關(guān)鍵詞二甲雙胍；非酒精性脂肪性肝炎；肝損傷；脂代謝；肝纖維化；PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis，NASH）是在沒有酒精濫用的情況下發(fā)展起來的晚期脂肪性肝病，也是最常見的慢性肝病[1]。根據(jù)“多重打擊”理論可知，肝脂肪變性使肝細(xì)胞對(duì)其他打擊敏感，導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷和纖維化，進(jìn)而發(fā)展為NASH[2]。運(yùn)動(dòng)和飲食改變是NASH常見的輔助性治療方式，但效果一般，目前尚無治療NASH的特效藥物。因此，迫切需要開發(fā)安全有效的藥物用于治療NASH。

二甲雙胍（metformin，Met）是治療2型糖尿病的一線藥物[3]，相關(guān)研究顯示，Met可通過調(diào)控非酒精性脂肪性肝病大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌的豐度，改善脂代謝和肝損傷[4]；還可通過調(diào)控AMP活化的蛋白質(zhì)激酶-過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α軸抑制炎癥反應(yīng)，減輕敗血癥小鼠的肝損傷[5]。此外臨床研究顯示，Met聯(lián)合辛伐他汀可改善非酒精性脂肪性肝病合并2型糖尿病患者的脂代謝水平[6]。由此可見，Met在治療肝病方面顯示出巨大潛力。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB，PI3K/AKT）信號(hào)通路與非酒精性脂肪性肝病中的脂代謝和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，研究表明，調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞壞死、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝損傷[7]。血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）是間質(zhì)細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）的生長(zhǎng)刺激因子，過表達(dá)的PDGF能夠促進(jìn)膠原的產(chǎn)生和沉積，而降低PDGF水平能夠有效地改善肝組織的纖維化[8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路活性，可影響代謝相關(guān)脂肪性肝病小鼠的肝脂肪變性和纖維化發(fā)展[9]。目前，尚不清楚Met能否通過調(diào)控PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)NASH的改善作用?；诖?，本研究通過構(gòu)建NASH大鼠模型，探究Met調(diào)控PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路對(duì)NASH大鼠肝損傷的影響，以期為Met治療NASH提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1645050型電泳儀（廣州維基科技有限公司）、GenoSensS2Pro型一體式凝膠成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）、卓越400型全自動(dòng)生化分析儀（西安天隆科技有限公司）、SpectraMaxi3x型多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、Ⅸ3-ICSI/IMSI型倒置熒光顯微鏡[儀景通光學(xué)科技（上海）有限公司]、ES-300型組織包埋機(jī)（上海聚慕醫(yī)療器械有限公司）、CX23型光學(xué)顯微鏡[桂寧（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

Met（批號(hào)657-24-9，純度≥99.98%）購自美國(guó)MCE公司；PI3K激活劑740Y-P（批號(hào)Y648850）購自阿拉丁控股集團(tuán)有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)ZY7070）購自上海澤葉生物科技有限公司；油紅O染色試劑盒（批號(hào)PCM-K-003）購自上海中喬新舟生物科技有限公司；Masson染色試劑盒（批號(hào)60532ES58）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（totalcholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-densitylipoproteincholesterol，LDL-C）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanineaminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartateaminotransferase，AST）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）試劑盒（批號(hào)分別為BC0620、BC1980、BC5330、BC1550、BC1560、SEKM-0007、SEKM-0034）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔源PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）、PDGF、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號(hào)分別為ab302959、ab304351、ab8805、ab8933、ab178409、ab184787、ab8226、ab302644）均購自英國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究動(dòng)物為SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重為（190±20）g，購自武漢有度生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（鄂）2021-0025。將大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于通風(fēng)鼠籠中（相對(duì)濕度60%，溫度25℃，12h明暗循環(huán)）。本研究經(jīng)武漢有度生物科技有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理審查委員會(huì)審核批準(zhǔn)，倫理批號(hào)為2021-11-158。

2 方法

2.1 造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，分為造模組（n＝63）和對(duì)照組（Control組，n＝15）。造模組大鼠參考文獻(xiàn)方法建立NASH模型[10]：大鼠以高糖高脂飲食[含20%蛋白質(zhì)、35%碳水化合物（包括18%蔗糖、10%麥芽糖糊精、7%淀粉）、45%脂質(zhì)]飼喂，Control組大鼠以基礎(chǔ)日糧飼喂，6周后，隨機(jī)挑選3只造模組大鼠與3只Control組大鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。若造模組大鼠相關(guān)指標(biāo)（肝指數(shù)、組織病理變化、血清炎癥因子水平）顯著異于Control組，則視為造模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的剩余大鼠隨機(jī)分為模型組（Model組）、Met低劑量組（Met-L組）、Met中劑量組（Met-M組）、Met高劑量組（Met-H組）、高劑量Met+PI3K激活劑組（Met-H+740Y-P組），每組12只。Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠分別灌胃100、200、400mg/kg的Met[11]，每天1次，連續(xù)6周。Met-H+740Y-P組大鼠在每次灌胃400mg/kgMet后，尾靜脈注射50mg/kg的740Y-P[12]。Control組和Model組大鼠除灌胃等體積的生理鹽水替代Met外，其他處理方式同藥物干預(yù)組。

2.3 體重及肝指數(shù)檢測(cè)

末次給藥后對(duì)所有大鼠禁食不禁水12h，稱重后腹腔注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉大鼠并進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，血樣保存?zhèn)溆?；處死大鼠后，取肝臟并稱重，計(jì)算肝指數(shù)（肝指數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體重×100%）；肝臟稱重結(jié)束后，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血清中炎癥因子及生化指標(biāo)水平檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下血樣以3000r/min離心15min，取上層血清備用；一部分血清用于檢測(cè)炎癥因子（IL-6、TNF-α）水平，一部分血清用于檢測(cè)脂代謝（TC、TG、LDL-C）和肝功能（AST、ALT）指標(biāo)水平，具體方法按試劑盒說明書操作。

2.5 肝組織中炎癥因子水平檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下肝組織適量，加入預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行勻漿，按照試劑盒說明書方法檢測(cè)大鼠肝組織中炎癥因子（IL-6、TNF-α）水平。

2.6 肝組織病理變化觀察

各組隨機(jī)取6只大鼠的部分肝組織（剩余部分用于脂質(zhì)沉積檢測(cè)），置于10%甲醛溶液中固定24h；經(jīng)脫水、包埋、切片（5μm）后，取部分切片（剩余切片用于纖維化檢測(cè)）進(jìn)行HE染色，封片后，采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠肝組織病理變化并進(jìn)行非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)度評(píng)分（non-alcoholicfattyliverdiseaseactivityscore，NAS）[13]。

2.7 肝組織脂質(zhì)沉積觀察

取“2.6”項(xiàng)下各組6只大鼠剩余肝組織適量，經(jīng)包埋、切片（4μm）、油紅O染色、60%異丙醇沖洗后，以蘇木精復(fù)染，封片后，采用倒置熒光顯微鏡觀察大鼠肝組織脂質(zhì)沉積情況，并采用Image-proPlus6.0軟件分析油紅O陽性染色面積占比。

2.8 肝組織纖維化觀察

取“2.6”項(xiàng)下剩余肝組織切片，置于60℃條件下烤片過夜，再以二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水；經(jīng)Masson染料依次染色后，以中性樹膠封片，采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠肝組織纖維化情況，并采用Image-proPlus6.0軟件計(jì)算膠原沉積分?jǐn)?shù)（膠原沉積分?jǐn)?shù)＝視野下膠原纖維化面積/總面積×100%）。

2.9 肝組織中PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)

取各組另外6只大鼠的肝組織適量，加入預(yù)冷的蛋白裂解液充分反應(yīng)，離心取上清液，并采用BCA法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。蛋白經(jīng)變性處理后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；以5%脫脂奶粉封閉后，加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、PDGF、Caspase-3、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1000）在4℃下孵育過夜；以TBST洗膜后，加入二抗（稀釋比例為1∶1000）室溫孵育1h。經(jīng)ECL顯影后，進(jìn)行凝膠成像，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示蛋白的表達(dá)水平，以p-PI3K與PI3K、p-AKT與AKT蛋白的表達(dá)水平比值表示PI3K、AKT蛋白的磷酸化水平。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料（均符合正態(tài)分布）以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體重和肝指數(shù)檢測(cè)結(jié)果

如表1所示，相較于Control組，Model組大鼠體重和肝指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠體重和肝指數(shù)均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠體重和肝指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。

3.2 大鼠血清中生化指標(biāo)水平檢測(cè)結(jié)果

如表2所示，相較于Control組，Model組大鼠血清中脂代謝和肝功能指標(biāo)水平均顯著升高（P＜0.05）；相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠血清中脂代謝和肝功能指標(biāo)水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠血清中脂代謝和肝功能指標(biāo)水平均顯著升高（P＜0.05）。

3.3 大鼠血清和肝組織中炎癥因子水平檢測(cè)結(jié)果

如表3所示，相較于Control組，Model組大鼠血清和肝組織中IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠血清和肝組織中IL-6、TNF-α水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠血清和肝組織中IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）

3.4 大鼠肝組織病理變化觀察結(jié)果

如圖1所示，Control組大鼠肝細(xì)胞分布均勻、排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整，NAS為（0.17±0.01）分。Model組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)可見脂肪空泡，肝細(xì)胞排列紊亂且出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，NAS[（6.83±0.72）分]相較于Control組顯著升高（P＜0.05）。Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠相較于Model組，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡數(shù)均明顯減少，肝細(xì)胞均有序排列，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均減輕，NAS[分別為（5.16±0.58）、（3.83±0.45）、（2.50±0.20）分]均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。Met-H+740Y-P組大鼠相較于Met-H組，肝組織病理損傷更重，NAS[（6.33±0.65）分]顯著升高（P＜0.05）。

3.5 大鼠肝組織脂質(zhì)沉積觀察結(jié)果

如圖2所示，Control組大鼠肝組織含有少量脂滴，油紅O陽性染色面積占比為（1.50±0.10）%。相較于Control組，Model組大鼠肝組織富含脂滴，呈鮮紅色，油紅O陽性染色面積占比[（13.33±1.21）%]顯著升高（P＜0.05）。相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠肝組織脂滴數(shù)量均減少，油紅O陽性染色面積占比[分別為（10.67±1.04）%、（7.34±0.68）%、（4.83±0.37）%]均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠肝組織脂滴數(shù)量增多，油紅O陽性染色面積占比[（11.17±0.99）%]顯著升高（P＜0.05）。

3.6 大鼠肝組織纖維化觀察結(jié)果

如圖3所示，Control組大鼠肝組織無纖維化現(xiàn)象，膠原沉積分?jǐn)?shù)為0。相較于Control組，Model組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯藍(lán)色膠原纖維沉積，膠原沉積分?jǐn)?shù)[（15.21±1.42）%]顯著升高（P＜0.05）。相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠肝組織纖維化程度均減輕，膠原沉積分?jǐn)?shù)[分別為（12.06±1.15）%、（9.55±1.00）%、（6.73±0.54）%]均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠肝組織纖維化程度加重，膠原沉積分?jǐn)?shù)[（14.45±1.37）%]顯著升高（P＜0.05）。

3.7 大鼠肝組織中PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

如圖4、表4所示，相較于Control組，Model組大鼠肝組織中PI3K、AKT蛋白磷酸化水平和PDGF、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。相較于Model組，Met-L組、Met-M組、Met-H組大鼠肝組織中PI3K、AKT蛋白磷酸化水平和PDGF、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。相較于Met-H組，Met-H+740Y-P組大鼠肝組織中PI3K、AKT蛋白磷酸化水平和PDGF、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

隨著人們飲食和作息等生活方式的改變，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病率不斷上升，且并發(fā)癥復(fù)雜多樣。非酒精性脂肪性肝病經(jīng)歷了從單純性脂肪變性逐漸發(fā)展為NASH的過程，整個(gè)過程的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，包括脂代謝失調(diào)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和腸道微生物群失衡。Met作為抗糖尿病藥物，已被廣泛使用，近年來研究表明，Met不僅具有抗炎作用[14]，還可調(diào)控非酒精性脂肪性肝病的脂代謝[15]。由此可見，Met可能對(duì)NASH具有改善作用。本研究通過構(gòu)建NASH大鼠模型發(fā)現(xiàn)，Met能有效降低NASH大鼠肝指數(shù)，并減輕肝損傷。

體重減輕對(duì)于改善NASH至關(guān)重要，相關(guān)文獻(xiàn)指出，患者體重降低4%左右可以減輕肝脂肪變性現(xiàn)象[16]。TC、TG和LDL-C是血脂的組成部分，也是反映脂代謝的重要指標(biāo)[17]。AST和ALT是反映肝功能的重要指標(biāo)，當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)或氧化應(yīng)激時(shí)，肝細(xì)胞中的AST和ALT就會(huì)被釋放入血[18]。本研究結(jié)果顯示，NASH大鼠體重和血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT水平均顯著升高，提示NASH大鼠脂代謝紊亂、肝功能異常；經(jīng)Met干預(yù)后，大鼠體重和上述指標(biāo)水平均顯著降低，表明Met能夠調(diào)節(jié)脂代謝、改善肝損傷。此外，NASH與肝臟中的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，一些炎癥因子可通過作用于肝臟，誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和肝纖維化[19]。IL-6是炎癥反應(yīng)的直接促進(jìn)因子，其可通過促進(jìn)脂質(zhì)在肝臟中的集聚影響脂代謝，最終導(dǎo)致脂肪肝形成；TNF-α由巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生，可直接促進(jìn)脂質(zhì)增加，還可加速其他炎癥因子的釋放，最終造成肝組織損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，Met能有效降低NASH大鼠血清和肝組織中的炎癥因子水平，提示Met具有抗炎作用，這與Feng等[20]的研究結(jié)論一致。

研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路可改善非酒精性脂肪性肝病大鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[21]。PDGF在各種細(xì)胞反應(yīng)（包括增殖和肌動(dòng)蛋白重組）中起著關(guān)鍵作用，其可影響肝臟、腎臟等器官的纖維化進(jìn)展[22]。PDGF的高表達(dá)可促進(jìn)膠原的產(chǎn)生和沉積[23]。Ye等[9]研究指出，PI3K、AKT、PDGF蛋白表達(dá)量的變化與脂肪性肝病小鼠的肝脂肪變性和纖維化發(fā)展有關(guān)。此外抑制肝細(xì)胞凋亡可以改善NASH相關(guān)的肝損傷，而Caspase-3是凋亡途徑的調(diào)節(jié)因子[24]。本研究結(jié)果顯示，NASH大鼠肝組織中PI3K、AKT蛋白磷酸化水平和PDGF、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高，這提示NASH大鼠肝損傷與PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白異常表達(dá)有關(guān)。經(jīng)Met干預(yù)后，大鼠肝組織中上述指標(biāo)水平均逆轉(zhuǎn)，由此推測(cè)，Met可能通過抑制PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路活性，發(fā)揮改善NASH的作用。為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究在高劑量Met干預(yù)治療的基礎(chǔ)上，尾靜脈注射PI3K激活劑740Y-P，結(jié)果顯示，Met對(duì)PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路的抑制作用可被740Y-P逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，Met可改善NASH大鼠肝損傷，減輕炎癥反應(yīng)和肝纖維化，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/PDGF信號(hào)通路活性有關(guān)。