摘要： 本研究旨在設(shè)計(jì)針對(duì)牛鏈球菌和牛球蟲的聯(lián)合多表位疫苗. 通過生物信息學(xué)篩選兩種病原體的T/B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位基因序列，串聯(lián)拼接后引入霍亂毒素B 亞單位（CTB）作為分子內(nèi)佐劑，設(shè)計(jì)得到多表位重組抗原CARR（CTB-AMA1-RodA-RodA）. 經(jīng)密碼子優(yōu)化后，將CARR 基因克隆至pET28a（+）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），成功構(gòu)建了穩(wěn)定的表達(dá)工程菌. SDS-PAGE 顯示工程菌可高效表達(dá)約90 kDa 目標(biāo)蛋白，Western blot 驗(yàn)證表達(dá)蛋白能與抗CTB 及抗牛鏈球菌抗體特異性結(jié)合，且20代內(nèi)工程菌質(zhì)粒保有率超80%. 純化后的CARR蛋白免疫蛋雞，7 wk 后ELISA 檢測(cè)顯示特異性IgY 抗體效價(jià)達(dá)1∶12800. 體外中和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該抗體顯著抑制牛鏈球菌生長，說明其具備功能性中和活性. 結(jié)果表明，CARR 重組蛋白可有效快速激發(fā)宿主體液免疫應(yīng)答，是牛鏈球菌和牛球蟲聯(lián)合疫苗的有效候選抗原靶點(diǎn).

關(guān)鍵詞： 牛鏈球菌； 牛艾美爾球蟲； 重組多表位抗原； 表達(dá)特性； 中和抗體

中圖分類號(hào)： R392. 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A DOI： 10. 19907/j. 0490-6756. 240260

1引言

牛鏈球菌（Streptococcus bovis）和牛球蟲分屬細(xì)菌和原蟲，其中S. bovis 是一種兼性厭氧的革蘭染色陽性細(xì)菌，屬于Ｄ群鏈球菌，該細(xì)菌能使牛發(fā)生酸中毒，并能導(dǎo)致奶牛乳腺炎、犢牛肺炎，嚴(yán)重降低肉牛質(zhì)量以及奶牛產(chǎn)奶量，同時(shí)該細(xì)菌還能感染人類，導(dǎo)致感染性心內(nèi)膜炎、菌血癥等疾?。?，2］. 近年來S. bovis 感染的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，抗生素的使用也導(dǎo)致耐藥菌株不斷產(chǎn)生，尤其是對(duì)克拉霉素以及其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)生耐受［3］，其危害不容忽視，開發(fā)設(shè)計(jì)S. bovis 疫苗具有較大的臨床價(jià)值. 牛球蟲是一種胞內(nèi)寄生蟲，其中牛艾美耳球蟲（Eimeria bovis）是最具致病性的球蟲之一. 受感染的牛可通過糞便排除大量未孢子化的球蟲卵囊，導(dǎo)致卵囊在環(huán)境中大量存在，傳播給未感染個(gè)體，尤其是犢牛和幼牛幾乎不能避免.感染E. bovis 的犢?？赡軙?huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉甚至死亡［4，5］，研究E. bovis 疫苗可保護(hù)犢牛免受E. bo?vis 感染帶來的損害，增加犢牛的存活率. 有研究表明，母牛體內(nèi)的E. bovis 抗體可以通過初乳傳遞給犢牛［6，7］，這表明給成年雌性個(gè)體接種E. bovis 疫苗仍具有較大的現(xiàn)實(shí)意義. 上述兩種病原體均可寄生于牛的消化道中，且均能在受感染動(dòng)物的糞便中檢出病原體，其在易感動(dòng)物間的流行不僅對(duì)畜牧業(yè)造成損失，還對(duì)牧區(qū)居民及工作人員的健康造成了嚴(yán)重威脅，因此對(duì)于S. bovis 和牛球蟲的防治是至關(guān)重要的.

目前，有效控制牛球蟲病和S. bovis 感染嚴(yán)重依賴于管理措施以及抗球蟲和抗菌藥物，而妥善的管理需要耗費(fèi)較大的人力物力，且藥物的長期使用也使耐藥性成為球蟲病和S. bovis 感染治療的潛在威脅［2，3］，所以新的防治方法仍需探索. 表位疫苗由于其具有精準(zhǔn)免疫、安全性高、效果理想，且能降低免疫逃逸的風(fēng)險(xiǎn)等諸多優(yōu)勢(shì)，所以無論在人類醫(yī)學(xué)和畜牧醫(yī)學(xué)中都是新型疫苗研究熱點(diǎn)［8，9］. 例如口蹄疫表位疫苗因具有安全性好、易操作、可控等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為畜牧業(yè)中預(yù)防口蹄疫病毒的關(guān)鍵手段之一［9］. 因此設(shè)計(jì)S. bovis-牛球蟲融合多表位疫苗有利于從細(xì)菌和原蟲兩個(gè)方面減少易感動(dòng)物所受到的威脅，減少疫苗所帶來的不良反應(yīng)，在促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展的同時(shí)也保障了人類的健康. 本研究通過比對(duì)蛋白關(guān)鍵性、抗原性、可獲得性、理論有效性，最終篩選出了S. bovis 的桿狀決定蛋白（rod shape-determining" "protein， RodA）和牛球蟲的頂膜抗原（apical membrane antigen-1，AMA-1）、免疫定位蛋白1（immune" mapped protein1， IMP-1）作為多表位疫苗的靶蛋白，RodA 參與細(xì)菌肽聚糖的合成，影響細(xì)菌形態(tài)，結(jié)構(gòu)分析顯示RodA 具有抗原性的可能性較高［10，11］；AMA-1、IMP-1 參與寄生蟲對(duì)機(jī)體的免疫刺激［12，13］，已有研究顯示AMA-1 刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體對(duì)包括瘧原蟲在內(nèi)的頂復(fù)門寄生蟲均有保護(hù)作用，是作為疫苗開發(fā)和診斷應(yīng)用的一個(gè)有前景的靶標(biāo)［14，15］.

本研究將從S. bovis 的RodA 基因和牛球蟲的IMP-1、AMA-1 基因中篩選得到的優(yōu)勢(shì)表位基因序列以不同順序串聯(lián)，再與霍亂毒素B 亞單位（Cholera toxin subunit B， CTB）相連，篩選構(gòu)建并表達(dá)了重組S. bovis-牛球蟲多表位疫苗CARR，并對(duì)CARR 的免疫反應(yīng)性、免疫原性進(jìn)行了初步研究，以及對(duì)融合蛋白刺激產(chǎn)生的抗體的抑菌效果做了初步檢測(cè).

2材料和方法

2.1主要材料

E. coli BL21（DE3）購自TansGen； pET28a（+）購自Novagen； His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、鼠抗Histag 多抗、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自碧云天公司；鼠抗CTB 單抗、鼠抗S. bovis 多抗由課題組自制，羊抗雞IgG、TMB 雙組分顯色試劑盒購自索萊寶有限公司；產(chǎn)蛋雞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)提供.

2. 2方法

2. 2. 1 S. bovis-牛球蟲雙基因融合抗原的設(shè)計(jì)及特性分析 通過對(duì)比篩選蛋白關(guān)鍵性、抗原性、可獲得性、理論有效性，最終選擇了牛球蟲的AMA-1、IMP-1 和S. bovis 的RodA 作為重組蛋白抗原的備選靶蛋白，在NCBI 上獲取艾美耳球蟲AMA-1 和IMP-1 以及牛球蟲的RodA 的氨基酸序列和對(duì)應(yīng)的基因序列. 運(yùn)用BepiPred 2. 0、IEDB網(wǎng)站（http：//www. iedb. org/）進(jìn)行對(duì)應(yīng)備選蛋白的T、B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)并篩選優(yōu)勢(shì)表位，將篩選得到的細(xì)胞表位以不同順序連接，加入或不加入CTB 序列，得到不同的融合蛋白序列，對(duì)各融合蛋白三維穩(wěn)定性、分子量、等電點(diǎn)、表位個(gè)數(shù)、親水性、特異性等多參數(shù)綜合分析后選出最佳序列，并通過vectorbuilder 網(wǎng)站優(yōu)化密碼子，最終由生工生物技術(shù)公司合成目的序列.

2. 2. 2 CARR表達(dá)菌的構(gòu)建 通過雙酶切將合成的目的序列插入到pET28a（+）可表達(dá)區(qū)域，轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3），以抗性LB 平板（卡那霉素，50 μg/mL）篩選，并對(duì)陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定.

2. 2. 3重組質(zhì)粒 pET28a（+）-CARR 穩(wěn)定性研究 方法參照王保寧等［16］質(zhì)粒保有率實(shí)驗(yàn)方法.

2. 2. 4 CARR誘導(dǎo)表達(dá)與表達(dá)形式分析 鑒定正確的工程菌種接種至抗性LB 液體培養(yǎng)基（卡那霉素，50 μg/mL）中，適當(dāng)培養(yǎng)，然后以1∶50 的比例進(jìn)行傳代. 在培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長階段時(shí)，添加IPTG，使其濃度達(dá)到1 mmol/L，在34 ℃和200 r/min下誘導(dǎo)8 h，收集細(xì)菌沉淀物并進(jìn)行超聲波破碎，破碎后的沉淀物被用含有尿素的Binding 緩沖液溶解. SDS-PAGE /Western blot 分析上清和沉淀（由于重組蛋白含有6× 組氨酸標(biāo)簽，因此Westernblot 選擇His tag 多抗進(jìn)行初步鑒定）.

2. 2. 5鎳柱純化CARR 按照試劑盒操作說明書進(jìn)行純化.

2. 2. 6Western blot 分析CARR 的免疫反應(yīng)性分別用鼠抗CTB 單抗和自制鼠抗S. bovis（ATCC33317）多抗作為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 作為二抗，同時(shí)設(shè)置空載質(zhì)粒重組菌為對(duì)照，分析CARR 的免疫反應(yīng)性.

2. 2. 7 CARR 的免疫原性檢測(cè) 純化后的CARR融合蛋白與超聲破碎后的S. bovis（ATCC33317）抗原分別制備成蛋白終濃度為1 mg/mL 的抗原液備用，分別免疫1 只產(chǎn)蛋雞，抗原于雞大腿兩側(cè)、翅根、背部肌肉多點(diǎn)注射，首次注射600 μg 抗原（與弗氏不完全佐劑等體積混合），在第一次免疫后每隔14 d 進(jìn)行1 次600 μg 單獨(dú)抗原免疫，在第一次免疫后每隔6～8 d 從每個(gè)組中收集雞蛋備用，持續(xù)8wk，采用鹽析法提取抗體，間接ELISA 法檢測(cè)IgY的效價(jià).

2. 2. 8特異性IgY 對(duì)S. bovis 的生長抑制活性經(jīng)傳代后的S. bovi（s ATCC33317）用LB液體培養(yǎng)基稀釋至OD600＝0. 08，設(shè)置9 個(gè)組別（IgY-ATCC處理組：加入使培養(yǎng)體系里的IgY 濃度分別為2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL；IgY-CARR 處理組：加入使培養(yǎng)體系里的IgY 濃度分別為2 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL；阿莫西林（0. 1 μg/mL）處理組；非特異性IgY 處理組；空白對(duì)照組），于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)30 h，其間每隔3 h 進(jìn)行取樣測(cè)量光密度值（OD600）.

3結(jié)果

3. 1 S. bovis- 牛球蟲雙基因融合抗原的設(shè)計(jì)及篩選

從AMA-1 和IMP-1、RodA 篩選得到的細(xì)胞表位以不同順序連接，加入或不加入CTB 序列，得到6 種融合蛋白序列，如下：

融合蛋白1：IMP-1-RodA-RodA（IRR）

融合蛋白2：AMA-1-RodA-RodA（ARR）

融合蛋白3： CTB-IMP-1-RodA-RodA（CIRR）

融合蛋白4： CTB-AMA-1-RodA-RodA（CARR）

融合蛋白5：IMP-1-RodA-RodA-CTB（IRRC）

融合蛋白6： AMA-1-RodA-RodA-CTB（ARRC）

各融合蛋白多參數(shù)分析篩選結(jié)果如表1，可見CARR （CTB-AMA-1-RodA-RodA） 和ARRC（AMA-1-RodA-RodA-CTB）更適合作為目標(biāo)融合蛋白基因序列，由于CARR 前端含有CTB 的信號(hào)肽，分泌表達(dá)的可能性高，因此優(yōu)先選擇CARR作為目標(biāo)蛋白. 重組CARR 基因序列全長為2355 bp，蛋白理論分子量約90×103 Da. 利用工具vectorbuilder 進(jìn)行密碼子優(yōu)化后其適應(yīng)指數(shù)由0. 62 增加至0. 91.

三維穩(wěn)定性：蛋白中ɑ 螺旋越多，則其三維穩(wěn)定性越高，使用過程越不容易異常降解，因此根據(jù)其三維結(jié)構(gòu)中的ɑ 螺旋和β 折疊的比例綜合Expasy 分析中的不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index）分別計(jì)0～10 分；分子量：當(dāng)?shù)鞍椎姆肿恿窟^小時(shí)，其免疫原性較差，因此合適的抗原蛋白應(yīng)有較大的分子量. 當(dāng)融合蛋白分子量lt;35 kDa 時(shí)計(jì)0分，當(dāng)融合蛋白分子量gt;35 kDa時(shí)計(jì)1～10 分；等電點(diǎn)：常用裂解液的pH 為7. 4-8. 0，因此融合蛋白的等電點(diǎn)（PI）應(yīng)遠(yuǎn)離此區(qū)間. 當(dāng)融合蛋白PIlt;6. 0 或gt;10. 0 時(shí)計(jì)10 分，當(dāng)6. 0lt;融合蛋白PIlt;7. 0 或10. 0gt;融合蛋白PIgt;9. 0 時(shí)計(jì)5 分，當(dāng)7. 0lt;融合蛋白PIlt;9. 0 時(shí)計(jì)0 分；B 細(xì)胞表位個(gè)數(shù)：理論上融合蛋白中的B 表位個(gè)數(shù)越多，其免疫原性越好，因此融合蛋白中每含有一個(gè)B 細(xì)胞表位則計(jì)1 分，上不封頂；T 細(xì)胞表位個(gè)數(shù)：理論上融合蛋白中的T 表位個(gè)數(shù)越多越好，因此融合蛋白中每含有一個(gè)T 細(xì)胞表位則計(jì)1 分；親水性：融合蛋白的親水性越好，則其越容易發(fā)揮作用. 因此根據(jù)其親水性不同分別計(jì)0～10 分；特異性：融合蛋白的特異性越好，則發(fā)生不良反應(yīng)的概率越低. 因此根據(jù)其特異性分別計(jì)0～10 分；結(jié)構(gòu)圖：Phyre2 軟件對(duì)融合蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖.

3. 2

CARR 原核表達(dá)工程菌的構(gòu)建與鑒定

pET28a（+）-CARR 經(jīng)過雙酶切后，電泳結(jié)果出現(xiàn)一條2300 bp 左右的亮帶（圖1），聯(lián)合測(cè)序結(jié)果表明所構(gòu)建的重組表達(dá)載體構(gòu)建正確.

3. 3 CARR 工程菌質(zhì)粒傳代穩(wěn)定性CARR 工程菌質(zhì)粒保有率結(jié)果如圖2 所示.

3. 4 CARR表達(dá)形式分析

經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，電泳結(jié)果顯示在約90×10³ Da處出現(xiàn)相比于對(duì)照組更為明顯的蛋白條帶（圖3a泳道2 相比于泳道4），隨即以抗His tag 抗體進(jìn)行Western blot 鑒定. 結(jié)果僅顯示工程菌沉淀包涵體裂解組在相對(duì)分子質(zhì)量約90×10³ Da 出現(xiàn)明顯含組氨酸標(biāo)簽的蛋白條帶（圖3b），因此CARR 的表達(dá)形式為包涵體表達(dá)，Image j 軟件分析顯示CARR 占菌體總蛋白20. 3%.

3. 5 CARR的免疫反應(yīng)性分析

SDS-PAGE 顯示鎳柱純化效果良好，純化的CARR 分別以鼠抗S. bovis（ATCC33317）多克隆抗體（圖4a）、鼠抗CTB 單抗（圖4b）為一抗，進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示在約90×10³ Da出現(xiàn)條帶，對(duì)照組無明顯條帶，說明所表達(dá)的CARR 抗原免疫反應(yīng)性良好.

3. 6 CARR 的免疫原性分析

檢測(cè)首次免疫后8 wk 內(nèi)收集雞蛋中的特異性IgY 效價(jià)，如圖5 所示，可見經(jīng)過四次免疫，抗CARR-IgY 的效價(jià)逐漸升高，且相對(duì)于破碎抗原免疫的產(chǎn)蛋雞，CARR 刺激產(chǎn)生的特異性IgY 產(chǎn)生更快，且更早達(dá)到峰值，最終穩(wěn)定在1∶12 800.

純化后的IgY SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖6 所示，可見分子量為66×10³ Da 左右的IgY 重鏈和25×10³ Da 左右的IgY 輕鏈.

3. 7特異性IgY 對(duì)S. bovis 的生長抑制活性

如圖7 所示，特異性IgY 對(duì)于S. bovis 的生長具有明顯的抑制作用，且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，其中特異性抗CARR IgY 抗體的抑制作用略低于抗全菌破碎抗原IgY 抗體，且均小于阿莫西林的抑制作用，而非特異性的IgY 對(duì)于S. bovis 的生長沒有抑制作用.

4討論

S. bovis 和牛球蟲都是影響牛群健康的常見病原體，給牛群的養(yǎng)殖和生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的危害，糞便播散病原的方式以及病原在環(huán)境中的持續(xù)存在更是讓牧區(qū)對(duì)于兩種病原的防控難上加難. 而目前針對(duì)兩種病原體的防治缺乏高效且方便的方法，隨著新型疫苗的不斷發(fā)展，多表位疫苗的開發(fā)無疑是一個(gè)行之有效的方法. S. bovis 的RodA 在細(xì)菌的生長發(fā)育中至關(guān)重要，屬于SEDS 蛋白家族一員，其在革蘭陽性菌和革蘭陰性菌內(nèi)均廣泛存在，但在不同的屬中相對(duì)保守［10，11］. 2008 年，Uehara等人研究表明RodA 的主要作用除了影響細(xì)菌的形態(tài)，還與細(xì)菌延伸等生命過程中的肽聚糖合成、降解密切相關(guān)［10］. 2018 年，Sjodt 等人報(bào)告了RodA的晶體結(jié)構(gòu)，其含有三個(gè)巨大的外環(huán)，且外環(huán)中包含了許多功能必需的殘基，而細(xì)菌膜蛋白的外環(huán)則往往構(gòu)成了很好的B 細(xì)胞表位. 此外，還有報(bào)告稱RodA 中存在極為保守的肽段，對(duì)這些保守肽段的誘導(dǎo)突變將導(dǎo)致菌體形態(tài)的改變并可能導(dǎo)致細(xì)菌裂解［11］. 因此，以RodA 作為S. bovis 疫苗靶點(diǎn)可能產(chǎn)生較好效果. 2011 年，Blake 等人鑒定出了艾美耳球蟲中能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的區(qū)域，并從中篩選出了兩個(gè)重要抗原基因——AMA-1 基因和IMP-1 基因［12］. AMA-1 是頂復(fù)門寄生蟲侵入宿主細(xì)胞時(shí)必不可少的一種蛋白質(zhì)，也是頂復(fù)門寄生蟲的重要抗原，其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體對(duì)包括瘧原蟲在內(nèi)的頂復(fù)門寄生蟲均有保護(hù)作用［14，15］，敲除AMA-1 基因的蟲株不能形成穩(wěn)定的克隆系［15］. 同時(shí)，已有研究表明，IMP-1 在球蟲屬內(nèi)相對(duì)保守，與刺激機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)［12，13］，且該蛋白及其表位肽所激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的抗體具有良好的作用［13］，因此AMA-1 和IMP-1 是很有潛力的頂復(fù)門寄生蟲疫苗新靶點(diǎn).

以往的研究顯示，CTB 具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，可用作黏膜免疫增強(qiáng)劑，應(yīng)用于疫苗開發(fā)［17］，本研究結(jié)果證明含分子內(nèi)佐劑CTB 的CARR 確實(shí)有助于免疫反應(yīng)的發(fā)生，加快特異性抗體的產(chǎn)生. 為了避免其他無效抗原對(duì)免疫應(yīng)答的影響，選擇S. bovis 和牛球蟲關(guān)鍵蛋白的優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行融合抗原設(shè)計(jì)，并接入免疫佐劑分子，來誘發(fā)強(qiáng)烈和特異的免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防或治療S. bo?vis 和牛球蟲感染的目的. 本研究篩選了S. bovis 和牛球蟲關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)表位，創(chuàng)新性地將細(xì)菌和寄生蟲兩大危害機(jī)體的微生物的優(yōu)勢(shì)抗原融合表達(dá)，并進(jìn)行了相應(yīng)表達(dá)系統(tǒng)的密碼子優(yōu)化，構(gòu)建了CARR 蛋白原核表達(dá)工程菌，Western blot 證實(shí)了CARR 具有良好的免疫反應(yīng)性，對(duì)產(chǎn)蛋雞的免疫以及間接ELISA 證明CARR 具有良好的免疫原性，且該融合蛋白刺激產(chǎn)生的抗體對(duì)S. bovis 的生長具有一定的抑制作用，后續(xù)應(yīng)用推廣研究擬對(duì)CARR 作為疫苗的可能性進(jìn)一步的探索，提升所構(gòu)建的CARR 表達(dá)工程菌株CARR 蛋白表達(dá)量，探索中和抗體對(duì)球蟲的作用. 總而言之，本研究成功表達(dá)了S. bovis－牛球蟲多表位抗原CARR，為探討CARR 在牛體內(nèi)預(yù)防、治療S. bovis 和牛球蟲感染的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).