摘要：獼猴桃是一種多年生藤本植物，其雌雄異株的特性使得性別鑒別在其育種過程中具有重要意義.本文對三種已開發(fā)的獼猴桃性別鑒定分子標(biāo)記進(jìn)行了收集與評估，分別為SmY1、S1032和FrBy.結(jié)果表明，SmY1和FrBy對雄株鑒定準(zhǔn)確率為25%，雌株鑒定準(zhǔn)確率為100%，S1032在供試雌雄樣本中均無法擴(kuò)增出特異性條帶，未能表現(xiàn)出明顯的性別特異性.本研究設(shè)計并篩選出一對新的引物Fr-1，通過對89份已知性別的獼猴桃樣本進(jìn)行雌雄株鑒定，準(zhǔn)確率達(dá)100%.且對于實生幼苗性別鑒定時能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定的條帶，具有實際應(yīng)用價值.Fr-1標(biāo)記鑒定獼猴桃性別準(zhǔn)確高效，可在育種實踐中得到廣泛應(yīng)用.關(guān)鍵詞：獼猴桃；雌雄株；性別鑒定；分子標(biāo)記

中圖分類號：S663.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19907/j.0490-6756.250025

1引言

獼猴桃為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（ActinidiaLindl.）下的藤本植物，屬于多年生落葉或半落葉木本果樹.中國作為獼猴桃的原產(chǎn)地，擁有豐富的獼猴桃資源［1］.在我國，栽培的獼猴桃品種以中華獼猴桃、美味獼猴桃和軟棗獼猴桃為主，此外，還種植毛花獼猴桃及大籽獼猴桃等其他類型［2］.獼猴桃屬植物因其具備雌雄異株及實生苗童期較長等特性，這些特點使得采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行育種時，常常面臨育種效率較低和周期較長的問題［3］.而獼猴桃性別鑒定技術(shù)的應(yīng)用，特別是在早期實生苗篩選中的使用，它不僅能有效縮短育種周期，降低成本，還能大大提高育種效率，具有重要的實踐意義［4］.近期，研究者在中華獼猴桃中成功鑒定并表征了兩個Y連鎖的性別決定基因，分別為SyGl［5］和FrBy［6］，并揭示了獼猴桃Y染色體的起源與進(jìn)化［7］，為深入理解獼猴桃性別的分子機(jī)制提供了重要理論依據(jù).然而，盡管這些研究為性別遺傳基礎(chǔ)的解析提供了重要線索，但在實際應(yīng)用中，獼猴桃性別的早期辨別方法仍顯不足.解決這一問題不僅能提升獼猴桃的種植管理效率，也為遺傳改良和育種策略優(yōu)化提供了新的研究方向.

目前，已有研究嘗試通過形態(tài)觀察法［8］、生理生化法［9］和同工酶的酶譜比較法［10］進(jìn)行性別鑒定.然而，這些方法常受環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致準(zhǔn)確性較低，且缺乏普遍適用性.隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)逐漸成為鑒定獼猴桃性別的主要手段［4］.利用DNA分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定的方法主要包括RAPD標(biāo)記［11］、AFLP標(biāo)記［12］、SSR標(biāo)記［13］、SRAP標(biāo)記［14］、SCAR標(biāo)記［15］等.在不同種類的獼猴桃鑒定過程中，由于其種類差異，采用的鑒定方法可能存在一定的差異性.因此，針對特定獼猴桃種類選擇合適的鑒定方法顯得尤為重要.由于不同獼猴桃品種之間的遺傳差異，采用的鑒定方法也會存在差異.因此，針對特定獼猴桃種類選擇合適的鑒定方法尤為重要.同時，對于已篩選和成功鑒定的標(biāo)記，其通用性驗證也是提升鑒定結(jié)果可靠性的重要步驟，并為相關(guān)研究提供方法借鑒.

前人有關(guān)DNA分子標(biāo)記研究主要集中在獼猴桃性別分子標(biāo)記的開發(fā)和驗證.Fraser等［16］發(fā)現(xiàn)了SmY標(biāo)記，該標(biāo)記是雄性連鎖標(biāo)記，定位于染色體的性別決定區(qū)域，為獼猴桃性別鑒定提供了重要參考.郭丹丹［17］驗證了SmY1標(biāo)記在中華獼猴桃和軟棗獼猴桃中的適用性，發(fā)現(xiàn)SmY1在中華獼猴桃中的性別鑒定效果較好，但在軟棗獼猴桃中效果不理想.姚春潮等［18］則采用RAPD技術(shù)獲得了與雄性基因連鎖的S1032標(biāo)記，并驗證了其適用性，結(jié)果表明該標(biāo)記能夠有效鑒定雄性個體，但在部分雌性個體中表現(xiàn)出一定的特異性波動.

本研究共采集113株獼猴桃樣本，在對已有研究中獼猴桃雌雄分子標(biāo)記進(jìn)行全面評估與品種驗證后，本文設(shè)計了6對引物，并篩選出最具代表性和適用性的分子標(biāo)記，同時，在不同地品種中進(jìn)行通用性驗證，驗證該標(biāo)記能否有效區(qū)分獼猴桃的雌雄株，從而實現(xiàn)準(zhǔn)確地性別鑒定.本文旨在篩選出一種具有廣泛適用性、鑒定準(zhǔn)確的分子標(biāo)記，進(jìn)而優(yōu)化獼猴桃性別鑒定技術(shù).通過提升性別鑒定的精確性與效率，能夠為獼猴桃的早期性別鑒定提供高效技術(shù)支持，從而提高育種效率，并為后續(xù)育種與生產(chǎn)提供理論依據(jù).

2材料與方法

2.1材料

2023年6月于四川省自然資源科學(xué)研究院四川省德陽市廣濟(jì)鎮(zhèn)獼猴桃科研基地共采集113株獼猴桃材料，列于表1.本研究采集了89株性別已知的獼猴桃樣本，包括中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴桃、毛花獼猴桃和大籽獼猴桃，樣本編號為1至89.同時，采集24株未知性別的‘華紅4號’實生幼苗，列為序號90～113.采集過程中，選取嫩葉進(jìn)行處理，隨后通過液氮速凍保存，將樣本帶回實驗室后，將材料保存于-80℃冰箱中備用.

2.2方法

2.2.1DNA提取 在液氮中研磨植物組織后，通過BIOFIT植物基因組DNA提取試劑盒從獼猴桃幼嫩葉片中提取DNA.提取后，通過紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳測量DNA的質(zhì)量和純度，保存于-80℃冰箱備用.

2.2.2獼猴桃性別分子標(biāo)記收集 一共收集了3種已有研究的獼猴桃性別相關(guān)分子標(biāo)記，并進(jìn)行了匯總，詳見表2.

2.2.3引物設(shè)計與合成 參考Akagi團(tuán)隊的研究［5］，通過Primer3.0和NCBIPrimer對FrBy的基因序列比對，設(shè)計了22對引物，并委托擎科生物公司根據(jù)設(shè)計序列進(jìn)行合成.引物列表見附錄表1.經(jīng)過篩選，最終確定了6對引物，具體信息見表3.

2.2.4 PCR擴(kuò)增體系 通過已知性別的試驗材料對引物進(jìn)行初步篩選，再擴(kuò)大樣本進(jìn)行了二次篩選，在所有樣品中，挑選出擴(kuò)增效果較為理想、條帶清晰且重復(fù)性較好的引物，用于后續(xù)所有樣本的擴(kuò)增工作.根據(jù)廠家給定的引物參考退火溫度進(jìn)行上下浮動，設(shè)置幾個梯度，重復(fù)3次試驗.根據(jù)3次試驗結(jié)果，選擇穩(wěn)定的退火溫度作為引物的最適溫度.

3結(jié)果與分析

3.1 DNA的提取

對113份采集的獼猴桃樣本進(jìn)行DNA提取，部分樣本的提結(jié)果如圖1，泳道中未觀察到明顯的拖尾現(xiàn)象，表明提取的基因組DNA完整，濃度較高，能夠滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增的需求.

3.2 SmY1標(biāo)記擴(kuò)增體系的構(gòu)建及驗證

對8份獼猴桃樣品進(jìn)行了SmY1標(biāo)記的擴(kuò)增，其中前4份為雌性植株，后4份為雄性植株，結(jié)果如圖2.在前4份樣品中，都未能擴(kuò)增出特異性條帶；而在后4份樣品中，僅有24號樣品成功擴(kuò)增出特異性條帶，同時該條帶大小與預(yù)期相符.這表明，該標(biāo)記在雄性樣品性別鑒定中的準(zhǔn)確率為25%.這一結(jié)果表明，SmY1標(biāo)記的擴(kuò)增效果較差，這一結(jié)果與之前報道的SmY1分子標(biāo)記鑒定結(jié)果不相符［15］.因此，SmY1標(biāo)記引物缺乏特異性，無法用于獼猴桃性別鑒定.

3.3 S1032標(biāo)記擴(kuò)增體系的構(gòu)建及驗證

對8份獼猴桃樣品進(jìn)行了S1032標(biāo)記的擴(kuò)增，同樣，前4份樣品為雌性植株，后4份樣品為雄性植株，結(jié)果如圖3.在4份雌性樣品中和4份雄性樣品中，均未擴(kuò)增出特異性條帶.S1032無法作為雄性特異標(biāo)記，此結(jié)果與已有研究不一致［18］.

3.4 FrBy標(biāo)記擴(kuò)增體系的構(gòu)建及驗證

本文對FrBy標(biāo)記在8份獼猴桃雌雄樣品中進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其中前4份為雌性植株，后4份為雄性植株，實驗結(jié)果如圖4所示.在4份雌性樣品中，均未擴(kuò)增出特異性條帶；而在4份雄性樣品中，僅25號獼猴桃樣品成功擴(kuò)增出與預(yù)期一致的特異性條帶.綜合分析結(jié)果顯示，F(xiàn)rBy標(biāo)記在本實驗中表現(xiàn)不佳，未能在所有樣品中穩(wěn)定擴(kuò)增出具有性別特異性的條帶.因此，F(xiàn)rBy標(biāo)記不具備足夠的性別鑒定特異性，無法廣泛應(yīng)用于獼猴桃性別鑒定.

3.5 Fr標(biāo)記擴(kuò)增體系的構(gòu)建及驗證

通過使用Primer3.0和NCBIPrimer對FrBy基因序列進(jìn)行比對，本文設(shè)計了22對引物，命名為Fr系列.經(jīng)過篩選，發(fā)現(xiàn)其中18對引物出現(xiàn)了條帶不清晰或無條帶的情況，最終選定6對引物用于后續(xù)實驗.為了評估這些引物的擴(kuò)增效果，我們分別對8份獼猴桃樣品進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其中前4份為雌性植株，后4份為雄性植株，實驗結(jié)果如圖5所示.

從圖中可以看出，F(xiàn)r系列中的6對引物在擴(kuò)增后均出現(xiàn)了1至7條片段，且DNA片段的大小范圍為100～1000bp.具體而言，F(xiàn)r-1引物在4份雌性樣品中未能擴(kuò)增出特異性條帶，而在4份雄性樣品中均擴(kuò)增出了約550bp的特異性條帶，表明Fr-1能夠有效區(qū)分雌雄植株，因此在后續(xù)實驗中將選用Fr-1進(jìn)行性別鑒定擴(kuò)增.相比之下，F(xiàn)r-2、Fr-3、Fr-4、Fr-5和Fr-6在8份樣品中均擴(kuò)增出多條帶，且條帶模式無規(guī)律可循，因此不再作為后續(xù)實驗的候選引物.

3.6 Fr-1標(biāo)記在所有樣本的進(jìn)一步驗證

為了進(jìn)一步驗證Fr-1是否能夠進(jìn)行獼猴桃性別鑒定，對所采集的72份中華獼猴桃和美味獼猴桃樣品進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖6.從圖中可以看出，對48份雌性樣品進(jìn)行擴(kuò)增時，均無特異性條帶；但對剩余24份獼猴桃雄性樣品進(jìn)行擴(kuò)增時，都成功擴(kuò)增出了大約550bp的特異性條帶.由此得知，F(xiàn)r-1對獼猴桃性別鑒定準(zhǔn)確率高達(dá)100%，在中華獼猴桃和美味獼猴桃中得到充分驗證，能夠用于獼猴桃性別的鑒定.

3.7 Fr-1標(biāo)記在不同品種中的通用性驗證

考慮到設(shè)計的引物應(yīng)具有普遍適用性，接下來將Fr-1標(biāo)記應(yīng)用于其他品種獼猴桃植株和實生幼苗的鑒定，進(jìn)行通用性驗證，樣本列于表1，結(jié)果如圖7.分析顯示，在其他品種的6個獼猴桃雄性樣本中，均能夠擴(kuò)增出特異性的條帶；而在剩余13個雌性樣本中均未擴(kuò)增出條帶.這表明Fr-1標(biāo)記能在其他品種的雄性樣本中成功擴(kuò)增穩(wěn)定的條帶，而在雌性樣本中均無法擴(kuò)增出條帶，且條帶大小與預(yù)期大小相同，與前文得到的結(jié)果相符，表明Fr-1能夠精準(zhǔn)地用于性別鑒定.但針對不同品種的通用性驗證仍需下一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗證.

3.8應(yīng)用Fr-1標(biāo)記進(jìn)行實生幼苗鑒定

‘華紅4號’是世界首個四倍體紅肉中華獼猴桃雌性品種［19］，將Fr-1標(biāo)記應(yīng)用于‘華紅4號’實生幼苗的鑒定，樣本信息列于表1，鑒定結(jié)果如圖8.由圖可知，在24份實生苗樣品中，有12份樣品成功擴(kuò)增出特異性條帶，且條帶大小與預(yù)期大小相同.結(jié)果表明，在實生幼苗中，F(xiàn)r-1標(biāo)記能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定的特異性條帶，在實生苗的鑒定中具有應(yīng)用價值，針對不同品種的實生苗還需進(jìn)行進(jìn)一步的田間試驗驗證.

4討論

獼猴桃作為雌雄異株且果實具有較高經(jīng)濟(jì)價值的作物，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展中，雌株的經(jīng)濟(jì)價值和市場需求顯著高于雄株.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，獼猴桃性別鑒定逐漸從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)識別向分子標(biāo)記識別轉(zhuǎn)變，尤其是通過引物設(shè)計和分子標(biāo)記，能夠在獼猴桃的早期生長階段實現(xiàn)準(zhǔn)確的性別鑒定，為后續(xù)育種工作提供了重要支持.依據(jù)前人研究，我們對SmY1標(biāo)記進(jìn)行了驗證.張坤等［20］在對中華獼猴桃進(jìn)行性別鑒定的研究中，發(fā)現(xiàn)SmY1標(biāo)記在鑒定準(zhǔn)確性方面表現(xiàn)出較高的可靠性.本文的結(jié)果與之相似，具體表現(xiàn)為SmY1標(biāo)記在中華獼猴桃中的雌株鑒定準(zhǔn)確率為100%，而對雄株的鑒定準(zhǔn)確率為50%.此外，郭丹丹［17］的研究也指出，SmY1標(biāo)記在不同獼猴桃品種中的表現(xiàn)存在差異，該標(biāo)記在軟棗獼猴桃中的效果較差.而在本研究中，SmY1標(biāo)記在美味獼猴桃中的鑒定效果同樣不理想.這表明該標(biāo)記的適用性極易受到獼猴桃品種的影響.姚春潮等［18］發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記S1032能夠有效鑒定獼猴桃中的雄性個體，但在部分雌性個體中也出現(xiàn)了條帶，表明該標(biāo)記在雌性樣本中的特異性存在一定波動.在本文驗證過程中，該標(biāo)記無法擴(kuò)增出相應(yīng)特異性條帶.為此，后續(xù)可通過優(yōu)化體系、調(diào)整退火溫度等方式提高該標(biāo)記的準(zhǔn)確性.盡管Akagi等［6］提出FrBy標(biāo)記作為性別決定因子的候選基因，本文在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其準(zhǔn)確性較低.這一差異可能與樣本量、驗證方法或?qū)嶒灜h(huán)境的不同有關(guān)，建議在后續(xù)研究中，研究人員應(yīng)擴(kuò)大樣本量并優(yōu)化實驗設(shè)計，以獲得更為可靠的結(jié)果，提高FrBy標(biāo)記在獼猴桃性別鑒定中的廣泛適用性.

在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究評估了現(xiàn)有分子標(biāo)記的適用性，并依托FrBy的基因序列設(shè)計了一系列引物.經(jīng)過篩選，本文確定了一對雄性特異性引物Fr-1，并證明其能夠進(jìn)行獼猴桃性別鑒定.實驗結(jié)果表明，F(xiàn)r-1引物具備較好的重復(fù)性，能夠通過PCR擴(kuò)增快速、準(zhǔn)確地識別獼猴桃的性別.進(jìn)一步的通用性驗證結(jié)果顯示，F(xiàn)r-1引物能夠高效、準(zhǔn)確地區(qū)分不同品種獼猴桃雌雄株，且在驗證過程中誤差接近零，表明該引物具有高度的可靠性和可信度.同時，F(xiàn)r-1標(biāo)記能夠在‘華紅4號’實生幼苗中擴(kuò)增出特異性條帶，具有實際應(yīng)用價值，后期還可擴(kuò)大樣本進(jìn)行田間試驗，確保其準(zhǔn)確率.總的來說，F(xiàn)r-1引物不僅具有較強(qiáng)的通用性，且具備廣泛的田間應(yīng)用價值，為獼猴桃性別鑒定提供了一個高效、可靠的工具，并為獼猴桃品種的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)利用奠定了技術(shù)基礎(chǔ).