摘要： 從天然發(fā)酵酸辣子食品中分離得到一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）GZ0620，探究該菌的益生性能及對(duì)動(dòng)物結(jié)腸炎的影響．體外評(píng)估試驗(yàn)顯示該菌株不具有溶血現(xiàn)象，同時(shí)對(duì)參與測(cè)試的克拉霉素等6 種抗生素均呈敏感（S）或中介（I）．該菌株在模擬胃液中3h平均存活率為90. 91%，在模擬腸液中6h平均存活率為76. 27%，對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞（HT-29）的平均黏附力為18. 55%．體外抑菌試驗(yàn)表明，該菌株對(duì)空腸彎曲菌、大腸埃希氏菌、大腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌等常見(jiàn)腸道致病菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制能力．通過(guò)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)建立小鼠結(jié)腸炎模型試驗(yàn)表明，益生菌處理組小鼠便血癥狀減輕，4種血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 指標(biāo)明顯下降，該菌株對(duì)DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有預(yù)防治療作用．綜上所述，戊糖片球菌（P. pentosaceus）GZ0620具有良好抑菌抗炎作用，在人和動(dòng)物功能性食品中具有應(yīng)用潛力．

關(guān)鍵詞： 發(fā)酵食品；戊糖片球菌；益生性；DSS誘導(dǎo)；結(jié)腸炎

中圖分類號(hào)： TS201. 3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A DOI：10. 19907/j. 0490-6756. 240160

1引言

動(dòng)物腸道微生物（Gut Microbiome，GM）在維持宿主健康方面發(fā)揮著重要作用，其通過(guò)代謝產(chǎn)物、模式識(shí)別和免疫調(diào)節(jié)等途徑對(duì)宿主產(chǎn)生影響［1］．腸道微生物有助于維持腸道通透性和功能，在碳水化合物、脂質(zhì)和氨基酸的代謝中起著重要作用［2］，并作為腸腦功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一通過(guò)腸腦軸對(duì)宿主行為等產(chǎn)生影響［3］．越來(lái)越多研究表明腸道菌群的失衡在人和動(dòng)物的腸胃類疾病中發(fā)揮作用［4］．炎癥性腸?。↖nflammatory BowelDiseases，IBD）是一種慢性炎癥性胃腸道疾病，以腹瀉、直腸出血、間歇性惡心、腹痛等為主要癥狀，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確［5］，其中腸道微生物及其代謝物在IBD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用［6］．近年來(lái)，IBD 的發(fā)病趨勢(shì)在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［7-9］．盡管與全球水平相比，中國(guó)目前的IBD患病率較低，但發(fā)病率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)［10］，需要針對(duì)IBD 采取更加安全有效的治療策略以幫助IBD患者．

益生菌（Probiotics）作為健康食品及膳食補(bǔ)充劑，可以減少胃腸道中不同病原體的發(fā)展，其代謝物可以調(diào)節(jié)腸道屏障，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)［11］，不僅可以改善人和動(dòng)物腸道健康，還可以對(duì)人肥胖、2型糖尿病、高血脂等心血管疾病等疾病的治療起到積極作用［12］．研究表明通過(guò)益生菌干預(yù)IBD 模型小鼠，有助于調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群及炎癥情況［13］，同時(shí)避免了抗生素治療造成的抗生素相關(guān)性腹瀉［14］等問(wèn)題，從而為IBD 的治療提供一項(xiàng)安全策略．而酸菜等食品在天然發(fā)酵過(guò)程中，其發(fā)酵環(huán)境有利于乳酸菌類益生菌的生長(zhǎng)．解文利［15］通過(guò)16S 擴(kuò)增子宏基因組分析結(jié)果表明，發(fā)酵蔬菜中乳桿菌屬（Lactobacillus）等益生菌豐度較高，并從中分離出了41 株乳酸菌進(jìn)行篩選評(píng)估．張?zhí)鸬龋?6］也從發(fā)酵食品中分離出了具有益生潛力的菌株以進(jìn)行篩選利用． 同時(shí)，食品源益生菌具有更高的食用安全性，因此具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值．

本研究針對(duì)一株從天然發(fā)酵酸辣子食品中分離篩選得到的編號(hào)為GZ0620 的戊糖片球菌（P.pentosaceus），對(duì)其安全性、在模擬腸胃液中的存活率、對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附性、抑菌能力進(jìn)行了體外評(píng)估．此外，通過(guò)構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型，對(duì)其抗炎作用進(jìn)行了體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)估，為該菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用及其在人和動(dòng)物功能性食品中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)．

2材料與方法

2. 1主要材料

戊糖片球菌（P. pentosaceus）GZ0620 菌株分離篩選自貴州省黎平縣果利寨農(nóng)家天然發(fā)酵自制酸辣子食品，該菌株于2022年10月13日被中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏收錄（編號(hào)CGMCCNo. 25906，專利號(hào)：ZL202211489854. 1［17］）．

試驗(yàn)所用其他菌株信息如表1 所示．體內(nèi)試驗(yàn)所用模式動(dòng)物為無(wú)特定病原體級(jí)別4 周齡雄性昆明小鼠（成都達(dá)碩），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所用途徑皆遵循四川大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)倫理要求．

2. 2方法

2. 2. 1溶血性及抗生素敏感性 將戊糖片球菌GZ0620 菌株復(fù)蘇培養(yǎng)后用接種環(huán)蘸取菌液在哥倫比亞血平板上劃線接種，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察有無(wú)溶血環(huán)的出現(xiàn)．以溶血葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照，LGG 作為陰性對(duì)照．

采用紙片擴(kuò)散法（K-B 法）進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)．無(wú)菌棉球浸于20 μL 1×106 CFU/mL 菌懸液中，涂布于平板上，每三分之一固體培養(yǎng)基固定一張藥敏紙片，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑（mm），試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)．判定標(biāo)準(zhǔn)參考CLSI 標(biāo)準(zhǔn)中藥物敏感性判定方法．

2. 2. 2模擬胃、腸液耐受性測(cè)定 模擬胃液由氯化鈉、稀酸和胃蛋白酶組成，胃蛋白酶濃度為3. 2 g/L，最終pH 為2. 5；模擬腸液由磷酸鹽、胰蛋白酶和0. 3% 的膽鹽組成，胰蛋白酶濃度為0. 464 g/L，最終pH 為6. 8．參考前人研究方法［18］并依據(jù)試驗(yàn)條件稍作修改進(jìn)行．調(diào)整菌懸液活菌數(shù)至1×108 CFU/mL，加入9 mL 模擬胃液中，通過(guò)10 倍梯度稀釋法對(duì)活菌數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h 后采用上述方法計(jì)活菌數(shù)；模擬腸液存活率測(cè)定采用同樣的方法，分別于0 h 和6 h 時(shí)進(jìn)行10 倍梯度稀釋并計(jì)活菌數(shù)．試驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，LGG 作為對(duì)照．用如下公式計(jì)算存活率：

2. 2. 3菌株對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附性測(cè)定 參考實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表試驗(yàn)方法稍作修改進(jìn)行［19］．對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 復(fù)蘇、傳代，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液并用無(wú)菌PBS 沖洗1～2 次，取1 mL 1×10⁶ CFU/mL GZ0620 菌懸液加入細(xì)胞板中，取20μL 菌液用10 倍梯度稀釋法計(jì)活菌數(shù)，記為N1，置于37 ℃培養(yǎng)箱中2 h．吸出菌懸液并用PBS 洗滌2～3 次． 向細(xì)胞板中加入0. 7 mL 0. 25% 胰蛋白酶并放置10 min，吸取0. 3mL RPMI-1640 培養(yǎng)基加入細(xì)胞板中終止消化過(guò)程，采用上述方法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，記為N₂．試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，LGG 作為對(duì)照． 用如下公式計(jì)算存活率.

其中，N為黏附率（% ）；N₁ 為0h 時(shí)起始活菌數(shù)（CFU）；N₂為2h時(shí)黏附活菌數(shù)（CFU）.

2. 2. 4菌株的抑菌試驗(yàn) 調(diào)整致病菌菌懸液活菌數(shù)至1×10⁸ CFU/mL，待固體培養(yǎng)基為40～50 ℃時(shí)，以致病菌菌懸液∶瓊脂培養(yǎng)基=1∶5 的比例向培養(yǎng)基中加入致病菌菌懸液，混勻后分裝至培養(yǎng)皿中． 待培養(yǎng)基凝固后用直徑為6 mm 的打孔器在平板中打孔． GZ0620 菌液離心后收集發(fā)酵上清液，吸取50 μL 發(fā)酵上清液至瓊脂板孔內(nèi)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中24 h 后測(cè)量抑菌圈直徑．試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)，LGG 作為對(duì)照．

2. 2. 5小鼠結(jié)腸炎模型試驗(yàn) 參考前人研究方法［20］修改調(diào)整進(jìn)行．

4周齡無(wú)特定病原體雄性昆明小鼠以每籠3 只隨機(jī)分為9籠，正常飼養(yǎng)7d后將27 只小鼠以每組3 籠，每籠3 只隨機(jī)分為CK 對(duì)照組、DSS 模型組和GZ0620 處理組．采用4%（W/V）葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）建立小鼠結(jié)腸炎模型，GZ0620 處理組在試驗(yàn)期間采用濃度為5×10⁹ CFU/mL 的GZ0620 菌懸液灌胃處理．試驗(yàn)周期和處理如表2所示．

血清炎癥因子檢測(cè)：分別在預(yù)防期和治療期結(jié)束時(shí)，每籠隨機(jī)選取1 只小鼠進(jìn)行眼眶取血，將所得血液于3000 r/min 下離心10 min 后收集小鼠血清，立即送成都里來(lái)生物科技有限公司進(jìn)行血清炎癥因子檢測(cè)，采用ELISA 試劑盒測(cè)定血清中IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α4個(gè)炎癥因子指標(biāo)．

2. 2. 6數(shù)據(jù)分析 用IBM SPSS Statistics 27. 0軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，使用T 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)間的比較，使用單因素ANOVA 進(jìn)行兩組以上數(shù)據(jù)間的比較（兩兩比較使用LSD 法）．

3結(jié)果與分析

3.1安全性初步評(píng)估

菌株首先必須對(duì)人和動(dòng)物安全才能進(jìn)行后續(xù)益生性狀試驗(yàn)及開(kāi)發(fā)利用，安全性通常以溶血性和抗生素抗性作為重要指標(biāo)．如圖1 所示，經(jīng)溶血性檢測(cè)，對(duì)照菌株LGG 未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，溶血葡萄球菌出現(xiàn)透明溶血環(huán)，而戊糖片球菌GZ0620 菌株在血平板上也沒(méi)有溶血現(xiàn)象． 藥敏試驗(yàn)表明，克拉霉素和氯霉素對(duì)GZ0620 產(chǎn)生的抑菌圈在敏感（S）范圍內(nèi)，其對(duì)上述兩種抗生素敏感；而四環(huán)素、氨芐西林、頭孢曲松、克林霉素對(duì)GZ0620 產(chǎn)生的抑菌圈在中介（I）范圍內(nèi)，其對(duì)上述四種抗生素中介（表3）．

3. 2菌株對(duì)動(dòng)物胃腸環(huán)境適應(yīng)能力評(píng)估

益生菌要充分發(fā)揮其益生作用，首先要能適應(yīng)人和動(dòng)物胃腸中較強(qiáng)的酸性及多種酶的存在等環(huán)境． 本研究人工模擬胃液和腸液試驗(yàn)表明，GZ0620 菌株在模擬胃液中處理3 h 平均存活率為90. 91% 且顯著高于對(duì)照菌株LGG 存活率75. 87%（Plt;0. 05）．在人工模擬腸液中處理6 h后，GZ0620 菌株的平均存活率為76. 27%，略低于對(duì)照菌株LGG的存活率81. 53%，二者無(wú)顯著差異（Pgt;0. 05）（圖2）．

本研究黏附試驗(yàn)表明（圖3），GZ0620 菌株對(duì)HT-29 細(xì)胞的平均黏附率顯著高于對(duì)照菌株LGG（Plt;0. 05），為18. 55%．其具有較好的黏附能力，有利于該菌在腸胃環(huán)境中的定植，從而幫助抑制病原菌生長(zhǎng)．

3. 3菌株抑菌能力

本研究抑菌試驗(yàn)表明，GZ0620菌株對(duì)以下6種常見(jiàn)腸道有害菌均產(chǎn)生抑菌圈（表4），其對(duì)于以下腸道有害菌的生長(zhǎng)繁殖均有一定抑制作用．GZ0620 菌株對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌以及大腸彎曲菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑與LGG 相比較有顯著差異，其中對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑大于LGG，說(shuō)明該菌株對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)抑制能力較強(qiáng)，其有助于抑制腸道病原細(xì)菌滋生，保持腸道健康．

3. 4小鼠結(jié)腸炎模型試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用自由飲用4% 葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）水溶液方法構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型．試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)小鼠在連續(xù)飲用DSS 水溶液7 天后表現(xiàn)出活動(dòng)力下降、便血等癥狀．預(yù)防期結(jié)束時(shí)，與CK 組相比，DSS 組小鼠血清中4 種炎癥因子指標(biāo)明顯增加，且IL-1β、IL-6、IL-8 均極顯著高于CK 組（Plt;0. 01）．GZ0620 組小鼠IL-1β、IL-6、IL-8 水平均極顯著低于DSS 組（Plt;0. 01），其中IL-1β 和IL-6 與CK 組相比具有顯著差異（Plt;0. 05），此外IL-8和TNF-α 與CK 組相比無(wú)顯著差異，且GZ0620 組小鼠血清炎癥因子水平更接近于CK 組小鼠（表5）． DSS 組小鼠較GZ0620 組小鼠便血情況比較嚴(yán)重，GZ0620 灌胃組小鼠便血情況明顯減輕或無(wú)明顯便血情況．小鼠便血情況觀察及預(yù)防期炎癥因子測(cè)定表明小鼠結(jié)腸炎模型造模成功．

治療期結(jié)束時(shí)，DSS 組小鼠血清中各炎癥因子水平均顯著高于CK 組小鼠（Plt;0. 05），從炎癥因子水平來(lái)看，DSS 組小鼠在治療期停止灌胃DSS 后無(wú)明顯自愈情況． GZ0620 組小鼠血清炎癥因子水平在治療期結(jié)束時(shí)更接近于CK 組小鼠且IL-1β、IL-6 水平極顯著低于DSS 組小鼠（Plt;0. 01）．綜合對(duì)比不同時(shí)期小鼠炎癥因子水平來(lái)看，戊糖片球菌GZ0620 干預(yù)后對(duì)DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有緩解治療作用．

4討論

發(fā)酵食品發(fā)展歷史悠久，研究表明其在發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生生物活性肽、胞外多糖等物質(zhì)，對(duì)腸道健康具有積極影響［21］． 同時(shí)，發(fā)酵食品中含有大量多樣的微生物，其中乳桿菌屬、片球菌屬等乳酸菌含量豐富［22］．發(fā)酵食品作為含有豐富益生菌且食用安全性較高的來(lái)源具有益生菌開(kāi)發(fā)方面的潛力，近年來(lái)有許多研究從發(fā)酵蔬菜等食品中分離出了具有益生潛力的菌株［23-25］，拓展了微生物資源庫(kù)． 在益生菌菌株中，戊糖片球菌（P. pento?saceus）具有抑菌抗炎、抗癌、抗氧化等多種應(yīng)用潛力，其作為益生菌和生物制劑具有進(jìn)一步發(fā)展的可能性［26］．因此從具有本土特色的發(fā)酵食品中挖掘益生菌株，不僅可以應(yīng)用于疾病防治等方面，還可以進(jìn)一步豐富微生物資源庫(kù)、拓展微生物研究材料．

本研究中從貴州傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸辣子中分離出的一株編號(hào)為GZ0620 的戊糖片球菌表現(xiàn)為不溶血，且對(duì)六種抗生素大類中的常見(jiàn)抗生素：克拉霉素（大環(huán)內(nèi)酯類）、氯霉素（酰胺醇類）、頭孢曲松（頭孢菌素類）、克林霉素（林可酰胺類）、四環(huán)素（四環(huán)素類）、氨芐西林（β-內(nèi)酰胺類）抗生素均表現(xiàn)為敏感（S）或中介（I），具有良好的安全性，排除了一定的安全隱患，有利于其功能性益生潛力的進(jìn)一步探究和開(kāi)發(fā)利用． 戊糖片球菌GZ0620 表現(xiàn)出對(duì)克拉霉素和氯霉素較高的敏感度，因此其在作為益生菌制劑開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中，應(yīng)避免與上述六種抗生素，特別是與克拉霉素和氯霉素同時(shí)使用，以免影響其益生功能的發(fā)揮． 以往研究中益生菌在人工腸胃液存活率范圍在23. 36%～89. 17%［27］，而本研究中該菌株在模擬腸胃液中的存活率均在73% 以上，表現(xiàn)出了較高的生存能力，更有益于其在腸胃環(huán)境中的定植從而發(fā)揮其益生功能．通常情況下，人和動(dòng)物胃液pH 范圍在1. 5-5. 0 左右，前人研究表明分離得到的益生菌菌株在pH 值達(dá)2. 0 的模擬胃液中幾乎無(wú)法存活，因此益生菌一般建議避免空腹食用［28］，而該菌株在pH 值達(dá)2. 5 的酸性環(huán)境中其存活率依然達(dá)90% 左右，可能是由于食品的發(fā)酵的環(huán)境使得菌株的耐酸能力得到了一定的馴化，表現(xiàn)出了對(duì)人和動(dòng)物胃腸環(huán)境較強(qiáng)的適應(yīng)能力，這提示發(fā)酵食品中具有耐酸性菌株開(kāi)發(fā)的巨大潛力．益生菌對(duì)腸壁細(xì)胞的附著能力也會(huì)影響其益生功能的發(fā)揮，戊糖片球菌GZ0620 表現(xiàn)出的黏附性顯著高于對(duì)照菌株（Plt;0. 05），為其在腸胃系統(tǒng)中存活定植及益生作用的發(fā)揮提供了基礎(chǔ)，較高的黏附性也可以幫助其與病原菌競(jìng)爭(zhēng)定植位點(diǎn)從而抑制病原菌的生長(zhǎng)［29］． 此外，本研究中該菌株可能通過(guò)產(chǎn)生細(xì)菌素、有機(jī)酸等抑菌物質(zhì)來(lái)拮抗病原菌［30］，從而表現(xiàn)出了對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、空腸彎曲菌、大腸彎曲菌生長(zhǎng)的抑制作用，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果較為明顯，其代謝物中可能含有對(duì)這兩種致病菌生長(zhǎng)抑制有效的細(xì)菌素，可以作為特定致病菌抗菌劑進(jìn)一步探究． 本研究動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DSS 組小鼠在停止灌胃DSS后，其便血情況和炎癥因子指標(biāo)在無(wú)干預(yù)情況下的過(guò)程中并沒(méi)有產(chǎn)生明顯變化，降低了其本身自愈能力對(duì)于灌胃菌株效果觀察的影響．前人研究發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵食品中分離得到的益生菌對(duì)于調(diào)節(jié)由DSS 誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，以及小鼠腸道菌群有積極作用［31，32］．本研究體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)也表明戊糖片球菌GZ0620 可以緩解由DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎炎癥狀況，灌胃GZ0620 的小鼠便血情況明顯減輕或無(wú)明顯便血情況，并且IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 四種炎癥因子指標(biāo)明顯低于DSS 組并且更接近于CK 組小鼠，小鼠活動(dòng)狀態(tài)與炎癥因子變化與前人研究呈現(xiàn)出類似趨勢(shì)［33］，表明戊糖片球菌GZ0620 及其代謝物可能通過(guò)參與信號(hào)及代謝通路產(chǎn)生一定的抗炎效果，從而對(duì)DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠具有緩解治療作用．

本研究從貴州傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸辣子中分離出的一株編號(hào)為GZ0620 的戊糖片球菌（P. pentosa?ceus），并通過(guò)安全性、功能性以及其抑菌抗炎作用進(jìn)行了評(píng)估，特別是驗(yàn)證了其在建立的小鼠結(jié)腸炎模型中的作用，從而為食品源益生菌的開(kāi)發(fā)提供思路，同時(shí)為微生物組調(diào)節(jié)劑治療腸胃疾病方面途徑提供了材料，拓展了具有本土特色的微生物資源庫(kù)．未來(lái)還需要進(jìn)一步研究該菌株其他方面的益生性能，以及其發(fā)揮益生性能的作用機(jī)制；并通過(guò)全基因組測(cè)序技術(shù)等探究其功能以及在疾病方面的應(yīng)用，從而進(jìn)行進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用以進(jìn)一步發(fā)揮益生菌在調(diào)節(jié)人體及其他動(dòng)物健康方面的優(yōu)勢(shì)．