摘要：金屬鹵化物鈣鈦礦由于其多維度的晶體結構和優(yōu)良的熒光成像/示蹤及光電轉換性質，使其成為一種非常具有前瞻性的光電增效治療腫瘤材料。然而，傳統(tǒng)鹵化物鈣鈦礦納米晶的水穩(wěn)定性問題，限制了其應用于生物成像和光電增效腫瘤治療的藥物遞送納米系統(tǒng)研究。本文將甲氨蝶呤-殼聚糖-葉酸（MTX-CS-FA）成功與鈣鈦礦納米晶體CsSn0.5Pb0.5Br3（PeNCs）鉚釘連接，制備出了可以在水中穩(wěn)定228 d且發(fā)綠光的PeNCs@MTX-CS-FA納米載藥體系。在可見光照射下，新型PeNCs@MTX-CS-FA納米載藥體系增效抗腫瘤治療原理：鈣鈦礦納米晶體產(chǎn)生電子和活性氧（ROS）；鈣鈦礦光生空穴耗竭過表達的谷胱甘肽（GSH）；甲氨蝶呤（MTX）抑制二氫葉酸還原酶（DHFR）活性，導致腫瘤細胞的脂質過氧化，上述三點共同作用抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞凋亡。在動物體內實驗中，采用小鼠移植腫瘤模型，累積用藥量達2.4mg PeNCs@MTX-CS-FA納米載藥系統(tǒng)時，腫瘤體積減少了約63.68%和腫瘤重量下降了約63.26%。通過生物安全性評估實驗證實，在治療劑量下，小鼠肝、腎等器官功能正常，說明納米體系具有良好的生物安全性，并且研究發(fā)現(xiàn)鈣鈦礦納米顆粒經(jīng)小鼠腸道排出，小鼠糞便呈現(xiàn)出與原始鈣鈦礦晶體相同的綠色熒光，金屬鹵化物鈣鈦礦納米載藥體系在生物成像和光電催化化療方面呈現(xiàn)優(yōu)異的增效抗腫瘤治療效果。

關鍵詞：腫瘤治療；生物成像；鈣鈦礦納米顆粒；光電催化化療

中圖分類號：O644

1 引言

光電催化將光能轉化為化學能。光電催化不僅用于能源催化[1–4]，還通過利用光誘導電子生成的大量活性氧（ROS） [5，6]，以及在光生空穴氧化作用下消耗谷胱甘肽（GSH） [7]，在疾病治療中發(fā)揮作用。鈣鈦礦材料由于其優(yōu)異光電轉換性能，在光伏領域引起了廣泛關注[8–12]。鈣鈦礦材料具有典型的化學式ABX3，其中A代表陽離子，B代表二價陽離子，X代表鹵素離子[13]。鈣鈦礦材料具有較高的電子（2000 cm2?V?1?s?1）和空穴（300 cm2?V?1?s?1）遷移率[14]，以及約175 μm的長載流子擴散距離[15，16]，以上為鈣鈦礦具有優(yōu)異光電催化性能的關鍵因素。在生物成像和靶向追蹤中，具有高光致發(fā)光量子產(chǎn)率（PLQY gt; 80%） [17，18]的全無機銫鉛鹵化鈣鈦礦表現(xiàn)出巨大的前景[19–21]。Gr?tzel等[22–24]對鈣鈦礦在太陽能電池和光催化中的應用進行了廣泛研究。Yang等[25，26]深入研究了鈣鈦礦材料在光催化領域的應用。此外，Ryu等[27]、Lian 等[28] 和Patel 等[29] 利用鈣鈦礦材料（CsPbBr3@SiO2）進行細胞成像，發(fā)現(xiàn)了鈣鈦礦具有顯著的細胞內熒光成像特性。在可見光照射下，鈣鈦礦納米顆粒將三重態(tài)能量轉移到有機分子上，產(chǎn)生大量電子和空穴，進而介導單重態(tài)氧（1O2）的生成[30–33]。這一優(yōu)異的光電催化能力具有應用于抗腫瘤治療的潛力。然而，鈣鈦礦的晶體結構易受水降解的影響[34–37]。水可引發(fā)鈣鈦礦結構分解[38–40]，導致光電性能退化，最終引發(fā)細胞損傷[41]。與InP [42]、AgInS [43]、碳[44]、CdSe [45]、ZnSe [46]等光電材料相比，鈣鈦礦表現(xiàn)出更優(yōu)的整體性能，包括光電性能、穩(wěn)定性和易于加工性[47]。設計用于生物醫(yī)學應用的鈣鈦礦納米晶體（PeNCs）面臨重大挑戰(zhàn)；例如，適用于抗腫瘤治療的鈣鈦礦材料需要具有高水穩(wěn)定性和低毒性[48，49]。提高金屬鹵化物PeNCs水抗性的常用方法包括涂覆金屬有機框架[50]、過渡金屬氧化物玻璃[51]和聚合物[52]。

在本文中， 我們利用殼聚糖（CS） 修飾CsSn0.5Pb0.5Br3鈣鈦礦納米顆粒提高其親水性，將靶向劑葉酸（FA）和化療藥物甲氨蝶呤（MTX）通過酰胺鍵與CS共軛。合成了具有水穩(wěn)定的及生物成像和抗腫瘤能力的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒，并闡明了其作用機制。

2 方法

2.1 材料

Cs2CO3 （99%），PbBr2 （99%），1-十八烯（OCE）（gt; 90%），環(huán)己烷（C6H12） （99.5%），油酸（OA） （≥99%），油胺（OAm） （80%–90%），葉酸（gt; 97%），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS） （98%），冰醋酸≥ （99.8%），H2O2 （30% （wt.）水溶液），1-乙基-3-（二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC） （98%） ， 二甲基亞砜（DMSO） （≥ 99%），2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮鹽酸鹽（TEMP） （98%），5，5-二甲基-1-吡咯烯-N-氧化物（DMPO） （97%）， 二甲苯（99%）， 中性膠和乙醇（99.5%）均購自阿拉丁化學試劑有限公司。SnBr2（99.99%），乙酸甲酯（98%）購自上海麥克林生化有限公司。殼聚糖（CS）（分子量100000–300000）購自北京百靈威科技有限公司。甲氨蝶呤購自廣東嶺南藥業(yè)有限公司。胎牛血清（FBS）生物試劑產(chǎn)自烏拉圭。DMEM不完全培養(yǎng)基生物試劑、抗熒光衰減封片液（含DAPI）生物試劑、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）生物試劑和胰蛋白酶生物試劑購自北京索拉比奧科技有限公司。CCK-8試劑盒生物試劑和Calcein-AM/PI活/死細胞雙染色試劑盒生物試劑購自石家莊智寶生物技術有限公司。4%多聚甲醛購自桑根生物科技（上海）有限公司。溶酶體追蹤紅（溶酶體紅熒光探針）生物試劑、二氫乙啶（超氧陰離子熒光探針）生物試劑、單步TdT介導dUTP缺口末端標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（紅色熒光）生物試劑、蘇木精-伊紅染色生物試劑和RIPA裂解緩沖液（ 強） 由貝達藥業(yè)科技公司（ 上海） 供應。C57BL/6JNifdc清潔級小鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司供應。5%氯化水合物購自上海嚴恩化學科技有限公司。四氫葉酸（THFA）檢測試劑盒生物試劑購自云克隆公司（CCC，武漢）?？构入赘孰目贵w生物試劑購自英國Abcam公司。R-藻紅蛋白AffiniPure F（ab'）2片段 驢抗小鼠IgG （H+L）生物試劑購自武漢三英生物技術有限公司。透析袋（分子量：3500）購自南通蘇品實驗設備有限公司。BD生物科學公司提供的BD生物科學公司透過/清洗緩沖液（BD perm/wash）和BD Cytofix/Cytoperm?細胞固定/透過化試劑盒。

2.2 CsSn0.5Pb0.5Br3、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的合成

2.2.1 熱注射法合成三維鈣鈦礦CsSn0.5Pb0.5Br3納米晶體（NCs）

具體步驟如下：

（1） 前驅體溶液的制備

將0.5 mmol PbBr2和0.5 mmol SnBr2溶解于0.5mL 1-十八烯（ODE）中，在120 °C下攪拌，直至PbBr2和SnBr2完全溶解，得到前驅體溶液。然后加入1mL油酸（OA）和1.5 mL油胺（OAm）并繼續(xù)攪拌。

（2） 油酸銫（Cs-OL）的制備

將0.16 g Cs2CO3溶解于1 mL油酸和16 mL 1-十八烯中，在120 °C下攪拌，直到Cs2CO3完全溶解，得到油酸銫（Cs-OL）。

（3） 油酸銫的注入

將油酸銫溶液注入前驅體溶液中。經(jīng)過5 min反應，溶液變?yōu)闇啙岬陌咨珷顟B(tài)。

（4） 離心和沉淀

將白色懸浮液冷卻至室溫， 然后以6000r?min?1的速度離心15 min，獲得白色沉淀。

（5） 超聲分散

向白色沉淀中加入20 mL環(huán)己烷，超聲處理30min。沉淀均勻分散在環(huán)己烷中，得到零維的Cs4Sn0.5Pb0.5Br6納米晶體（NCs）。該溶液存儲在4 °C環(huán)境下以供后續(xù)使用。

（6） CsSn0.5Pb0.5Br3 NCs的制備

向5 mL NCs-環(huán)己烷溶液中加入1 mL去離子水，攪拌至溶液變?yōu)榫G色。待顏色穩(wěn)定后，超聲混合溶液2–10 min。最后，使用0.22 μm濾膜過濾該溶液，得到 CsSn0.5Pb0.5Br3 NCs溶液。

2.2.2 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒的合成

（1） 按照第2.2.1 節(jié)的描述， 準備Cs4Sn0.5Pb0.5Br6 NCs溶液。

（2） 將殼聚糖溶解在1%冰醋酸中，制備濃度為0.001 g?mL?1的殼聚糖溶液。

（3） 攪拌Cs4Sn0.5Pb0.5Br6 NCs溶液，并緩慢將殼聚糖溶液以體積比5 ： 1加入Cs4Sn0.5Pb0.5Br6 NCs溶液中。此時白色溶液會逐漸變?yōu)榫G色。待溶液顏色穩(wěn)定后，將混合溶液進行超聲處理2–10 min，然后用直徑為0.22 μm的過濾器進行過濾。所得到的濾液即為殼聚糖包覆的CsSn0.5Pb0.5Br3納米顆粒溶液，本文中稱其為CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒。接著，使用甲基乙酸乙酯進行萃取，甲基乙酸乙酯與濾液的體積比為1 ： 2。將萃取液進行6000 r?min?1的離心15 min，之后將沉淀在真空烘箱中干燥，獲得CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒粉末。

2.2.3 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒的合成

（1） 將葉酸（FA）溶解于DMSO中，制備濃度為1 mg?mL?1的FA溶液。隨后，向溶液中加入濃度為0.066 g?mL?1 的C8H18ClN3 （EDC） 和濃度為0.036g?mL?1的C4H5NO3 （NHS）。在室溫下攪拌混合物，直到EDC和NHS完全溶解，得到FA溶液。

（2） 將殼聚糖（CS）溶解于1%的冰醋酸中，制備濃度為0.001 g?mL?1的CS溶液。

（3） 按體積比1 ： 5將FA溶液與CS溶液混合，在室溫下反應，形成CS-FA溶液。

（4） 將CS-FA 溶液按體積比1 ： 5 加入Cs4Sn0.5Pb0.5Br6溶液中，溶液逐漸由白色變?yōu)榫G色。待溶液顏色穩(wěn)定后，將混合液在超聲波清洗器中處理2–10 min，接著用0.22 μm的過濾器進行過濾。濾液為殼聚糖包覆的CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒溶液。使用乙酸乙酯進行提取，乙酸乙酯與濾液的體積比為1 ：2。將提取液以6000 r?min?1的速度離心15 min，隨后將沉淀在真空烘箱中干燥， 得到CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒粉末。

2.2.4 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的合成

（1） 按照第2.2.3節(jié)的方法制備CS-FA溶液。

（2） 將甲氨蝶呤（MTX）溶解于DMSO中，制備濃度為0.001 g?mL?1的MTX溶液。隨后，向溶液中加入濃度為0.013 g?mL?1的C8H18ClN3 （EDC）和濃度為0.007 g?mL?1的C4H5NO3 （NHS）。在室溫下攪拌混合物，得到MTX溶液。

（3） 將CS-FA溶液按體積比1 ： 1加入MTX溶液中，在室溫下反應，得到MTX-CS-FA溶液。

（4） 將MTX-CS-FA溶液按體積比1 ： 1加入Cs4Sn0.5Pb0.5Br?溶液中，溶液逐漸由透明變?yōu)榫G色。待溶液顏色穩(wěn)定后，將混合液在超聲波清洗器中處理2–10 min，接著用0.22 μm的過濾器進行過濾。得到的溶液為殼聚糖包覆的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒溶液。使用乙酸乙酯進行提取，乙酸乙酯與濾液的體積比為1 ： 2。將提取液以6000 r?min?1的速度離心15 min，隨后將沉淀在真空烘箱中干燥， 得到CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒粉末。

2.3 材料表征

使用FEI Talos F200S 顯微鏡獲取CsSn0.5Pb0.5Br3 和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA 納米顆粒的TEM圖像。使用UV/Vis 1050 FTIR儀器對CS、FA、MTX、CsSn0.5Pb0.5Br3和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒進行傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析。使用Shimadzu AXI Sultra DLD和D8ADVANCE 儀器進行CsSn0.5Pb0.5Br3 和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的X射線光電子能譜（XPS）和X射線衍射（XRD）分析。使用Thermo Fisher Escalab Xi+、UV/Vis 1050和FS5光譜儀對CsSn0.5Pb0.5Br3、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的紫外光電子譜、紫外-可見吸收光譜和熒光光譜進行表征。使用自開發(fā)的多功能原子力顯微鏡進行開爾文探針力顯微鏡（KPFM）測試，儀器配備NT-MDTSMENA探頭。測試使用HA-FM/Pt導電探針進行，測試結果通過開源軟件Gwyddion進行分析和繪制。

2.4 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的細胞共聚焦成像實驗

為了證明納米顆粒對腫瘤細胞的靶向作用，進行細胞共聚焦成像實驗，使用共聚焦顯微鏡FV1000（奧林巴斯，日本） [53]。

2.4.1 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒的細胞共聚焦成像實驗

（1） 將細胞蓋玻片放置于24孔板每個孔的底部，接種LLC細胞，密度約為2 × 104個細胞/孔。

（2） 將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（3） 去除培養(yǎng)基，加入濃度為200 μg?mL?1的CsSn0.5Pb0.5Br3@CS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

（4） 丟棄培養(yǎng)基，使用PBS沖洗細胞三次，去除未吸附的量子點。

（5） 向細胞培養(yǎng)基中加入濃度為75 nmol?L?1的Lyso-Tracker Red，37 °C下孵育45 min。

（6） 使用PBS沖洗細胞三次。

（7） 加入4%多聚甲醛固定細胞，固定30 min后，用PBS沖洗三次。

（8） 去除細胞蓋玻片，將其（細胞面朝下）放置到含有DAPI封片介質的玻片上。

（9） 將玻片在黑暗中自然風干。

（10） 使用共聚焦顯微鏡（FV1000，奧林巴斯，日本）觀察并捕捉圖像。細胞核用DAPI染色，并在405 nm 激光激發(fā)下發(fā)出藍色熒光。CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒在488 nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。用Lyso-Tracker Red染色的溶酶體在559 nm激光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。

2.4.2 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒的細胞共聚焦成像實驗

（1） 將細胞蓋玻片放置于24孔板每個孔的底部，接種LLC和C2C12細胞，密度約為2 × 104個細胞/孔。

（2） 將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（3） 去除培養(yǎng)基，加入濃度為200 μg?mL?1的CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

（4） 丟棄培養(yǎng)基，使用PBS沖洗細胞三次，去除未吸附的量子點。

（5） 向細胞培養(yǎng)基中加入濃度為75 nmol?L?1的Lyso-Tracker Red，37 °C下孵育45 min。

（6） 使用PBS沖洗細胞三次。

（7） 加入4%多聚甲醛固定細胞，固定30 min后，用PBS沖洗三次。

（8） 去除細胞蓋玻片，將其（細胞面朝下）放置到含有DAPI封片介質的玻片上。

（9） 將玻片在黑暗中自然風干。

（10） 使用共聚焦顯微鏡（FV1000，奧林巴斯，日本）觀察并捕捉圖像。細胞核用DAPI染色，并在405 nm 激光激發(fā)下發(fā)出藍色熒光。CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒在488 nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。用Lyso-Tracker Red染色的溶酶體在559 nm激光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。

2.4.3 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的細胞共聚焦成像實驗

（1） 將細胞蓋玻片放置于24孔板每個孔的底部，接種LLC細胞，密度約為2 × 104個細胞/孔。

（2） 將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（3） 去除培養(yǎng)基，加入濃度為200 μg?mL?1的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

（4） 丟棄培養(yǎng)基，使用PBS沖洗細胞三次，去除未吸附的量子點。

（5） 向細胞培養(yǎng)基中加入濃度為75 nmol?L?1的Lyso-Tracker Red，37 °C下孵育45 min。

（6） 使用PBS沖洗細胞三次。

（7） 加入4%多聚甲醛固定細胞，固定30 min后，用PBS沖洗三次。

（8） 去除細胞蓋玻片，將其（細胞面朝下）放置到含有DAPI封片介質的玻片上。

（9） 將玻片在黑暗中自然風干。

（10） 使用共聚焦顯微鏡（FV1000，奧林巴斯，日本）觀察并捕捉圖像。細胞核用DAPI染色，并在405 nm 激光激發(fā)下發(fā)出藍色熒光。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在488 nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。用Lyso-Tracker Red染色的溶酶體在559 nm激光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。

2.5 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的細胞CCK-8實驗

采用CCK-8 試劑盒評估細胞增殖， 分析CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的細胞毒性，使用全自動酶標檢測儀[5]。LLC細胞接種于96孔板（細胞密度：1 × 105個細胞/孔），并在37 °C下培養(yǎng)24 h。隨后，去除培養(yǎng)基，向每個孔中加入不同濃度的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒溶液（0， 25， 50， 75， 100， 125， 150， 175， 200μg?mL?1），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

接下來，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌一次，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h。使用酶標儀在450nm波長下測量每孔的光密度（OD），并記錄結果。

細胞存活率（%）計算公式為[（As ? Ab）/（Ac ?Ab）] × 100，其中As為實驗孔的吸光度（含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8及測試化合物），Ab為空白孔的吸光度（含培養(yǎng)基和CCK-8），Ac為對照孔的吸光度（含細胞、培養(yǎng)基和CCK-8）。

2.6 活細胞與死細胞染色

活細胞與死細胞染色實驗用于展示納米顆粒對腫瘤細胞的細胞毒性效應，使用倒置熒光顯微鏡IX71儀器進行觀察[54]。

2.6.1 溶液的制備

1×檢測緩沖液的制備：從低溫冰箱中取出10×檢測緩沖液，按照無菌條件取適量，并用去離子水稀釋至10×，得到1×檢測緩沖液。

1×染色工作溶液的制備：將儲存的Calcein-AM溶液（2 mmol?L?1）和PI溶液（1.5 mmol?L?1）在室溫下平衡20–30 min。取5 μL Calcein-AM溶液（2mmol?L?1）和15 μL PI溶液（1.5 mmol?L?1），將其加入5 mL的1倍檢測緩沖液中，充分混合，得到濃度為2 μmol?L?1的Calcein-AM和4.5 μmol?L?1的PI的工作溶液。

2.6.2 染色

將對照組（生理鹽水）、MTX組（3.04 μg?mL?1）、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 組（200 μg?mL?1） 和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA 納米顆粒組（200μg?mL?1）溶液加入到接種適當密度的LLC細胞（50%–60%）的6孔板中，孵育24 h。用胰蛋白酶-EDTA消化細胞，并通過離心（1000 r?min?1，3 min）收集細胞。去除上清液后，用1× Assay緩沖液洗滌細胞3次，以去除殘留的酯酶活性。使用1× Assay緩沖液準備細胞懸液，細胞密度為1 × 105–1 × 106個細胞/mL。取100 μL染色工作溶液與200 μL細胞懸液混合，37 °C孵育15 min。使用帶490 ± 10 nm激發(fā)濾光片的熒光顯微鏡同時檢測活細胞（綠色熒光）和死細胞（紅色熒光）。另外，使用545 nm發(fā)射濾光片僅觀察死細胞。

2.7 體內ROS檢測（DHE共聚焦染色）

使用FV1000共聚焦顯微鏡進行ROS檢測，證明納米顆粒通過ROS的產(chǎn)生誘導腫瘤細胞死亡[54]。將細胞載玻片放置于24孔板的底部，接種LLC細胞（約2 × 104個細胞/孔）。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基。加入對照組（生理鹽水）、MTX組（3.04 μg?mL?1）、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組（200 μg?mL?1）和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（200 μg?mL?1）至相應的培養(yǎng)基中。繼續(xù)培養(yǎng)6 h，棄去培養(yǎng)基。隨后，用PBS洗滌細胞三次，去除培養(yǎng)基中殘留的納米顆粒。加入500 μLDHE （5 μmol?L?1）溶液，置于37 °C培養(yǎng)箱中孵育30min。然后用PBS洗滌細胞三次。接著，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，并用PBS洗滌三次。取出細胞載玻片，將其（細胞面朝下）固定到含有封片液（含DAPI）的玻璃載片上，在黑暗中自然干燥。使用FV1000共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，日本）觀察并拍攝圖像。DAPI染色的細胞核在405 nm激光激發(fā)下發(fā)出藍色熒光。CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒在488 nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。DHE染色在559 nm激光激發(fā)下顯示紅色熒光。

2.8 腫瘤模型的建立

6–8周齡的雄性C57BL/6JNifdc小鼠購自北京維通利華公司。所有小鼠均在控制環(huán)境條件下飼養(yǎng)（室溫：22 ± 1 °C，相對濕度：40%–70%）。所有動物實驗均獲得河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院倫理委員會的批準。每只小鼠右前胸皮下注射1 × 106個LLC細胞，建立小鼠腫瘤模型。

2.9 體內抗腫瘤實驗

C57BL/6JNifdc小鼠腫瘤模型按照第2.8節(jié)所述建立。當腫瘤體積達到50 mm3時，將40只荷瘤小鼠隨機分為四組：a） 對照組（200 μL生理鹽水）；b） MTX 組（200 μL ， 0.0608 mg?mL?1） ； c）CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 納米顆粒組（200 μL ， 4mg?mL?1）；d） CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（200 μL，4 mg?mL?1）。四組的給藥途徑為尾靜脈注射。在分組后的第0、5和10 d進行重復的尾靜脈注射，所有小鼠均暴露于24 h的日光下。每兩天測量一次腫瘤小鼠模型的腫瘤體積。每隔一天記錄小鼠的一般狀況、腫瘤體積和體重。第12 d，每組隨機處死5只小鼠，收集腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織，進行蘇木精-伊紅（HE）染色和TUNEL染色。當腫瘤體積增加至1000 mm3時，認為荷瘤小鼠死亡，并記錄日期。

2.10 腫瘤組織的HE染色

使用倒置熒光顯微鏡（型號IX71）進行HE染色，以通過儀器展示納米顆粒對腫瘤組織的抗腫瘤效果[55]。將對照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的新鮮腫瘤組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中12 h。隨后，使用不同濃度的乙醇（75%、85%、95%、100%）脫水，并通過組織脫水機在二甲苯中透明化。將腫瘤組織浸泡在蠟中8 h后，進行石蠟包埋。石蠟切片在二甲苯中脫蠟，依次在不同濃度的乙醇（100%、95%、85%、75%）和PBS中清洗。用蘇木精染色2 min，并用自來水洗滌10 min。將切片在1%鹽酸乙醇溶液中分化約30 s，然后用自來水沖洗一次。用伊紅溶液染色8 s，并用自來水沖洗至無色。使用不同濃度的乙醇（85%、95%、100%）脫水，使其在二甲苯中透明化，封片后用中性樹膠封固，最后在光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.11 腫瘤組織的TUNEL染色

使用TUNEL染色法，通過FV1000共聚焦顯微鏡展示納米顆粒對腫瘤組織的細胞毒性作用[56]。TUNEL檢測溶液由75 μL TdT酶、675 μL熒光標記溶液和750 μL TUNEL檢測緩沖液組成。將對照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的腫瘤組織切片在4%多聚甲醛溶液中固定30 min，并用PBS洗滌兩次，每次10 min。接著，加入0.5% TritonX-100在PBS中的溶液，在室溫下孵育5 min。隨后，使用PBS洗滌兩次，每次10 min。向樣本中加入100μL TUNEL檢測溶液，在37 °C下孵育60 min （放置于濕潤箱中以防水分蒸發(fā)），并避光處理。孵育后，用PBS洗滌三次，每次10 min。最后，使用抗褪色液進行封片，并自然干燥。

2.12 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內的代謝分布及血清游離鉛的檢測

CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內的代謝分布及血清游離鉛的檢測旨在闡明納米顆粒在小鼠體內的分布及安全性。使用小動物體內成像儀IVIS Lumina III和電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）進行檢測[57]。建立28只C57BL/6JNifdc小鼠的腫瘤模型。當腫瘤體積達到50 mm3時，將CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒（200 μL，4mg?mL?1）通過尾靜脈注射給藥于7只荷瘤小鼠。通過隨機犧牲每個時間點的一只小鼠（0、6、24、48、72、96和120 h），測量腫瘤、糞便和主要器官的熒光強度。使用小動物體內成像儀評估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在腫瘤、糞便和主要器官中的熒光強度，從而展示納米顆粒的生物分布。此外，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒（200 μl，4 mg?mL?1）通過尾靜脈注射于21只荷瘤小鼠，并在不同時間點（0、6、24、48、72、96和120 h）收集小鼠的血樣。每個時間點從三只小鼠收集血樣，利用ICP-MS測定血清中游離鉛的濃度。

2.13 體內生物安全性實驗

使用全自動生化和血細胞分析儀進行安全性實驗，評估納米顆粒在小鼠體內的安全性[58]。選擇健康的C57BL/6JNifdc小鼠進行體內生物安全性分析。將20只小鼠隨機分為四組：對照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX納米顆粒組。所有組通過尾靜脈注射給藥，每5 d一次，共注射三次。一個月后，隨機從每組的3只小鼠眼球處收集血樣進行血常規(guī)、肝腎功能檢測。此外，每組隨機處死2只小鼠，收集主要器官（包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟）進行HE染色。具體的取樣和染色步驟與2.10相同。

2.14 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的光電機制檢測

將CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒混合溶液旋涂于FTO/SnO2基板上，并在100 °C下干燥30 min，得到CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒薄膜。隨后，使用原子力顯微鏡（AFM）檢測薄膜在暗態(tài)和光照條件下接觸電位差的變化。

2.15 THFA檢測

將LLC細胞接種于6孔板中（每孔約1 × 106個細胞），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基后，分別加入對照組（生理鹽水）、MTX組（3.04 μg?mL?1）、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組（200 μg?mL?1）和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（200μg?mL?1）的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌細胞兩次，使用胰蛋白酶消化細胞，2235 r?min?1離心5min后收集細胞。收集的細胞用PBS洗滌三次，再用新鮮的裂解緩沖液重懸，濃度調整為1 × 107cells?mL?1，靜置5 min。將樣本以3353 r?min?1離心10 min，溫度為2–8 °C，取上清液進行檢測。使用四氫葉酸檢測試劑盒測定各組腫瘤細胞中的四氫葉酸濃度。

2.16 谷胱甘肽檢測

谷胱甘肽檢測用于通過流式細胞儀展示納米顆粒通過降低谷胱甘肽濃度殺死腫瘤細胞[59]。將LLC細胞接種于6孔板中（每孔約1 × 106個細胞），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基后，分別加入對照組（ 生理鹽水） 、MTX 組（3.04 μg?mL?1） 、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組（200 μg?mL?1）和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（200μg?mL?1）的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌細胞兩次，使用胰蛋白酶消化細胞，2235 r?min?1離心5min后收集細胞。收集的細胞用PBS洗滌三次。加入膜破裂劑（500 μL，室溫避光孵育30 min），然后以1118 r?min?1離心5 min，棄去上清液。接著加入2 mL BD Perm/Wash，混勻并在室溫下避光孵育10min，再以1118 r?min?1離心5 min，棄去上清液。加入GSH抗體（1 ： 250），混勻并在室溫下避光孵育30min。隨后，加入2 mL BD Perm/Wash，洗滌一次，再以1118 r?min?1離心5 min，棄去上清液。加入R-藻紅蛋白AffiniPure F（ab'）2 片段驢抗小鼠IgG（H+L）二抗（1 ： 50），混勻并在室溫下避光孵育20min。最后，加入2 mL BD Perm/Wash，并以1118r?min?1離心5 min，棄去上清液，混勻細胞懸液進行流式細胞術分析。

2.17 釋藥實驗

釋藥實驗旨在展示CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CSFA納米顆粒中MTX的藥物負載率，使用紫外-可見分光光度計（UV-Vis）進行檢測[60]。為了評估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在不同pH環(huán)境下的釋藥情況，包括酸性環(huán)境（pH 5.0）、中性生理環(huán)境（pH 7.4）和堿性生理環(huán)境（pH 8.4），選擇PBS （pH 5.0、pH 7.4和pH 8.4）作為體外釋藥介質。首先，準確稱取40.00 mg CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒粉末，溶解于10 mL的PBS （pH5.0、pH 7.4或pH 8.4）中，并將其置入透析袋（MW：3500），然后將透析袋放入300 mL PBS （pH 5.0、pH7.4或pH 8.4）中，在37 °C下以120 r?min?1攪拌。按照預定的時間點（0、5、10、15、30 min、1、1.5、2、4、6、8、10、12和24 h）取樣，每次提取3 mL液體，并加入等體積的新鮮PBS緩沖液（對應的pH值）。使用分光光度計測定體外釋藥液中的藥物濃度，并繪制藥物釋放曲線。進行三次平行實驗以驗證實驗的可重復性。

2.18 電子自旋共振（ESR）檢測

ESR檢測[7]用于證明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒在405 nm光照射下可以產(chǎn)生ROS。首先，準備200 μg?mL?1的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒溶液。取45 μL溶液（200 μg?mL?1）并加入5 μL捕獲劑。使用2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮鹽酸鹽（TEMP）作為1O2的捕獲劑，使用5，5-二甲基-1-吡咯烯-N-氧化物（DMPO）作為（O2?和?OH）的捕獲劑。用405 nm LED燈照射樣品10 min，然后進行ESR檢測。

2.19 統(tǒng)計分析

為了確保實驗的準確性，進行至少三次重復實驗。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。所有統(tǒng)計分析使用Origin 2018和GraphPad Prism 8.0進行。多組之間的統(tǒng)計顯著性通過單因素方差分析（onewayANOVA） 和雙因素方差分析（two-wayANOVA）計算。兩組之間的統(tǒng)計顯著性通過學生t檢驗（Student's t-test）進行。假設*P lt; 0.05，**P lt;0.01和***P lt; 0.001表示具有統(tǒng)計學意義。

3 結果與討論

CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒通過三種機制促進腫瘤細胞損傷（圖1）。首先，在可見光照射下，鈣鈦礦納米顆粒生成大量電子，促進多種ROS的產(chǎn)生，包括超氧陰離子（O2?）、羥基自由基（?OH）和1O2 [7，54]。其次，光生空穴作為天然氧化劑，消耗細胞內過度表達的GSH，從而誘導腫瘤細胞凋亡[54]。最后，在腫瘤細胞內的堿性環(huán)境中鈣鈦礦納米顆粒釋放化療藥物甲氨蝶呤（MTX） [61]，抑制嘌呤合成，并同時阻斷GCH1/BH4/DHFR系統(tǒng)，導致脂質過氧化作用增強[62–64]。

總之，提出了一種使用CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒作為集成治療診斷平臺的新概念。該平臺通過熒光檢測追蹤腫瘤細胞、釋放MTX進行化療，并在可見光照射下生成ROS （圖1）。在注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒并隨后進行可見光照射后，該平臺成功地誘導腫瘤細胞內的氧化還原失衡，增強脂質過氧化作用，最終導致細胞凋亡[64]。重要的是，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)異的安全性和強大的光電催化化療能力。這些發(fā)現(xiàn)強調了其開發(fā)的重要性，并促進其在腫瘤治療中的潛在應用。

CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的晶體結構通過X射線衍射（XRD）進行表征。XRD圖譜中位于12.8°、21.3°、27.3°、28.5°和42.4°的衍射峰（圖2a）分別對應于Cs4PbBr6的（120）、（113）、（223）、（214）和（314）晶面[65]。由于Cs4PbBr6的含量較低，其存對納米顆粒的光電性能影響較弱。此外，CsPbBr3的（211）和（220）晶面分別出現(xiàn)在34.3°和38.9°處[65]。由于Sn2+的半徑（0.118 nm） [66，67]小于Pb2+ 的半徑（（0.119 nm） [68，69] ， 在CsSn0.5Pb0.5Br3晶體中[70–72]，XRD圖譜中位于15.0°、19.9°和30.2°的衍射峰分別對應于（101）、（121）和（202）晶面[73]。此外，位于22.3°、32.5°、37.6°、40.7°和45.6°的衍射峰分別對應于（110）、（200）、（211）、（220）和（221）晶面[65]。由于Sn2+的半徑小于Pb2+，先前分散在溶劑（環(huán)己烷）中的殘余0D Cs4PbBr6 納米晶體（ 簡稱NCs） 轉化為3DCsPbBr3 NCs [74] ， 這表明成功制備了CsSn0.5Pb0.5Br3 NCs [71]。

為了確認甲氨蝶呤-殼聚糖-葉酸（MTX-CSFA）成功錨定在CsSn0.5Pb0.5Br3納米晶體上，采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）進行表征（圖2b）。1530cm?1處出現(xiàn)的酰胺鍵（N―C＝O）峰確認了MTX和FA的羧基與CS的氨基之間形成了酰胺鍵[75]，表明MTX-CS-FA的成功合成。在MTX和FA分子中，C＝C―C＝O官能團出現(xiàn)在1637 cm?1處[76，77]，而CS的―OH官能團則在3200至3600 cm?1范圍內出現(xiàn)[76]。此外，在CsSn0.5Pb0.5Br3合成過程中，殘余的油酸（OA）和油胺（OAm）引起的―CH3官能團在2925 cm?1處出現(xiàn)[78]。這些特征性官能團證實了CsSn0.5Pb0.5Br3成功被MTX-CS-FA外殼包裹。

透射電子顯微鏡（TEM） 用于研究CsSn0.5Pb0.5Br3納米晶體在MTX-CS-FA殼層中的包覆情況。TEM圖像（ 圖2c） 顯示， 所制備的CsSn0.5Pb0.5Br3納米顆粒具有規(guī)則且均勻的矩形形態(tài)，粒徑范圍為5–20 nm。高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）分析（圖2d）顯示出清晰的晶格條紋，平均晶面間距為0.60 nm，與XRD圖譜（圖2a）計算得出的（101）晶面間距一致?？焖俑道锶~變換（FFT）圖像（圖2d插圖）和選區(qū)電子衍射（SAED）圖案（圖2e）證實了CsSn0.5Pb0.5Br3 的晶體結構。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒粒徑為20–40 nm，呈球形，表面均勻包覆有MTX-CS-FA殼層，形成核殼結構（圖2f，g）。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒的（110）和（200）晶面間距分別為0.38和0.27 nm，F(xiàn)FT和SAED結果（圖2g，h）均顯示出這一特征。這些結果表明MTX-CS-FA有機殼層保護了鈣鈦礦納米晶體的組成和晶體結構，與XRD（圖2a）和能量色散X射線光譜（EDS）結果（圖S1，Supporting Information）一致。

通過X 射線光電子能譜（XPS） 對CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在模擬腫瘤環(huán)境（H2O2）中的穩(wěn)定性進行評估（圖2i–k及圖S2） 。在CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA 和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA（H2O2） [79–81] 樣品中均觀察到特征的N 1s峰（400.4 ± 0.5 eV） （圖2i），而在CsSn0.5Pb0.5Br3樣品中未觀察到，這證實了在氧化性的H2O2腫瘤環(huán)境中，被MTX-CS-FA包覆的CsSn0.5Pb0.5Br3的穩(wěn)定性和未降解性（圖S3）。這些結果與FTIR （圖2b）分析一致。此外，Pb 4f峰（138.4± 0.5和143.3 ± 0.5 eV） [82]和Sn2+價態(tài)峰（486.1 ± 0.5eV） [83] （圖2j，k）顯示了極小的變化，表明Sn取代Pb不會顯著影響內在的鈣鈦礦結構，這與XRD分析（圖2a）和TEM結果（圖2g）一致。因此，成功合成了具有20–40 nm 粒徑的高度穩(wěn)定的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒，適用于后續(xù)的體內治療應用。

為了研究光電催化機制，采用光致發(fā)光（PL）和開爾文探針力顯微鏡（KPFM） 分析CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的光電性能和光電催化性能（圖3a及圖S4）。隨著浸泡時間的延長，PL強度增加，PL峰值從522 nm紅移至527 nm（0到228 d），表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在水中具有極佳的穩(wěn)定性。為了與新鮮狀態(tài)進行對比，在405 nm光照射下，使用體內成像系統(tǒng)（IVIS）對浸泡228 d后的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒在水溶液中的圖像進行捕捉（圖3b）。水浸納米顆粒顯示出較高的IVIS強度（更多紅色），與PL結果一致，表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒在水中的穩(wěn)定性可達228 d。由0至228 d期間的數(shù)據(jù)構建的直方圖表明產(chǎn)生了光激發(fā)的空穴和電子，這與PL結果一致。為了進一步研究CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的光電催化性能，采用KPFM測量暗態(tài)和405 nm光照射下的接觸電位差（CPD） （圖3c–f，圖S5）。局部表面電勢由尖端與樣品表面之間的CPD決定，取決于它們各自的功函數(shù)[84，85]。CPD的計算公式為CPD =（?_tip ? ?_sample）/（?e），其中?_tip和?_sample分別代表尖端和樣品的功函數(shù)，e是電子電荷。光激發(fā)產(chǎn)生的空穴和電子的增加導致CPD增加[86]。在暗態(tài)下，三維拓撲圖像中的原位CPD為0.28 V （圖3c），而在光照條件下（405 nm，lx = 491 W?m?2），CPD增加至0.44 V，表明光誘導的CPD增加了約0.16 eV，如圖3f 所示。CPD 的光誘導增加表明光照下CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒發(fā)生了電子-空穴對的分離[87]。在光照條件下，CPD比暗態(tài)下條件下增加了57%，證實了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒具有良好的光電催化特性。在光照后，這種電勢的增加可以歸因于電子和空穴的分離[88]，產(chǎn)生的電勢可作用于腫瘤細胞。生成的電子可以產(chǎn)生反應性ROS，而空穴可以氧化GSH，從而誘導腫瘤細胞死亡[53，89]。這些結果驗證了圖1中所示的機制， 表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒對腫瘤細胞的高效殺傷作用。

光電催化在CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA 納米顆粒的腫瘤治療中起著至關重要的作用，因此深入探討其機制極其重要。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒通過三條主要途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。腫瘤細胞通常具有較高水平的抗氧化系統(tǒng)成分，以對抗氧化應激損傷。GSH作為細胞抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤細胞中過表達[90]。已有研究表明，GSH的耗竭會破壞氧化還原平衡，導致細胞損傷甚至細胞凋亡[91] 。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在可見光激發(fā)下生成電子（e?）和空穴（h+） （圖4a）。腫瘤細胞中過度表達的GSH可以與空穴結合，導致GSH的持續(xù)消耗[54，92，93]。為了驗證這一機制，實驗設計了四個組：對照組（I）、MTX組（II） （3.04 μg?mL?1）、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA （III） 納米顆粒組（200μg?mL?1）和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA （IV）納米顆粒組（200 μg?mL?1），并分別用于處理小鼠肺癌細胞（LLC細胞）。采用流式細胞術測定處理后的細胞內GSH濃度[6，94]。結果顯示，對照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的熒光強度分別為92.4%、87.7%、85.4%和59.2%。與對照組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的熒光強度顯著降低了36% （圖4b，c），表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒通過產(chǎn)生的空穴氧化GSH，發(fā)揮抗腫瘤作用[95，96]。

ROS，包括超氧陰離子（O2?）、?OH和1O2，在富氧環(huán)境中依賴于電子轉移而產(chǎn)生。ROS水平的增加可導致蛋白質和DNA結構的破壞，最終導致細胞凋亡[7，97，98]。為了驗證CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒是否能夠生成ROS，使用二氫乙錠（DHE）共聚焦染色法檢測LLC細胞在不同處理后的細胞內ROS水平[99]。結果顯示，對照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（圖4d，e）的熒光強度分別為0、0、6.40和56.28。與對照組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的熒光強度顯著升高（P lt; 0.001） ， 表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒能夠生成大量的O2?。此外，采用電子自旋共振（ESR）光譜法定量分析主要類型的ROS，以檢測1O2。在405 nm可見光照射下，觀察到O2?、?OH和1O2的強烈特征信號，表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒生成O2?、?OH和1O2 （圖4f–h）。四氫葉酸（THFA）是嘌呤核苷酸和嘧啶脫氧核苷酸合成過程中的必需輔酶。甲氨蝶呤（MTX） 作為二氫葉酸還原酶（DHFR）的抑制劑，阻止二氫葉酸（DHFA）轉化為THFA [64，100]。嘌呤合成的阻斷會導致細胞周期停滯在S期[62，63]。此外，MTX抑制DHFR活性，從而阻斷GCH1/BH4/DHFR途徑，促進脂質過氧化并誘導凋亡[62–64]。為了研究CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒對THFA濃度的影響，采用ELISA法對LLC細胞進行處理后檢測THFA濃度。結果顯示，對照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CSFA納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（圖4i）的THFA濃度分別為1.56、0.95、1.02和0.29 ng?mL?1 。與對照組和MTX 組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的THFA濃度分別顯著下降了81.41% 和42.31% （P lt;0.001），表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒顯著增強了MTX化療的抗腫瘤效果[61，101]，導致腫瘤細胞的脂質過氧化和凋亡。

與對照組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒顯著提高了LLC細胞死亡率，達到83%（P lt; 0.001） （圖5a，b），證明這些納米顆粒引起LLC細胞的碎片化死亡（ 圖5a） 。為了評估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒對LLC細胞活性的影響，進行了CCK-8實驗。LLC細胞在不同濃度的納米顆粒（0–200 μg?mL?1）處理下[102]，200 μg?mL?1 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒處理后的LLC細胞活性顯著下降，僅為37% （圖5c）。這表明細胞活性（100%對比37%）下降了2.7倍，突出顯示了在這種濃度的納米顆粒下LLC細胞活性的顯著減少。

為了探討MTX在CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CSFA納米顆粒中的負載情況，采用UV-Vis分光光度法，結果表明藥物負載率為1.52 ± 0.03% （圖5d） [103]，證實MTX成功加載到納米顆粒中。為了評估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在不同pH值下的MTX釋放情況[104]，進行了體外釋放實驗。在pH = 8.4條件下，1.5 h后的累積MTX釋放量為51.17 ± 3.84% （圖5e），表明在腫瘤細胞典型的弱堿性環(huán)境中，MTX釋放顯著[61]。

為了評估FA介導的靶向效能，使用共聚焦顯微鏡[105] 觀察了LLC 細胞和小鼠肌母細胞（C2C12）在與CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA孵育6 h后的熒光強度。LLC細胞中的熒光強度是C2C12細胞的2.9倍（圖5f），證實了FA具有顯著的腫瘤細胞靶向效應[106] 。進一步通過共聚焦顯微鏡測量CsSn0.5Pb0.5Br3@CS和CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒在LLC細胞中的熒光強度， 結果表明，CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 組的熒光強度是CsSn0.5Pb0.5Br3@CS組的2.8倍（圖5f，g），進一步證明了FA的腫瘤細胞靶向效應[106，107]。

最后， 使用共聚焦顯微鏡檢測CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在LLC細胞中的熒光強度，以證明其細胞毒性。結果表明，在24 h孵育后，LLC細胞的溶酶體幾乎沒有熒光，表明溶酶體破裂[108]。溶酶體破裂不僅促進了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒從溶酶體的釋放，還促使MTX的釋放，從而導致腫瘤細胞凋亡（圖5f，g）。

總之，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在200 μg?mL?1濃度下表現(xiàn)出顯著的細胞毒性和精確的LLC細胞靶向效果。

為了進一步評估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的抗腫瘤效果，通過將LLC細胞注射到C57BL/6JNifdc小鼠皮下，構建了小鼠腫瘤模型。當腫瘤體積達到50 mm3，通過尾靜脈向荷瘤小鼠靜脈注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒，每5 d給藥一次，共計給藥3次。在第12 d，對荷瘤小鼠進行安樂死處理（圖6a）。

為了驗證CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的體內靶向效應，使用小動物IVIS系統(tǒng)評估了該納米顆粒在荷瘤小鼠中納米顆粒的熒光強度（圖6b，c） [94]。在注射前，皮下腫瘤區(qū)域幾乎無熒光信號。然而，注射24 h后，熒光強度較注射前增加了108%，充分證明了這些納米顆粒的精確靶向性[109]。

為了評估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒對皮下腫瘤的抗腫瘤效果，每隔2 d測量了荷瘤小鼠的腫瘤體積、重量和生存時間（以天為單位）（圖6d–f） [110]。結果顯示：第12 d，對照組的小鼠平均腫瘤體積為1785.44 mm3 ， 而注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的小鼠平均腫瘤體積僅為396.11 mm3，體積縮小了約4.51倍。同樣，對照組的小鼠平均腫瘤重量為2.31 g，而注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的小鼠平均腫瘤重量僅為0.52 g，減輕了約4.44倍。此外，接受CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒靜脈注射的小鼠生存時間可達27 d （圖S6、S7）。這些結果證實了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒能夠顯著抑制LLC皮下腫瘤的生長。

為了評估急性毒性[56，111]，測量了每組小鼠的體重（圖6g），結果顯示各組小鼠的體重沒有顯著變化。第12 d，對照組小鼠的平均體重為24.11 g，而注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的小鼠平均體重為22.50 g，表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒對小鼠的體重影響不大，提示其具有較低的急性毒性。

為了驗證CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的光催化治療和化療效果，進行了蘇木精-伊紅（Hamp;E）染色和末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的dUTP末端標記（TUNEL）染色（圖6h，i） [55]。Hamp;E染色圖像顯示，與對照組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒組的腫瘤細胞數(shù)量顯著減少。此外，TUNEL染色結果表明，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒組的凋亡細胞占總細胞的3.61%（P lt; 0.001） （圖6h）。

綜上所述， 體內腫瘤結果證實，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在可見光照射下表現(xiàn)出顯著的光電催化增強效應，有助于實現(xiàn)對腫瘤生長的有效靶向抑制。

為了評估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內的生物安全性和代謝分布，進行了組織病理學評估、常規(guī)血液檢查、肝腎功能檢測以及體重測量（圖7a）。通過對小鼠主要器官（包括心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）進行組織學分析，評估了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的非炎癥和非損傷特性[112，113]。

此外，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組與對照組在常規(guī)血液參數(shù)、肝腎功能或體重方面無顯著差異（圖7b），表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒具有良好的體內生物相容性。

為了進一步評估這些納米顆粒的安全性，使用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）檢測小鼠血清中的游離鉛濃度（圖7c） [5，56]。結果表明，在第5 d腫瘤負荷小鼠的血清游離鉛濃度為7.60 μg?L?1，處于正常安全范圍內。對照組的游離鉛血清濃度為3.62 μg?L?1，兩組之間無顯著差異（P gt; 0.05）。這些濃度明顯低于美國疾病控制與預防中心（CDC）規(guī)定的參考血鉛水平（50 μg?L?1） [114] ， 表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內具有良好的生物安全性。

隨后，采用IVIS系統(tǒng)探測CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在腫瘤負荷小鼠組織和糞便中的熒光強度，進一步分析其體內代謝分布（圖7d） [115]。注射后24 h，腫瘤和肝臟的熒光強度分別為26.6 × 106和413 × 106，而48 h時腎臟的熒光強度為28.9 × 106。值得注意的是，120 h后，糞便中的熒光強度達到了81.4 × 106 （圖7e），而其他器官的熒光信號則完全消失。這證明了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒能夠選擇性地靶向腫瘤細胞，在肝臟和腎臟代謝后最終通過糞便排出小鼠體外。

這些結果表明，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內具有良好的生物安全性，并能以熒光鈣鈦礦的形式從小鼠體內排出。MTXCS-FA外殼有效地防止了PeNCs在水中的降解，并防止了金屬離子向血液中的釋放。

4 結論

我們成功地將CsSn0.5Pb0.5Br3與MTX-CS-FA復合物結合， 形成了具有高度水穩(wěn)定性的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒。這些創(chuàng)新性納米顆粒在腫瘤治療中表現(xiàn)出卓越的光電催化活性，主要歸功于其對腫瘤細胞的精準靶向作用、生物成像能力以及誘導癌細胞凋亡的能力。在可見光照射下，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒通過電子激發(fā)產(chǎn)生ROS，通過生成的空穴氧化作用消除過表達的GSH，并通過MTX抑制DHFR的活性。這些機制的協(xié)同作用促進了脂質過氧化，最終導致細胞凋亡。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在細胞和體內動物模型中均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。此外，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CSFA納米顆粒在體內表現(xiàn)出良好的生物安全性，并且可以在不降解的情況下從小鼠體內完整排出，保持其鈣鈦礦量子點結構的完整性。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒具備光電催化與化療的雙重特性，有望成為腫瘤治療領域的一種創(chuàng)新方法。

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