因子，如IL-16、TNF- α ，可以加速軟骨退化[16]。此外，軟骨細(xì)胞作為軟骨組織的主要成分，對(duì)于維持軟骨健康和功能完整性至關(guān)重要，軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡通常伴隨著軟骨變性[17]。本研究通過(guò)改良Hulth 法構(gòu)建KOA兔模型，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，KOA組兔活動(dòng)評(píng)分顯著升高，軟骨組織表現(xiàn)出明顯的軟骨侵蝕和丟失且Mankin評(píng)分升高，提示KOA模型兔構(gòu)建成功。此外，本研究顯示，與對(duì)照組相比，KOA組兔血清中TNF- 、IL-6水平顯著升高，軟骨細(xì)胞凋亡率及軟骨組織中凋亡相關(guān)蛋白活化的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，表明KOA兔存在炎癥反應(yīng)及軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡。因此，抑制炎癥反應(yīng)及軟骨細(xì)胞凋亡可能成為治療KOA的有效策略之一。

RRE是由地黃的塊根提取而來(lái)，具有抗氧化、保護(hù)血管、抗炎等作用[18]。目前關(guān)于其對(duì)KOA的影響研究較少。本研究顯示，RRE可呈劑量依賴性地抑制KOA兔炎癥反應(yīng)及軟骨細(xì)胞凋亡。塞來(lái)昔布是臨床上常用于治療KOA的藥物[19]，本研究設(shè)置該藥物為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示塞來(lái)昔布與高劑量RRE對(duì)KOA兔炎癥反應(yīng)及軟骨細(xì)胞凋亡的抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示RRE可能成為治療KOA的潛在有效藥物之一。

近年，有研究顯示中藥提取物可通過(guò)調(diào)控miRNA表達(dá)延緩關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。如蒲公英提取物可通過(guò)促進(jìn)miR-708-5p表達(dá)抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)而延緩類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[20]，松節(jié)方提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-320有效改善骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨退變，并減少細(xì)胞凋亡[21]。本研究顯示，RRE可呈劑量依賴性地上調(diào)KOA兔軟骨組織中miR-485-5p表達(dá)，并抑制KOA兔炎癥反應(yīng)及軟骨細(xì)胞凋亡。推測(cè)RRE可能通過(guò)上調(diào)miR-485-5p表達(dá)抑制KOA兔炎癥反應(yīng)及軟骨細(xì)胞凋亡。為驗(yàn)證該猜想，本研究在高劑量RRE處理的基礎(chǔ)上再加上miR-485-5p拮抗劑干預(yù)KOA兔，結(jié)果顯示miR-485-5p拮抗劑逆轉(zhuǎn)了高劑量RRE處理對(duì)KOA兔炎癥反應(yīng)及軟骨細(xì)胞凋亡的抑制作用，證實(shí)了猜測(cè)的合理性。

有研究表明miR-485-5p可通過(guò)靶向多種基因發(fā)揮其生物學(xué)作用[22]。為進(jìn)一步探究RRE 通過(guò)上調(diào) miR-4 8 5 - 5 p 表達(dá)抑制KOA兔炎癥反應(yīng)及軟骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了 H s p 9 0 b 1 為 m i R - 4 8 5 - 5 p 的靶基因。 H s p 9 0 b l 作為HSP90的旁系同源物，已有研究顯示其在人骨肉瘤組織中高表達(dá)，可作為判斷惡性程度的重要指標(biāo)[23]。本研究顯示，RRE可呈劑量依賴性地上調(diào)KOA兔軟骨組織中miR-485-5p表達(dá)，下調(diào) H s p 9 0 b l 蛋白表達(dá)，且miR-485-5p拮抗劑逆轉(zhuǎn)了高劑量RRE處理對(duì)KOA兔軟骨組織中 蛋白表達(dá)的抑制作用，證實(shí)了RRE可能通過(guò)調(diào)控 m i R - 4 8 5 - 5 p / H s p 9 0 b l 軸抑制KOA兔軟骨細(xì)胞凋亡。

綜上，RRE可能通過(guò)上調(diào)miR-485-5p抑制Hsp90b1表達(dá)，進(jìn)而抑制KOA兔軟骨細(xì)胞凋亡。但是，未進(jìn)一步觀察上調(diào) H s p 9 0 b l 是否逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)KOA兔軟骨細(xì)胞凋亡是本研究的局限性，這將是本研究后續(xù)研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。

利益沖突 所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明楊彬：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究、數(shù)據(jù)收集及撰寫論文；王上增：研究構(gòu)思、數(shù)據(jù)分析、論文修改及質(zhì)量控制；楊順：實(shí)施設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及論文修改；許俊杰、陶廣義：數(shù)據(jù)收集、分析及論文修改

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（收稿日期：2024-05-10）