中圖分類號:TS262.61 文獻標志碼:A 文章編號:1008-1038(2025)04-0013-10
DOI:10.19590/j.cnki.1008-1038.2025.04.003
Analysis of Volatile Components Changes of ‘ Ziqiu' Grape Wine During Alcoholic Fermentation
SUO Hao'2, WANG Jihui2*, BAI Weibin'* (1.College of Life Science andTechnology,Jinan University, Guangzhou510632, China; 2.School of Life and Health Technology, Dongguan University of Technology, Dongguan 523808, China)
Abstract: Inorder to investigatechanges in flavor substances of‘Ziqiu' grape wine duringalcohol fermentation stage,volatile compounds were analyzed by HS-SPME-GC-MS and GC-IMS, and the diferences of volatile components among fermentation samples were further explored by PCA and PLS-DA. HS-SPME-GC-MS detected 11 volatile components,and 22 volatile components were identified by GC-IMS.The PCA and PLS-DA results showed thattherelative content of volatile substances inthe early stageof fermentation(O-2d)was obviously separatedfromthatinthe middle stage (3-5d)andtheend stage(6-8d),buttherewasnoobvious diference in the middle and end stage of fermentation. According to the VIP score, a total of 5 (VIP gt;1 1) labeled volatile compounds were selected, which were1-hexanol,ethanol,(E)-2-hexenal,(E,E)-24heptadienaland butyric acid.The above results showed that the fruitflavor of winegradualy increasedand the green flavor gradually decreased with the extension of fermentation. This study could provide a theoretical reference for the flavor improvement and optimization of fermentation process of ‘ Ziqiu' grape wine.
Keywords:‘Ziqiu'grape; HS-SPME-GC-MS; GC-IMS; alcoholic fermentation; flavor components; principal component analysis
刺葡萄(VtisdavidiiFoex.)屬于葡萄科葡萄屬東亞種群的一個種,主要分布在我國南部,如湖南、云南、廣東、江西、浙江等省,適合在山區(qū)生長,是我國特色野生葡萄種之一。刺葡萄含有大量的營養(yǎng)成分,例如維生素、礦物質、不飽和脂肪酸、花青素、多酚類物質等-4?!锨?是我國野生刺葡萄中選育出來的優(yōu)秀栽培品種,可適應我國南方高溫多雨的氣候條件,具有豐產穩(wěn)產的優(yōu)點。關于‘紫秋'葡萄酒的釀造研究,多數集中在酒中營養(yǎng)功能性成分的分析上。由于地域分布以及自身特點,當前對‘紫秋'葡萄酒的香氣研究報道并不多見,而針對‘紫秋葡萄酒在酒精發(fā)酵過程中的香氣成分變化少有報道。
香氣是衡量葡萄酒感官特性的重要指標之一,明確“紫秋’葡萄酒發(fā)酵各時期的香氣成分和香氣特征變化規(guī)律,不僅可以為釀造工藝優(yōu)化提供支持,也為品質把控和原產地保護提供重要依據,對于葡萄酒的質量評價和真?zhèn)舞b別意義重大。目前用于葡萄酒揮發(fā)性風味物質研究的技術手段主要包括氣相-質譜法(GC-MS)氣相-嗅聞-質譜(GC-O-MS)電子鼻法(E-Nose)等。氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)技術是一種新型的分析技術,近些年來被廣泛應用于食品9醫(yī)藥[10-1環(huán)境監(jiān)測[2]等領域的揮發(fā)性有機物風味分析。GC-IMS技術在酒的香氣檢測方面已經有大量的研究報道3-15,而采用GC-IMS分析‘紫秋'葡萄酒酒精發(fā)酵過程中香氣成分的動態(tài)變化相關研究還未見報道。本研究聯(lián)合HS-SPME-GC-MS與GC-IMS技術,并結合化學計量學方法,探究了‘紫秋'葡萄酒酒精發(fā)酵過程中的香氣成分變化規(guī)律,并篩選特征性揮發(fā)物質,為‘紫秋'葡萄品質評價及釀酒工藝優(yōu)化提供依據,并為當地葡萄產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供參考,同時也為我國特色葡萄酒步入國際市場奠定基礎。
1材料與方法
1.1 材料與儀器
“紫秋'葡萄于2023年9月采購自廣東省韶關市。安琪葡萄酒釀酒酵母(RW),上海市安琪酵母有限公司;VinoCrushClassic果膠酶(食品級),VitafermentPH發(fā)酵助劑,法國Lamothe-Abiet公司;偏重亞硫酸鉀,意大利Enartis公司;白砂糖,購于東莞市大嶺山鎮(zhèn)百盛佳超市。
HS-SPME-GC-MS,8890-7000D氣相色譜-質譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司;DB-WAXUI氣相色譜柱( 30m×0.25 μm),美國Agilent公司。GC-IMS,FlavourSpec氣相色譜離子遷移譜,德國GAS公司。
1.2實驗方法
1.2.1 理化指標測定
‘紫秋葡萄基本理化指標(單果質量、可溶性固形物含量 可滴定酸含量)的測定參考江雨等所用的方法。
1.2.2 葡萄酒釀造
稱取 200kg 紫秋'葡萄,除梗、破碎、壓榨,并加入偏重亞硫酸鉀,將葡萄穆加入 不銹鋼發(fā)酵罐中,裝液量為 80% ,隨后加入 0.03:g/L 果膠酶靜置 24h 從發(fā)酵罐的下出口接取葡萄汁,將白砂糖在發(fā)酵罐外用葡萄汁充分溶解后,回填至發(fā)酵罐中,隨后接種活化后的干酵母啟動酒精發(fā)酵,發(fā)酵過程控溫(
)。每日監(jiān)測比重,當比重降至0.996時終止發(fā)酵。酒精發(fā)酵期間每日壓帽3次,每次
每日在16:00從發(fā)酵罐取樣口收集樣品,置于 -80% 冰箱低溫凍存。
1.2.3 HS-SPME-GC-MS分析條件
參考Zhang等的研究方法并進行調整優(yōu)化。移取2mL 葡萄酒于頂空樣品瓶中,在 40% 下預熱 5min ,插入老化后的萃取頭萃取 40min ,萃取結束后將纖維頭立即插入GC-MS采樣器于 解析 5min 。GC-MS起始溫度為 45℃,保持 3min ,以 2:C/m i n 升溫至 120℃,再以
升溫至
,保持 8min ,采用不分流進樣,進樣量為 10μL 進樣口溫度為
,流量為 1.0mL/min ,載氣為氮氣。
對采集到的質譜圖利用NIST譜庫進行檢索,以匹配度 gt;80% 為鑒定標準,并參照CAS編號與相關文獻進行比對,確定揮發(fā)性成分,計算出各香氣成分在酒樣中的百分含量。
1.2.4 GC-IMS分析條件
參考Cao等[8的研究方法并進行優(yōu)化。移取 2mL 稀釋后的不同發(fā)酵時間的葡萄酒樣品置于磁力頂空進樣瓶中,在 下孵育 10min 然后測定,每個樣品平行測試3次。色譜柱為MXT-WAX( 15m×0.53mm ,1.0μm, ,柱溫為
(純度≥99.999% )作為載氣/漂移氣,漂移氣流速 150mL/min ,IMS溫度為
,進樣針溫度為
,進樣體積為 500μL C
采用 C4~C9 正酮標準品對應FlavorSpec物質圖譜分析;采用LaboratoryAnalyticalViewer分析譜圖;基于揮發(fā)性成分的保留指數和遷移時間,與儀器內置NIST和IMS數據庫匹配,進行定性分析;基于峰信號值強度,計算各揮發(fā)性成分的相對含量。GalleryPlot插件進行指紋圖譜的繪制;Reporter插件進行二、三維譜圖差異分析。
1.3數據處理
所有指標平行實驗3次,結果均以“平均值 ± 標準差”的形式表示;采用SPSS22.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)軟件對化合物相對含量進行單因素方差分析和顯著性分析。PCA與PLS-DA的數據分析與作圖在MetaboAnalyst 網站(www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/)上完成。
2結果與分析
2.1‘紫秋'葡萄理化指標
‘紫秋'葡萄果粒紫黑,著生緊密,果粉較厚,果肉多汁。單果質量為! (4.0±0.15)g ,可溶性固形物含量為( 為 (3.65±0.12) ,可滴定酸含量為8.85±0.86)g/L
2.2‘紫秋'葡萄酒酒精發(fā)酵過程中HS-SPME-GC-MS分析
對酒精發(fā)酵過程中 的葡萄酒樣品進行HS-SPME-GC-MS分析,結果見圖1與表1。由圖1、表1可知共檢測出3類化合物(11種香氣成分),分別為酸類1種、酯類6種、醇類4種。與發(fā)酵第0天相比,發(fā)酵第8天時,己酸、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙醇、正己醇與2-苯乙醇含量變化明顯。整體來看,隨著發(fā)酵的進行,正己醇的含量呈降低的趨勢;乙酸異戊酯與己酸乙酯的含量呈先增加后降低的趨勢,在發(fā)酵第4天時含量達到峰值。辛酸乙酯與癸酸乙酯含量呈現波動式的變化,兩個物質的含量均在發(fā)酵第2天達到峰值;異戊醇含量也呈現波動式的變化,在發(fā)酵第1天達到峰值。乙酸苯乙酯僅在發(fā)酵第4~5天被檢測到,且含量較低。在發(fā)酵初期,GC-MS僅檢測到4種醇類物質,隨著發(fā)酵的進行,酸類和酯類的種類逐漸增加,而醇類物質的種類并未發(fā)生明顯變化。
醇類是葡萄酒的重要成分之一,可賦予葡萄酒特有的香氣,主要由糖代謝氨基酸的脫羧與脫氨而形成的%。多數醇類物質具有令人不愉快的香氣,會給葡萄酒的香氣帶來負面影響。正己醇在第0天時的含量為 61.38% ,在第8天時,正己醇的含量顯著降低至 1.07%(Plt; 0.05),正己醇是葡萄酒中常見的高級醇類物質,具有青草味,表明經過發(fā)酵可降低葡萄酒的生青味;而具有辣味、醚香與香蕉香味的異戊醇的含量在發(fā)酵終點沒有顯著變化。高級醇是葡萄酒二類香氣的重要組成成分,而異戊醇是構成葡萄酒中高級醇的主要成分,其含量適中時對葡萄酒風味有益,若其含量太高則不利于葡萄酒的風味。葡萄酒酒精發(fā)酵期間,高級醇隨著酵母的生長繁殖逐漸形成,從表1可知,異戊醇相對含量較高,可達14.66% ,這可能與發(fā)酵過程中亮氨酸被降解有關,葡萄穆液中若含有過多的氨基酸,則會誘導酵母的高級醇降解代謝機制而形成更多的高級醇2%。試驗發(fā)現,具有玫瑰香、薔薇香、紫羅蘭香與茉莉香的2-苯乙醇在發(fā)酵第0天的相對含量為 0.31% ,而在發(fā)酵第5天的含量為 5.57% ,比發(fā)酵初始的含量 0.31% )增加近18倍,然而在發(fā)酵終點時,其含量卻沒有顯著性變化。
酯類化合物賦予葡萄酒果香氣味,其主要來源發(fā)酵過程中酵母菌與細菌的相互作用,以及在葡萄酒陳釀時酸與醇類化合物發(fā)生的酯化反應。表1顯示在發(fā)酵終點,含量排名在前四位的分別是乙酸異戊酯( 4.40% )己酸乙酯( 3.24% )辛酸乙酯( 2.75% )與癸酸乙酯( 0.92% 。乙酸異戊酯賦予葡萄酒香蕉香、蘋果香、甜香味道,己酸乙酯賦予葡萄酒青蘋果味,而辛酸乙酯具有令人愉快的花果與香子香氣,葵酸乙酯具有葡萄味與花香。在發(fā)酵過程中有機酸被微生物大量合成,有機酸又與酒中的醇類物質發(fā)生酯化反應,這可能是導致酯類物質含量增多的原因之一[22]。
2.3“紫秋'葡萄酒酒精發(fā)酵過程中風味物質的GCIMS定性分析
利用GC-IMS對‘紫秋'葡萄酒在酒精發(fā)酵過程中產生的含量低但揮發(fā)性強的小分子風味物質進行分析。如圖2所示,橫坐標1.0處紅色垂直線為反應離子峰(RIP),RIP右側的每一個信號亮點表示一種揮發(fā)性成分,顏色代表化合物的濃度,越深表示濃度越大,紅色表示濃度較高,白色表示濃度較低。酒精發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的遷移時間在 1.0~2.0ms ,保留時間在100~800s內,與第0天樣品相比,發(fā)酵第1~8天樣品的揮發(fā)性成分差異明顯,且部分成分含量變化較大。為了進一步比較酒精發(fā)酵過程中的風味物質變化,選取第0天的二維譜圖作為參照,其余譜圖扣減參比形成二維差異對比譜圖(圖3),可直接對比發(fā)酵第0~8天的特征性揮發(fā)性物質。在扣減后的譜圖中,相同濃度的物質抵消為白色,紅色表示該物質的濃度高于參考值,藍色表示該物質濃度低于參考值,且顏色越深表示差異越大。由圖3可以看出,在發(fā)酵的第2天開始,保留時間在 150~800s 內,揮發(fā)性成分的種類隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增多。
GC-IMS檢測出的大多為 C4~C10 之間的、揮發(fā)性強且含量低的小分子化合物。根據色譜保留時間和離子遷移時間對風味物質定性分析,從數據庫中共計識別出22種揮發(fā)性化學成分,如表2所示。主要為酸類(2種)酯類(7種)醛類(5種)醇類物質(4種),及其他類型物質(4種),其中正已醇、2-苯乙醇為HS-SPME-GC-MS與GC-IMS共同檢測到的揮發(fā)性物質。
2.4‘紫秋葡萄酒酒精發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的指紋圖譜和相對含量分析
為了明確‘紫秋葡萄酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質的差異,采用LAV軟件的GalleryPlot插件繪制指紋圖譜,體現發(fā)酵過程中風味物質的差異變化,如圖4所示。信號亮點的顏色越深表示峰強度越大,風味物質的含量越高。通過指紋圖譜可以看出,發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質變化明顯。隨著發(fā)酵時間的延長,酸類成分(丁酸和癸酸)的相對含量逐漸增加;酯類成分中,甲酸異戊酯、異戊酸甲酯、乙酸-2-甲基丁酯的含量逐漸降低,而丙烯酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯的濃度呈現出先升高后降低的趨勢,反-2-已烯酸乙酯與乙酸辛酯的濃度呈現波動變化,這可能是由于酯交換以及酯類成分的易揮發(fā)特性所導致;醛類成分中的反-2-已烯醛的濃度逐漸增加,(E,E)-2,4-庚二烯醛與苯乙醛的濃度呈現先增加后降低的趨勢,反-2-辛烯醛與4-異丙基苯甲醛的濃度呈現波動式變化。在醇類物質中,1,3-丁二醇的變化趨勢較為明顯,而2-苯乙醇的濃度呈現出先降低后升高的趨勢;在其它的風味物質中, β -烯與 (E)-1-(2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮濃度變化呈現相反的趨勢。隨著發(fā)酵時間的增加, β -烯的濃度逐漸增加,而(E)-1-(2.6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮的含量則逐漸降低。
在葡萄酒中發(fā)現的不同酸類中,脂肪酸比其它種類的酸具有較低的嗅覺閾值,并且在室溫下濃度相對較高,具備足夠的揮發(fā)性3。由表3可知,在發(fā)酵過程中,丁酸的相對含量分別由 8.88% 增加至 15.23% ,癸酸的相對含量由 0.33% 增加至 0.49% 。隨著發(fā)酵時間的延長,癸酸的含量總體呈增加的趨勢,這與羅飛等2在‘龍眼'白葡萄酒發(fā)酵終點檢測到癸酸相對含量的變化趨勢相同。癸酸是葡萄酒中常見的揮發(fā)性脂肪酸,來源于脂質代謝和長鏈脂肪酸分解,賦予葡萄酒脂肪和奶酪的香味2。4-異丙基苯甲醛在發(fā)酵第8天的含量顯著高于發(fā)酵第0天,4-異丙基苯甲醛也稱作枯茗醛,是孜然中最典型的香味活性物質,其還存在于藏茴香、肉桂、沒藥等植物中,常被用作香料制品,同時,4-異丙基苯甲醛也在意大利Buttafuoco產區(qū)的兩款葡萄酒中被發(fā)現27]。
與GC-MS測定的結果相似,隨著發(fā)酵的進行,GC-IMS檢測出的2-苯乙醇的含量呈現波動式變化,2-苯乙醇具有特殊的玫瑰香氣和桃子味道,相比釀酒酵母純種發(fā)酵,混菌發(fā)酵可使苯乙醇含量大幅增加,可能與ARO1、AR07和AR08等芳香族氨基酸合成相關基因的高表達有關,在后續(xù)工作中可嘗試采用混菌發(fā)酵葡萄酒來增加2-苯乙醇的相對含量,從而改善葡萄酒香氣。
2.5‘紫秋'葡萄酒酒精發(fā)酵過程中風味物質PCA分析
PCA作為一種多元統(tǒng)計分析技術,可以簡化數據并揭示變量間的相互關系,已被廣泛應用于果酒發(fā)酵過程中香氣物質的特征變化2。在PCA得分圖中,樣品距離遠代表差異明顯,距離近則代表差異小。在HS-SPME-GC-MS的風味物質PCA得分圖中(圖5A),PC1和PC2的貢獻率分別為 47.1% 和 18.0% ;在GC-IMS的風味物質PCA得分圖中(圖5B),PC1和PC2的貢獻率分別為 55.2% 和 15.1% ,結果表明PCA結果分別能表示原始數據能集中 65.1% 與 70.3% 的信息,均大于可信值60% ,能夠較全面地反映和解釋樣品信息。
‘紫秋'葡萄酒酒精發(fā)酵過程中HS-SPME-GC-MS與GC-IMS的風味化合物的PCA分析結果略有不同,從圖5A的HS-SPME-GC-MS風味物質PCA分析結果可以直觀地發(fā)現,酒精發(fā)酵過程第0~3天與發(fā)酵第4~8天的發(fā)酵樣品具有明顯的象限差異。從圖5B的GC-IMS風味物質PCA分析結果可以直觀地發(fā)現,酒精發(fā)酵第0天和第1天與發(fā)酵第2天和第3天及發(fā)酵第4~8天的樣品具有明顯的象限差異,可以進行較好的區(qū)分;發(fā)酵初期(0~2d)與中后期(3~8d)的樣品的相對含量區(qū)分度較大,第4~8天的樣品在分布上相對更緊湊,這表明在發(fā)酵中后期,葡萄酒的風味組成和含量更接近。
2.6‘紫秋'葡萄酒酒精發(fā)酵過程中風味物質PLS-DA分析
PLS-DA是一種具有監(jiān)督判別模式的統(tǒng)計方法,可以有效解釋觀測值并進行相應變量預測,對組間觀察值進行區(qū)分并且能夠找到導致組間區(qū)別的影響變量。本研究以HS-SPME-GC-MS和GC-IMS檢測結果中的風味物質相對含量為因變量,發(fā)酵時間為自變量進行
PLS-DA分析,并通過置換實驗評價模型的性能指標,HS-SPME-GC-MS與GC-IMS模型的判別效果如圖6A、B所示, 分別為0.70411與
分別為0.62178與
與
的結果均大于0.5,表明該模型穩(wěn)定性較好,經過100次置換實驗,未出現過擬合現象,表明該模型具有較好的預測能力。
PLS-DA得分如圖6C、D所示,HS-SPME-GC-MS與
GC-IMS的結果均表明發(fā)酵第0、1、2天所在的主體區(qū)域相對緊密,而與其他發(fā)酵時間的樣品的區(qū)域相對獨立,互不交叉。而從發(fā)酵第3天開始,樣品所在區(qū)域交叉緊密,這表明在酒精發(fā)酵的中后期,揮發(fā)性物質的相對含量比較接近,這與PCA的結果基本吻合。
為進一步表征不同的發(fā)酵時間內揮發(fā)性化合物的差異,基于PLS-DA模型預測各揮發(fā)性成分變量重要性投影值(VIP),并繪制得分圖,當 VIPgt;1 則表明該變量對整體判別模型的貢獻度高,篩選 VIPgt;1 的化合物作為組間差異揮發(fā)性化合物。如圖6E、F所示,基于兩種檢測方式下共篩選出5種差異標志物,分別是正已醇、乙醇、反-2-己烯醛、丁酸、(E,E)-24-庚二烯醛。隨著發(fā)酵時間的增長,在HS-SPME-GC-MS的檢測模式下,正己醇的相對含量呈現降低的趨勢,而乙醇呈現出升高的趨勢;在GC-IMS檢測模式下,丁酸與(E,E)-2,4-庚二烯醛的相對含量均呈現出升高的趨勢。反-2-己烯醛呈濃郁新鮮水果、花的香氣3,是葡萄漿果常見的香氣成分。隨著發(fā)酵時間的延長,反-2-己烯醛的相對含量逐漸升高,而陳明等3研究發(fā)現,反-2-已烯醛在‘蛇龍珠'葡萄酒發(fā)酵過程中消失,這與本研究的結果相反,推測可能與葡萄品種以及發(fā)酵方式有關。
3討論與結論
本研究采用HS-SPME-GC-MS與GC-IMS技術并結合化學計量法對‘紫秋'葡萄酒酒精發(fā)酵過程中的香氣成分變化規(guī)律進行分析。在發(fā)酵過程中共檢測到31種風味物質,包含酯類7種、醛類5種、醇類4種、酸類2種,以及其他類型物質4種。與發(fā)酵第0天相比,酒精發(fā)酵結束時,新增加6種風味物質,包括酸類物質1種和酯類物質5種。PCA分析結果表明發(fā)酵前期(0~2d)的揮發(fā)性物質的相對含量與發(fā)酵中期(3~5d)后期(6~8d)有顯著差異。進一步對不同發(fā)酵時期樣品的關鍵風味化合物進行PLS-DA分析,共篩選出5種 VIPgt;1 的差異標志物,分別是正己醇、乙醇、反-2-已烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛與丁酸,這些物質共同作用可能導致酒精發(fā)酵期間的風味變化,帶給葡萄酒新鮮水果、花與青草的香氣。
由于GC-IMS數據庫的數據有限,例如烷烴類化合物等揮發(fā)性化合物無法定性[33-34。在后續(xù)的研究中,可結合電子舌或電子鼻等技術全面繼續(xù)深入分析‘紫秋'葡萄酒在發(fā)酵過程中產生的香氣成分與對應感官特征的變化規(guī)律,進一步探究‘紫秋”葡萄酒的品質特征,并建立一套關于刺葡萄酒風味評價標準,以期為‘紫秋'葡萄酒的品質優(yōu)化提供科學借鑒和數據支持。
此外,還需要深入挖掘微生物與葡萄酒香氣特征之間的關系,探究微生物群落組成及演替與葡萄酒香氣的相關性;用多學科交叉融合的方法解開香氣的微生物互作機制,從而提高葡萄酒的感官品質,生產出具有理想風味的葡萄酒。在管敬喜等3針對毛葡萄酒香氣成分的研究報道中,相比較傳統(tǒng)釀制法,冷浸漬法與 浸漬法可以降低毛葡萄酒的青草和生青味,而苯乙醇及酯類物質的含量的增加卻賦予毛葡萄酒更多的果香和花香。因此在后續(xù)的研究中,也可考慮采用冷浸漬、微波輔助浸漬、二氧化碳浸漬、超聲/微波輔助預處理、脈沖電場預處理等技術對‘紫秋'葡萄酒的風味和品質進行改良。
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