中圖分類號(hào)：0561.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-1038（2025）04-0035-06

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2025.04.006

Study on Heterologous Expression of Glucose Isomerase from Pantoea dispersa of Kiwifruit Root Origin

ZHI Yong， XIA Bo* （College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410o00， China）

Abstract：Toaddressthelimitations of traditionalhigh-fructose syrup production，such as lowcatalytic efficiencyof conventional glucose isomerases，this study focused on the heterologous expressionand optimization of a novel glucose isomerase， P d -xylA， derived from Pantoea dispersa isolated from kiwifruit roots. The P d. -xylA gene was cloned and expressed in Escherichia coli BL21 （DE3），folowed by systematic optimization of induction conditions including temperature and IPTG （isopropyl- β D -thiogalactopyranoside） concentration. The results demonstrated that the optimal induction conditions were and 0.1 mmol/L IPTG， under which P d？ -xylA achieved the highest soluble expressonlevel.This study provided theoretical support for the development of enzyme resources with enhanced catalytic activity and industrial applicability， thereby advancing the biotechnological productionof

high-fructose syrup.

Keywords： Pantoea dispersa； glucose isomerase； optimization of induction conditions； heterologous expression

在食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域，隨著消費(fèi)者對(duì)甜味產(chǎn)品需求的不斷增長(zhǎng)，甜味劑的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。果葡糖漿（high fructose corm syrup，HFCs）甜度高、溶解性良好、穩(wěn)定性強(qiáng)，生產(chǎn)成本較低，已成為重要的糖類替代品，廣泛應(yīng)用于飲料、糖果、烘焙食品等多個(gè)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)蔗糖相比，果葡糖漿在低溫環(huán)境下不易結(jié)晶，且具有更高的甜味，備受食品生產(chǎn)企業(yè)的青睞。果葡糖漿按照果糖含量的不同，可分為HFCS-42、HFCS-55和HFCS-90等幾種類型，分別含有 42%55% 和 90% 的果糖，用途各異[2-4]。

果葡糖漿的生產(chǎn)依賴于葡萄糖異構(gòu)酶（glucoseisomerase，GI），GI 又稱為木糖異構(gòu)酶（xylose isomerase，xylA），能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為果糖，是果葡糖漿生產(chǎn)過程中的核心催化劑。目前，果葡糖漿的生產(chǎn)主要通過微生物酶轉(zhuǎn)化法完成，主要來(lái)源是微生物，尤其是嗜熱或嗜堿的細(xì)菌和放線菌。這種方法不僅成本較低，而且減少了酸水解法生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，具有較好的環(huán)境友好性。葡萄糖異構(gòu)酶的獲得方法有天然菌株發(fā)酵生產(chǎn)、異源表達(dá)。然而，葡萄糖異構(gòu)酶的表達(dá)效率并不高，這成為果葡糖漿工業(yè)化生產(chǎn)中的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸之一[6-10]。

在食品工業(yè)中，開發(fā)微生物酶具有重要意義。研究表明分散泛菌體內(nèi)包含蔗糖異構(gòu)酶以及參與類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化的相關(guān)酶系，可為不同酶系在食品加工中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，對(duì)分散泛菌體內(nèi)其他類型酶資源的挖掘也值得研究。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期從獼猴桃根部篩選出的分散泛菌（Pantoeadispersa）為研究對(duì)象，成功克隆了其葡萄糖異構(gòu)酶基因（Pd-xylA），并在大腸桿菌BL21（DE3）中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。為了確保該酶的高效生產(chǎn)，本研究系統(tǒng)地優(yōu)化了誘導(dǎo)表達(dá)條件，包括溫度、IPTG濃度等因素；通過對(duì)不同誘導(dǎo)條件的測(cè)試，確定最佳的表達(dá)參數(shù)，以期為葡萄糖異構(gòu)酶的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)，也為果葡糖漿的高效生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)菌蛋白制備裂解液（含PBS），上海生工生物工程股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、pGM-T連接試劑盒、IPTG（ 50mg/mL 氨芐西林鈉鹽 ，天根生化科技有限公司；His標(biāo)簽純化試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司； Tris- 硼酸電泳緩沖液（ 10×TBE） ，雷根生物科技有限公司； ，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；三色預(yù)染蛋白Marker（10-310KD），安諾倫（北京）生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

T100PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)伯樂公司；DYY-600C電泳儀，北京東方瑞利電泳設(shè)備有限公司；HB120-S恒溫金屬浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DUT-486藍(lán)光顯色儀，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；ZQPW70恒溫振蕩培養(yǎng)箱，天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；SPX-250BSH-II恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FA20048分析天平，精度0.0001g ，上海佑科儀器儀表有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；HR-T16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；JY96-IIN超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因克隆

根據(jù) P d. -xylA序列設(shè)計(jì)兩端含酶切位點(diǎn)的引物，以分散泛菌基因組DNA為模板進(jìn)行克隆。正向引物中引入EcorI酶切位點(diǎn)，反向引物中引入 NotI 酶切位點(diǎn)，引物序列表1所示。

PCR反應(yīng)程序： 預(yù)變性 變性 30s ， 退火 30s，72degreeC 延伸 60s ，進(jìn)行30次循環(huán)， 后延伸 5min 。反應(yīng)結(jié)束后取 ${5＼upmu＼mathrm{L}}$ PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2 基因的T/A克隆

1材料與方法

1.1 材料與試劑

分散泛菌，314實(shí)驗(yàn)室 保存；克隆菌株大腸桿菌 DH5α 、表達(dá)菌株

將純化回收的PCR產(chǎn)物通過T4DNA連接酶與pGM-T載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，將PCR產(chǎn)物與pGM-T載體以及T4DNA連接酶裝入離心管，輕輕彈動(dòng)離心管以混合內(nèi)容物，室溫離心 孵育連接

表1引物序列

過夜，反應(yīng)結(jié)束后， 保存?zhèn)溆?，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

1.3.3 質(zhì)粒鑒定

將經(jīng)過雙重篩選得到的白色菌落接種于 1mL LB（Luria-BertaniBroth）液體培養(yǎng)基（含濃度 50μg/mL 氨芐西林）中培養(yǎng)， 搖床振蕩培養(yǎng)過夜，保存菌種后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.3.4表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)提取的質(zhì)粒表達(dá)載體pGBTNH2分別用EcorI和NotI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶在 下酶切 3h C

1.3.5 IPTG誘導(dǎo)

按接種量 3% ，將種子液轉(zhuǎn)接到 15mL 卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng) 4～5h ，直至 為 0.5～0.6 ，加人IPTG至終濃度 誘導(dǎo)表達(dá)過夜，采用SDS-PAGE電泳分析樣品，觀察酶誘導(dǎo)情況，視情況優(yōu)化誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及IPTG濃度）。

1.3.6 誘導(dǎo)溫度條件優(yōu)化

將過夜活化培養(yǎng)的大腸桿菌BL21（DE3）-pGBTNH2-Pd-xylA 按 3% 接種量接種至含 50μg/mL 氨芐青霉素抗生素的LB液體培養(yǎng)基（ 20mL 中， 培養(yǎng)至菌液 為 0.5～0.6 ，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG，于 $16、28、37＼mathrm{～＼textdegreeC}$ 誘導(dǎo)過夜后，取 1mL 誘導(dǎo)后菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.3.7 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化

將過夜活化培養(yǎng)的大腸桿菌BL21 （DE3）-pGBTNH2-Pd-xylA 按 3% 接種量接種至新的含50μg/mL 氨芐青霉素抗生素的LB液體培養(yǎng)基（ 20mL 中， 培養(yǎng)至菌液 約 0.5～0.6 ，分別添加IPTG至終濃度 IPTG，于 誘導(dǎo)過夜后，取 1mL 誘導(dǎo)后菌液進(jìn)行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠）電泳檢測(cè)。

1.3.8 重組酶的純化

按照His標(biāo)簽純化試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。取 4mL P d. -xylA破碎粗酶液與經(jīng)過平衡的 50% BeyoGoldTMHis-tagPurificationResin混勻，在冰浴環(huán)境下，于脫色搖床中緩慢搖動(dòng) 60min ，使得His標(biāo)簽重組蛋白與鎳柱充分結(jié)合。將混合物裝入親和層析柱空柱管中并收集流出液（FT），再用 0.5mL 的非變性洗滌液從柱頭端緩慢滴人，洗滌1次，含有雜蛋白的洗滌液W1收集至離心管中，最后用非變性洗脫液洗柱6次，收集洗脫液（E1～E6）至離心管中。對(duì)得到的各組分收集液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)過程均獨(dú)立重復(fù)至少3次；使用GraphPadPrism9.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理；數(shù)據(jù)以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差” 的形式表示。對(duì)各組進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行新復(fù)極差法多重比較檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1 Pd-xyIA基因的克隆

通過PCR擴(kuò)增獲得 P d-x y l A 基因，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示電泳條帶位置與理論值相符 1323bp ，如圖1所示。

隨后，對(duì)電泳產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，獲取Pd-xylA基因，并將其構(gòu)建至pGEM-T載體中，生成pGEM-T-Pd-xylA克隆載體。該載體隨后被轉(zhuǎn)化至宿主大腸桿菌 DH5α 中，利用藍(lán)白斑篩選法篩選陽(yáng)性克隆，篩選結(jié)果如圖2所示。通過提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，并將其送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blastn工具進(jìn)行核酸序列比對(duì)，結(jié)果表明該序列與序列號(hào)WP_222951480.1的相似度為100% ，由此確認(rèn)Pd-xylA基因已成功克隆。

2.2表達(dá)載體構(gòu)建

首先對(duì)表達(dá)載體pGBTNH2和 P d. -xylA基因片段進(jìn)行雙酶切處理，隨后使用T4連接酶將兩者按 1：3 摩爾比在過夜條件下進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，隨后挑取轉(zhuǎn)化菌株并送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果使用SnapGene軟件進(jìn)行序列比對(duì)，表明載體與基因片段成功連接，如圖3所示，所得序列與 P d. -xylA基因完全匹配，證明了表達(dá)載體pGBTNH2與 P d. -xylA基因片段成功連接。

2.3 蛋白表達(dá)

通過SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示在誘導(dǎo)前后樣品中存在顯著差異。與誘導(dǎo)前樣品相比，誘導(dǎo)后樣品的破碎蛋白上清液在 49kDa 位置出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，而破碎沉淀中的蛋白量顯著少于上清液，如圖4所示。該蛋白條帶與Expasy網(wǎng)站預(yù)測(cè)的 P d -xylA蛋白的理論分子量（ $＼mathrm{49＼kDa}$ ）一致（https：//web.expasy.org/protparam/），表明Pd-xylA蛋白成功以可溶性形式表達(dá)。

2.4誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

由圖5可知，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，蛋白的可溶性表達(dá)逐漸減少。較低溫度有助于蛋白的正確折疊，減少包涵體的形成，但 的低溫環(huán)境會(huì)顯著減緩菌體的生長(zhǎng)速度，如圖5所示。經(jīng)過比較， 被確定為Pd-xylA蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度。在較高溫度下，蛋白折疊速度過快，導(dǎo)致可溶性表達(dá)量減少。誘導(dǎo)溫度不僅影響蛋白的表達(dá)水平，還對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響。研究表明，低溫表達(dá)有助于提高可溶性蛋白的表達(dá)-4，因此，本研究最終選擇 作為Pd-xylA蛋白的最優(yōu)誘導(dǎo)溫度。

2.5 IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化

由圖6可知，隨著IPTG濃度的增加，觀察到的重組Pd-xylA蛋白表達(dá)量并未發(fā)生顯著變化。這可能是由于較高濃度的IPTG對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)IPTG濃度超過聞值時(shí)，菌體生長(zhǎng)減緩，從而導(dǎo)致蛋白表達(dá)量的變化不顯著[15-21]。如圖6所示，當(dāng)IPTG濃度為 0.1mmol/L 時(shí)，蛋白的可溶性表達(dá)量達(dá)到最高。因此，本研究確定0.1mmol/L 為Pd-xylA蛋白表達(dá)的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

M：Marker；1：無(wú)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)； IPTG誘導(dǎo)；3：0.1mmol/LIPTG誘導(dǎo)；4：0.2mmol/LIPTG誘導(dǎo)；5：0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)；6：1mmol/LIPTG誘導(dǎo)；7：5mmol/LIPTG誘導(dǎo)

Fig.6 IPTG concentration optimization

2.6 蛋白純化

根據(jù)Pd-xylA的理論分子量為 49kDa ，圖7所示，經(jīng)過鎳柱純化后，可以看到清晰的單條帶，即為Pd-xylA的純化條帶，這與預(yù)期設(shè)計(jì)的蛋白分子質(zhì)量一致。如圖7所示，Pd-xylA經(jīng)過鎳柱純化后與雜蛋白分離。

M：Marker；E1～E6：含有咪唑的洗脫液洗脫次數(shù)；FT：過柱流穿液；W1：不含咪唑的洗滌液洗柱次數(shù)；CL：細(xì)菌裂解液

3結(jié)論

迄今為止，xylA酶憑借其催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的特性，已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)果葡糖漿的生產(chǎn)。因此，開發(fā)不同來(lái)源的xylA酶用于工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。來(lái)自細(xì)菌的xylA酶在工業(yè)化應(yīng)用中具有生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高等優(yōu)勢(shì)，因而更具應(yīng)用潛力。然而，迄今尚無(wú)關(guān)于來(lái)源于分散泛菌（Pantoeadispersa）的xylA酶在大腸桿菌中表達(dá)條件優(yōu)化的相關(guān)報(bào)道。

本研究成功構(gòu)建了含有Pd-xylA基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，并通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了最佳表達(dá)條件：誘導(dǎo)溫度為 ，IPTG濃度為 0.1mmol/L 在此條件下，成功獲得大量重組Pd-xylA蛋白。該研究為未來(lái)工業(yè)化酶法生產(chǎn)果葡糖漿提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持，對(duì)于加速果葡糖漿在食品、保健品及醫(yī)療領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，并降低相關(guān)應(yīng)用成本具有重要的推動(dòng)作用。

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