摘 要：【目的】杉木作為重要的用材樹種，具有廣泛的用途和經(jīng)濟價值。通過克隆、生物信息學(xué)分析和表達分析方法對杉木隱花色素CRY1基因進行研究，為更深入地了解其在杉木生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性中調(diào)控作用提供參考?！痉椒ā恳陨寄緝?yōu)良無性系‘洋020’的1年生苗作為試驗材料，通過RT-PCR技術(shù)，完成了CRY1基因的克隆，并對其進行生物信息學(xué)和表達分析。【結(jié)果】ClCRY1基因CDS區(qū)全長2 109 bp，編碼702個氨基酸（GenBank號為PP489217），ClCRY1蛋白的分子式為C3520H5385N997O1057S16，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。ClCRY1不包含信號肽和跨膜區(qū)域，具有CRY1結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位于葉綠體。二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷組成，二級和三級結(jié)構(gòu)高度相似。系統(tǒng)進化分析表明，杉木ClCRY1與日本柳杉親緣關(guān)系更為密切，其次是銀杏。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）表達分析，ClCRY1基因在根、莖、葉中均有表達，尤其在葉片中的相對表達量最高。藍光處理可顯著提高ClCRY1基因表達量，且在長日照處理下其表達量高于短日照。高溫處理24 h后，ClCRY1基因的相對表達量達到峰值，高溫促進其高表達，而低溫則抑制其表達?！窘Y(jié)論】杉木隱花色素ClCRY1基因的克隆及表達分析，揭示了ClCRY1基因在不同光照處理下的表達及其對溫度脅迫的響應(yīng)，為杉木育苗過程中光照選擇和抗逆栽培提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：杉木；隱花色素；ClCRY1基因；基因克??；表達分析

中圖分類號：S722.84 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2025）03-0138-10

基金項目：“十四五”國家重點研發(fā)計劃（2021YD2201302）。

Cloning of Chinese fir cryptochrome ClCRY1 gene and its expression analysis

GUO Shengzhou， XU Zuyuan， CHEN Ying， LIAN Yiran， CAO Guangqiu， CAO Shijiang

（College of Forestry， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， Fujian， China）

Abstract：【Objective】As an important timber species， Cunninghamia lanceolata has a wide range of uses and economic values. In this study， the Chinese fir cryptochrome CRY1 gene was investigated by cloning， bioinformatics analysis and expression analysis methods to provide a deeper understanding of its regulatory role in Chinese fir growth and development and environmental adaptation.【Method】The cloning of CRY1 gene was accomplished by RT-PCR， and its bioinformatics and expression analysis were performed using the annual seedlings of the excellent Chinese fir asexual line ‘Yang 020’ as experimental materials.【Result】The CDS region of the ClCRY1 gene is 2 109 bp in total length， encoding 702 amino acids （GenBank No. PP489217）. the molecular formula of ClCRY1 protein is C3520H5385N997O1057S16， which belongs to the unstable hydrophilic proteins. ClCRY1 does not contain signal peptide and transmembrane region， and it has a CRY1 structural domain. The subcellular localization is in chloroplasts. The secondary structure mainly consists ofα-helices and irregular coils， and the secondary and tertiary structures are highly similar. Phylogenetic analysis showed that Chinese fir ClCRY1 was more closely related to Cryptomeria japonica， followed by Ginkgo biloba. By real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） expression analysis， the ClCRY1 gene was expressed in roots， stems， and leaves， and especially the highest relative expression was found in leaves. Blue light treatment significantly increased the expression of ClCRY1 gene， and its expression was higher under long sunlight treatment than short sunlight. The relative expression of ClCRY1 gene peaked after 24 h of high-temperature treatment， and high temperature promoted its high expression， while low temperature inhibited its expression.【Conclusion】The cloning and expression analysis of the Chinese fir cryptochrome ClCRY1 gene revealed the expression of ClCRY1 gene under different light treatments and its response to temperature stress， which provides a theoretical basis for the selection of light and stress-resistant cultivation of Chinese fir seedlings.

Keywords： Chinese fir； cryptochrome； ClCRY1 gene； gene cloning； expression analysis

杉木Cunninghamia lanceolata在全球林業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位，由于其生長速度快、木材質(zhì)量優(yōu)良、適應(yīng)性強，杉木成為重要的經(jīng)濟用材樹種[1-3]。在全球林業(yè)生產(chǎn)中，杉木不僅用于建筑、造紙、家具制造等領(lǐng)域，還廣泛應(yīng)用于造林、園林綠化和生態(tài)修復(fù)等方面。隨著全球氣候變化和環(huán)境壓力的加劇，杉木的生長發(fā)育和適應(yīng)能力受到了極大的挑戰(zhàn)。光照是其重要的影響條件之一，有研究發(fā)現(xiàn)，光照強度對杉木的生長有顯著影響。不同光照強度對杉木幼苗葉片的凈光合速率產(chǎn)生不同影響[4]；白光對杉木的生長最為有利，而紅光和藍光則可能對杉木的生長產(chǎn)生負面影響[5]；光照顯著影響杉木的生理特性，例如葉綠素合成和氣孔的開閉，這些進一步影響它的生長速度。增加光照時間能促進杉木生長速度，但若光照時長過度，可能會導(dǎo)致能量消耗過多，從而對其生長造成不利影響[6]。目前，對于探究杉木對光環(huán)境變化的響應(yīng)機制研究較少，特別是對光照的適應(yīng)性。植物中的光受體類型包括藍光受體隱花色素（cryptochrome，CRY）、向光素（phototropins，PHOTs）、紅光/遠紅光受體光敏色素（phytochrome，PHY）、紫外光B（UV-B），通過感知光質(zhì)特征和光的強弱以及改變光周期調(diào)節(jié)植物對環(huán)境的適應(yīng)性[7-8]。研究表明：杉木的生長和代謝受到光受體的調(diào)節(jié)[9-10]。因此，深入研究杉木的光受體基因?qū)ι寄酒贩N改良具有重要意義。

隱花色素（CRY）是植物體內(nèi)的一類非常重要的光感受器，在植物的生長發(fā)育和光周期調(diào)節(jié)中起著重要的作用[11-13]。隱花色素是一類藍光（400～500 nm）和近紫外光（320～400 nm）的黃素蛋白，又稱紫外光-A/藍光受體（UV-A/ blue-light receptor），分子量為70～80 kD，其N端由大約由500個氨基酸構(gòu)成，與光裂解酶具有高度同源性，生色團可能由黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和蝶呤（pterin）組成，C端的序列組成及長度在不同物種間差異顯著，其中包括一個保守但不連續(xù)的DAS（DQXVP））基序[14]。隱花色素得名于其促進隱花植物吸收藍光以進行孢子繁殖，它在植物光形態(tài)的塑造、花期的調(diào)控、生物鐘的運作及氣孔的開合等方面發(fā)揮著重要作用[15]。植物中含有最多的隱花色素蛋白包括兩種類型：CRY1和CRY2[16]，CRY1主要在藍光誘導(dǎo)的光形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮作用，而CRY2則主要調(diào)控光周期性以影響開花時間，在調(diào)節(jié)開花過程中，兩種蛋白的功能存在重疊[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，CRY1在植物抗病反應(yīng)和氣孔開放中也起到了一定的作用[18]； CRY1能夠與熱休克轉(zhuǎn)錄因子HsfA1d發(fā)生相互作用，促進HsfA1d進入細胞核，從而提高了植物對高溫脅迫的抵抗能力[19]。擬南芥Arabidopsis thaliana中，AtCRY1參與抑制下胚軸的伸長和花色素的積累，cry突變體在不同的光照條件下均表現(xiàn)出開花延遲的現(xiàn)象[20-22]；研究發(fā)現(xiàn)，水稻Oryza sativa中的OsCRY1s在受到藍光照射時發(fā)揮作用，可以抑制胚芽鞘和葉片的生長，同時調(diào)節(jié)水稻的去黃化反應(yīng)[23]；在胡楊Populus euphratica中，CRY1的過度表達能夠促進次生木質(zhì)部的發(fā)育和花青素的積累。這表明CRY1在楊樹木材形成和花青素生物合成中起著重要作用[24]；CRY1還參與了藍光和環(huán)境溫度協(xié)同調(diào)控植物下胚軸伸長的新機制[25]。然而隱花色素CRY1基因在杉木中的表達分析未見報道，其生物學(xué)功能還需進一步研究。

本研究利用PCR技術(shù)克隆了杉木ClCRY1基因，并通過生物信息學(xué)方法深入分析了其序列，預(yù)測了蛋白結(jié)構(gòu)和功能域。隨后利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對杉木不同組織、光照條件、光周期以及溫度脅迫下ClCRY1基因的表達進行了分析，進而探討了ClCRY1基因在杉木生長發(fā)育和在溫度脅迫中的潛在功能。有助于深化對杉木通過隱花色素調(diào)節(jié)對光反應(yīng)的響應(yīng)機制的理解，進而提高杉木適應(yīng)外部環(huán)境變化的能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以1年生的優(yōu)良無性系020杉木苗為試驗材料，由福建省順昌洋口林場（117°49′E，26°47′N）提供。在福建農(nóng)林大學(xué)田間實驗室大棚下進行試驗，取長勢較好的苗木用營養(yǎng)土種植于花盆（上口徑18 cm，下口徑13 cm，高度17.5 cm）中，在上海蟻霖科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的MGC-250HP-2L恒LED光源人工氣候箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)為白光，光照強度為300 μmol/m2，溫度25 ℃，培養(yǎng)3周后，用于試驗。選取根、莖和嫩葉片為材料進行實時熒光定量PCR分析。不同溫度處理：設(shè)置培養(yǎng)箱高溫為40 ℃，對杉木葉片處理，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后分別取杉木葉片進行實時熒光定量分析，類似地設(shè)置培養(yǎng)箱溫度為5 ℃做同樣的處理，2組處理均以0 h為對照。不同光照處理：分別將杉木苗置于4個不同的光照培養(yǎng)箱中，包括白光、黑暗、紅光和藍光，以白光為對照，試驗中的光照強度均為300 μmol·m-2，溫度為25 ℃，處理時間為8 h。不同光周期處理：長日照（14 h/10 h、16 h/8 h）、中日照（12 h/12 h）和短日照（8 h/16 h、10 h/14 h），以自然光照為對照組（CK）。其中，每天8：00—22：00自動光照，光照時間為14 h/d；16 h/8 h處理，每天8：00—24：00自動光照，光照時間為16 h/d；其余處理以此類推，對照組（CK）處理，以溫室自然光照為對照，光照總時長為6 h/d[26]。用T5一體化燈管模擬自然光照。將杉木幼苗放置在集成T5一體化燈支架上，使用正泰KG316T定時開關(guān)設(shè)置自動光照以控制光照時間，并使用單面銀色遮光布覆蓋杉木幼苗，其余環(huán)境條件一致，培養(yǎng)室溫度為25 ℃，相對濕度為60%～70%。每個處理組均設(shè)置了3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)3株杉木苗。試驗樣品采集后，立即用液氮速凍，并存放于-80 ℃的冰箱。

1.2 ClCRY1基因克隆

使用TIANGEN的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，從受到各種脅迫的杉木幼苗中提取總RNA，并使用Nanodrop Ultra-Micro分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳分別測量RNA的濃度和質(zhì)量。利用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒將分離的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)目標基因ClCRY1的序列，并在分析以前可用的杉木轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，從NCBI數(shù)據(jù)庫中建立了適當?shù)囊铮海‵w： TAGGTCTGGAGGATGAATCTG；Rv： GATGAGGTGATAGCAAGGAAG），利用PCR技術(shù)克隆出ClCRY1基因。取cDNA進行PCR反應(yīng)，依次加入Forward primer （10 μmol·L-1） 1.0 μL、Reverse primer （10 μmol·L-1） 1.0 μL、10×KOD Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture （2.5 mmol·L-1） 2.5 μL、DNA polymerase KOD （2.5 U·μL-1） 0.5 μL、cDNA 1.5 μL、ddH2O 10 μL；反應(yīng)程序為：58 ℃ 35 s；70 ℃ 1 min，96 ℃ 3 min；90 ℃ 20 s，共40個循環(huán)；70 ℃ 8 min。用1%的瓊脂糖/EB凝膠電泳法對擴增產(chǎn)物進行測定。

1.3 ClCRY1基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的ORF工具，根據(jù)先前預(yù)測的杉木序列估算了ClCRY1的氨基酸序列。在線工具ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam）和Expasy中的ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale）評估了ClCRY1蛋白的理化特性。TMHMM Server v2.0（https：//services.healthtech.dtu. dk/services/TMHMM-2.0）用于預(yù)測和研究ClCRY1蛋白的跨膜區(qū)域。SignalP 4.1在線軟件用于預(yù)測ClCRY1蛋白的信號肽。SOPMA在線程序用于預(yù)測ClCRY1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，而Phyre2在線軟件則用于研究其三級結(jié)構(gòu)。Cell-PLoc（http：// www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc）用于預(yù)測ClCRY1蛋白的亞細胞定位。在線程序ClustalW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）被用來多次比較蛋白質(zhì)序列。利用Blast程序?qū)⑸寄綜RY1氨基酸序列與NCBI基因庫數(shù)據(jù)庫進行比對，以尋找其他物種中序列相似度較高的CRY1。系統(tǒng)發(fā)育分析采用了MEGA11程序中的鄰接（NJ）技術(shù)，bootstrap重復(fù)1 000次，并使用iTOL（https：// itol.embl.de）對結(jié)果進行了美化。

1.4 實時熒光定量PCR分析

試驗材料是經(jīng)過不同處理的杉木幼苗的組織（根、莖和葉）。創(chuàng)建了特定的引物ClCRY1-qPCR：Fw：CCTTGCTTTGGTTCCCTTTG；Rv： GTCGATTGAAGAGTCCAGATCC。其中杉木Actin基因[26]作為內(nèi)參基因。參考廖文海等[27]的RTqPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，使用實時熒光定量PCR儀（Real-time fluorescent quantitative PCR），并采用SYBR染料法?；趦蓚€基因標準的拷貝數(shù)及其相應(yīng)的CT值，采用2-ΔΔCT法[28]進行分析，計算目的基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClCRY1基因克隆

從杉木幼苗嫩葉中提取的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以DL5000 DNA maker為樣標，進行PCR擴增后，發(fā)現(xiàn)目的條帶大約在2 000 bp左右（圖1）。在NCBI網(wǎng)站上進行比對驗證，確定編碼區(qū)CDs長度為2 109 bp的開放閱讀框（GenBank登錄號為PP489217），編碼702個氨基酸。

2.2 ClCRY1基因得到的蛋白理化性質(zhì)分析

在深入研究ClCRY1蛋白的分子特性時，借助了ExPASy軟件中的Protparam模塊，解析其分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，具體而言，ClCRY1蛋白的分子式表示為C3520H5385N997O1057S16，相對分子質(zhì)是79.09 ku、理論等電點是5.79，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)是49.89，說明其是不穩(wěn)定類型蛋白；脂溶指數(shù)78.65，則表明蛋白極易溶解于有機溶劑之中，此外，從親水性角度來看，平均值-0.467顯示出該蛋白具有較高的親水性。帶正電的殘留的總數(shù)（Arg+Lys）為69個，帶負電的總數(shù)殘留物（Asp+Glu）為85個，蛋白質(zhì)和多肽鏈中帶負電荷的氨基酸比帶正電荷的要多，表明在生理酸堿條件下，蛋白質(zhì)整體呈負電性，這可能會影響其結(jié)構(gòu)、功能以及在細胞內(nèi)的行為。

2.3 ClCRY1蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和亞細胞

通過ProtScale軟件提供的參數(shù)，評估ClCRY1蛋白具有親水性（圖2A）。SignalP-4.1在線軟件被用來預(yù)測ClCRY1蛋白是否含有可折疊的信號肽分值（圖2B）。信號肽是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中常見的一部分，負責將特定的蛋白質(zhì)錨定到宿主細胞上。在這個模型中，C值代表了剪切位點的數(shù)量，而S值則是信號肽分值，顯示了信號肽的潛在影響力。Y值則綜合了C值和S值[29]。根據(jù)Signal P-4.1的結(jié)果，lCRY1蛋白的剪切曲線表現(xiàn)得非常平滑，并且S值穩(wěn)定不變，這意味著它并沒有明顯表現(xiàn)出信號肽的特征。通過TMHMM2.0的分析，發(fā)現(xiàn)ClCRY1蛋白并沒有呈現(xiàn)出典型的跨膜區(qū)，即未發(fā)現(xiàn)任何特定的區(qū)域負責跨細胞膜的活動（圖2C）。Cell-PLoc預(yù)測ClCRY1蛋白位于葉綠體中。

2.4 杉木ClCRY1與擬南芥AtCRY1蛋白氨基酸序列比對

根據(jù)杉木ClCRY1與擬南芥AtCRY1的蛋白序列比對結(jié)果（圖3），發(fā)現(xiàn)二者之間的同源一致性為70.92%。在2種蛋白的序列中都包含了隱花色素基因保守的DQXVP序列、PHR結(jié)構(gòu)域和 CCE結(jié)構(gòu)域。PHR結(jié)構(gòu)域位于N端，在隱花色素基因序列中具有非常高的保守性，而CCE結(jié)構(gòu)域在不同物種中存在較大差異，但靠近C端的這一區(qū)域都包含了DAS（DQXVP）基序，這是判斷隱花色素基因的重要標志?；谶@些相似性和保守性特征，命名克隆得到的基因為ClCRY1。

2.5 ClCRY1蛋白進行二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用SOPMA在線軟件對ClCRY1蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示（圖4A），ClCRY1蛋白具有4種結(jié)構(gòu)形式，其中無規(guī)則卷曲和α-螺旋的占比較高，分別占45.01%和40.17%；β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈的占比較低，分別為5.13%和9.69%。利用Phyre2，一個基于同源性建模的在線軟件，對ClCYR1蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測（圖4B）。該軟件自動選擇了PDB數(shù)據(jù)庫中的clu3cA作為參考模型進行蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。預(yù)測結(jié)果表明，蛋白的N端由多個螺旋和β折疊構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)組成，而C端主要由無規(guī)則卷曲構(gòu)成，這與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果一致。

2.6 ClCRY1基因系統(tǒng)進化樹分析

為研究ClCRY1基因的進化關(guān)系，使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖5）。分析表明，杉木與日本柳杉、銀杏的遺傳距離較近，所以杉木ClCYR1與他們有更近的親緣關(guān)系。因此，杉木的ClCRY1基因與日本柳杉和銀杏可能在演化過程中經(jīng)歷了相似的選擇壓力和功能調(diào)整。相反，杉木ClCYR1與銀白楊Populus alba、歐洲山楊Populus tremula、橡膠樹Hevea brasiliensis的遺傳距離較遠，由此推測它們之間的親緣關(guān)系較遠。

2.7 杉木ClCRY1基因表達分析

2.7.1 不同組織中的表達分析

利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析了ClCRY1基因在杉木幼苗不同組織中的表達，結(jié)果（圖6）顯示，ClCRY1基因在杉木根、莖、葉中都有表達，且在葉片中的相對表達水平最高，莖中相對表達量最低。由此推斷，ClCRYI基因杉木中的表達可能存在組織特異性。

2.7.2 不同光照處理的表達分析

為了研究ClCRYI基因在不同光照下的表達情況，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析了其在藍光、紅光和黑暗下的表達水平，結(jié)果（圖7）顯示，藍光、紅光和黑暗處理下，ClCRYI基因相對表達量都高于對照組（白光），且在藍光處理下，其相對表達水平最高。表明ClCRYI基因的表達受到光信號特別是藍光信號的調(diào)控。

2.7.3 不同光周期處理的表達分析

為了研究ClCRYI基因在不同光周期處理下的表達水平，取4組光周期處理探究其表達情況，結(jié)果（圖8）顯示，ClCRYI基因在長日照（16 h/8 h和14 h/10 h）和短日照（8 h/16 h和14 h/10 h）的表達量均高于對照組。在長日照下的ClCRYI基因表達量高于中日照（12 h/12 h），而在短日照條件下則相反，由此得出，在長日照條件下，ClCRYI基因的表達量高于其在短日照的表達量。此外，隨著日照時長的增加，長日照和短日照處理下ClCRYI基因的相對表達水平呈現(xiàn)下降趨勢。這表明ClCRYI基因的表達受光周期的影響，且在長日照條件下表達更為活躍。

2.7.4 溫度脅迫下的表達分析

溫度脅迫下的表達分析結(jié)果顯示（圖8），在高溫處理條件下，ClCRYI基因的表達量明顯高于對照組。隨著處理時間的增加，該基因的表達量先升高后降低，24 h高溫處理后達到最高峰，這表明高溫促進了ClCRYI基因的表達。在低溫脅迫下，ClCRYI基因的表達量與對照組相比，在6 h處理時達到最高水平，隨著脅迫時間的延長逐漸減少，48 h時降至最低水平。這暗示了ClCRYI基因在高溫脅迫條件下發(fā)揮調(diào)控作用，而在低溫脅迫條件下其調(diào)控作用不太明顯。

3 討 論

隱花色素是一類重要的植物光受體蛋白，不僅參與植物的光形態(tài)建成、種子休眠等發(fā)育過程[30-31]，還負責應(yīng)對生物和非生物脅迫的調(diào)節(jié)。目前，在擬南芥[32]、水稻[33]、番茄Solanum lycopersicum[34]、小麥Triticum aestivum[35]、高粱Sorghum bicolor[36]等多種草本植物中都分離得到了隱花色素基因，且在模式植物擬南芥中的研究最為深入。本研究從杉木通過PCR法克隆得到ClCRY1基因，該基因CDS區(qū)全長為2 109 bp，編碼702個氨基酸，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥AtCRY1之間的同源一致性為70.92%，兩種蛋白的序列中都包含了隱花色素基因保守的DQXVP序列[37]，這表明ClCRY1基因與擬南芥AtCRY1基因在結(jié)構(gòu)上具有相似性，并且可能在功能上也存在一定程度的保守性。ClCRY1蛋白亞細胞定位預(yù)測為葉綠體，葉綠體是植物細胞內(nèi)專門用于進行光合作用的細胞器，作為光受體的ClCRY1基因可能參與杉木的光合作用。有研究發(fā)現(xiàn)隱花色素可以調(diào)控與葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因，如GNC和CGA1/GNL，這些基因在葉綠素生物合成和葉綠體發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮部分冗余作用[39]，暗示了ClCRY1基因可能在杉木葉綠體內(nèi)發(fā)揮作用，參與葉綠體形成等生物學(xué)過程。進化分析表明，ClCRY1與日本柳杉的親緣關(guān)系最近，二者可能是共同起源。

為研究杉木ClCRY1基因在杉木生長發(fā)育過程中的表達情況，對杉木不同組織、不同光周期、不同光照及溫度脅迫下的ClCRY1基因表達進行了實時熒光定量分析。結(jié)果表明：在不同組織中，ClCRY1基因在葉中的表達量最高，該結(jié)果與胡楊的PeCRY1基因[39]、草莓Fragaria × ananassa的FaCRY1基因[40]、馬鈴薯Solanum tuberosum的StCRY1基因[41]的組織表達情況相似，這與植物主要通過葉片響應(yīng)光信號的研究一致[43]，但也有報道顯示，在茶樹Camellia sinensis的CsCRY1基因在根中表達量最高[44]，表明該基因在不同植物組織中的表達存在特異性。ClCRY1基因在紅光和藍光條件下均有表達，且在藍光條件下，ClCRY1基因的表達量最高，CRY1基因的功能首次在擬南芥中鑒定，證實它編碼的蛋白質(zhì)是一個藍光感受器，并且在藍光下表達量增加[45]。野生蕉Musa spp.的MuCry基因[46]、玉米Zea mays隱花色素CRY1基因[47-48]也有相似的表達。本研究通過對ClCRY1基因的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，該基因在長日照條件下呈現(xiàn)顯著高表達特征。值得注意的是，這一表達特性在不同物種中表現(xiàn)出進化保守性，如在菊花Chrysanthemum morifolium[49]、洋蔥Allium cepa[50]、油茶Camellia oleifera[51]中均觀察到CRY1基因在長日照環(huán)境下的表達量顯著上調(diào)，這暗示了在長日照環(huán)境下CRY1基因可能在杉木的生長和發(fā)育中起著重要作用。但是，有研究發(fā)現(xiàn)在海棠Malus spectabilis中，在短日照條件下ClCRY1a基因的表達更高[52]。上述結(jié)果表明ClCRY1基因在參與杉木在各種光質(zhì)下的光形態(tài)建成以及光周期的調(diào)節(jié)。溫度脅迫（高溫脅迫/低溫脅迫）作為最重要的非生物脅迫之一，高溫促進了ClCRY1基因的表達，趙鴻彬等[53]發(fā)現(xiàn)短花針茅Stipa breviflora在授粉期，增溫下StbCRY1基因的表達量升高。最新的研究發(fā)現(xiàn)藍光受體CRY1是介導(dǎo)光照誘導(dǎo)的耐熱性的關(guān)鍵因子，CRY1能夠與HsfA1d發(fā)生相互作用，促進HsfA1d進入細胞核。并結(jié)合ChIP-seq和RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)CRY1和HsfA1d共同調(diào)控了一系列熱休克基因的表達，從而提高了植物對高溫脅迫的抵抗能力[54]。因此，推測高溫通過激活ClCRY1基因，調(diào)節(jié)杉木的生理和代謝過程，以提高杉木對高溫的耐受性。

綜上所述，本研究克隆了ClCRY1基因，并發(fā)現(xiàn)該基因在葉片中的表達量較高。此外，高溫和藍光可促進ClCRY1基因的表達，長日照比短日照條件下ClCRY1基因的表達水平更高。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解ClCRY1基因在植物發(fā)育和光周期調(diào)控中的功能提供了重要的理論基礎(chǔ)和新的研究方向。

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[本文編校：吳 毅]