摘 """""要：首次建立了一種測(cè)定飲用水中微囊藻毒素-LR的高效液相色譜熒光檢測(cè)法。樣品經(jīng)HLB柱進(jìn)行固相萃取凈化后，以V（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸甲醇溶液）∶V（水）= 60∶40的混合液為流動(dòng)相，在流速1.0 mL·min^-1、柱溫40 ℃、進(jìn)樣量10.0 μL條件下，使用CLC-ODS色譜柱和熒光檢測(cè)器進(jìn)行液相色譜分析。結(jié)果表明：微囊藻毒素-LR在激發(fā)波長(zhǎng)251 nm和發(fā)射波長(zhǎng)296 nm下響應(yīng)值最高；在質(zhì)量濃度為1.00～250 μg·L^-1時(shí)回歸方程為y=4.066 2x+4.810 8，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限為0.008 μg·L^-1，定量限為0.028 μg·L^-1；微囊藻毒素-LR在空白水樣和實(shí)際水樣中的平均加標(biāo)回收率分別為81.75%～90.08%和88.33%～95.89%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.58%～6.82%和3.10%～5.20%。該方法快速、高效、簡(jiǎn)單，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，適用于飲用水中微囊藻毒素-LR的檢測(cè)分析。

關(guān) "鍵 "詞：微囊藻毒素-LR；高效液相色譜；熒光色譜法；飲用水

中圖分類號(hào)：TQ450.2+6；X830.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ""文章編號(hào)：1004-0935（2025）03-0528-06

微囊藻毒素（MCs）是由藍(lán)藻（水華魚腥藻、銅綠微囊藻、顫藻等）發(fā)生水化時(shí)產(chǎn)生的一種環(huán)狀七肽毒素類化合物，其同分異構(gòu)體較多，且具有強(qiáng)致癌性和持久污染性。微囊藻毒素MC-LR（L代表亮氨酸，R代表精氨酸）是毒性最強(qiáng)、分布最廣的一種構(gòu)型^[1-6]。由于MCs化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，很難將其從水體中有效去除，水體中微囊藻毒素的威脅已成為國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的衛(wèi)生和環(huán)境問題，世界衛(wèi)生組織和我國(guó)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》均規(guī)定了地表水源地、生活飲用水MCs的質(zhì)量濃度不得高于"""""1.0 μg·L^-1（以MC-LR為代表）^[7-11]。目前檢測(cè)水中微囊藻毒素-LR的方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜紫外法、氣相色譜法/質(zhì)譜聯(lián)用、超高效液相色譜法/質(zhì)譜聯(lián)用等。酶聯(lián)免疫法易出現(xiàn)假陽(yáng)性，定性定量不準(zhǔn)確，且難以區(qū)分毒素類型^[12-14]。檢測(cè)微囊藻毒素-LR常采用的高效液相色譜紫外檢測(cè)法，其選擇性較差，靈敏度較低，對(duì)基質(zhì)復(fù)雜含量較低樣品的檢測(cè)結(jié)果干擾較大，甚至無(wú)法檢測(cè)^[15-17]。采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)雖然提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，但樣品前處理時(shí)需要對(duì)微囊藻毒素進(jìn)行衍生化，實(shí)驗(yàn)步驟較多，操作繁瑣，耗時(shí)耗力^[18-19]。目前超高效液相色譜質(zhì)譜法憑借其較高的分離度和""靈敏度已廣泛在醫(yī)療、食品、藥品和環(huán)境等相關(guān)科研領(lǐng)域內(nèi)使用，但該方法儀器普及率低，運(yùn)行維護(hù)成本高，尚不能大規(guī)模推廣使用^[20-23]。目前尚無(wú)利用高效液相色譜法配合熒光檢測(cè)器來(lái)測(cè)定水環(huán)境中微囊藻毒素-LR的報(bào)道，該研究首次通過(guò)采用HPLC熒光色譜法測(cè)定微囊藻毒素-LR，該方法具有前處理操作簡(jiǎn)便快捷、分析靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，因此利用此方法對(duì)水中微囊藻毒素-LR含量的檢測(cè)具有重要指導(dǎo)意義。

1 "材料與方法

1.1 "儀器與試劑

美國(guó)Agilent 1260高效液相色譜儀；中國(guó)?？艫utoSPE-06全自動(dòng)固相萃取儀；中國(guó)超藝達(dá)PS-60超聲波清洗機(jī)；美國(guó)MilliporeMilli-Q超純水機(jī)；中國(guó)天津恒奧HPD-25無(wú)油真空泵；天津津騰1 L溶劑過(guò)濾器；德國(guó)Eppendorf"20～200 μL、30～300 μL和100～1 000 μL手動(dòng)移液器；美國(guó)Waters HLB固相萃取柱；日本島津150 mm×6.0 mm，5.0 μm CLC-ODS色譜柱；中國(guó)CNW無(wú)水硫酸鈉柱；美國(guó)安捷倫0.45 μm針頭過(guò)濾器；中國(guó)新亞0.45 μm有機(jī)系、0.45 μm水系濾膜。甲醇，色譜純，美國(guó)TEDIA公司；三氟乙酸（TFA），分析純，中國(guó)成都科龍公司；純凈水，屈臣氏集團(tuán)；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（微囊藻毒素-LR），20 μg·mL^-1，SB05-287-2012，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

1.2 "分析方法

1.2.1 "水樣的預(yù)處理

量取1 000 mL水樣，并通過(guò)0.45 μm的水系膜過(guò)濾。

1.2.2 "固相萃取

活化柱子：先用10 mL甲醇（3.0 mL·min^-1）預(yù)洗HLB萃取柱，再用10 mL的純水（3.0 mL·min^-1）活化HLB萃取柱。過(guò)濾后的1 000 mL水樣""""""（10 mL·min^-1）通過(guò)已活化好的HLB萃取柱進(jìn)行樣品富集。用5 mL水（10 mL·min^-1）淋洗HLB萃取柱后，再用20%甲醇水溶液10 mL（流速為 """"5.0 mL·min^-1）淋洗萃取柱，然后以20 mL·min^-1空氣（20 mL）氣推萃取柱，接著干燥萃取柱，氮吹25 min。再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫液2 mL清洗注射泵（流速20 mL·min^-1），接著用10 mL 洗脫液洗脫萃取柱（流速2.0 mL·min^-1），然后氮?dú)鈿馔乒滔噍腿≈?0 mL，流速為 """"""20 mL·min^-1），并過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥柱脫水收集。40 ℃氮吹濃縮定容至1.0 mL，用0.45 μm膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.3 "檢測(cè)條件

色譜柱為CLC-ODS柱，SHIM PACK150 mm×6.0 mm，5.0 μm；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)（λ_ex）"為251 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λ_em）為296 nm；流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸甲醇溶液和水，其體積比為60∶40，現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前過(guò)0.45 μm的有機(jī)濾膜；柱溫為（40±1） ℃；流速為1.0 mL·min^-1；進(jìn)樣量為10 μL；采用外標(biāo)法定量。

2 "結(jié)果與討論

2.1 "前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

一般通過(guò)優(yōu)化固相萃取前處理分離條件（選擇合適的SPE柱和洗脫液以及改變洗脫時(shí)流速等），能有效降低基質(zhì)干擾，顯著提高目標(biāo)物的回收率。

2.1.1 "SPE萃取柱的優(yōu)化

根據(jù)微囊藻毒素MC-LR的分子特性，一般選用C₁₈或者HLB小柱作為SPE萃取柱來(lái)富集凈化水樣中的MC-LR^[24]?？疾炝薈₁₈和HLB小柱對(duì)相同空白加標(biāo)水樣中MC-LR的富集凈化情況，結(jié)果表明HLB小柱不僅吸附洗脫效果更好，而且回收率更高更穩(wěn)定。另外HLB小柱還具有較好的pH耐受""性^[25]，故選擇HLB柱作為固相萃取柱。

2.1.2 "洗脫液的優(yōu)化

微囊藻毒素MC-LR易溶于乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑，但乙腈作為洗脫液時(shí)，回收率偏低，基質(zhì)干擾大，且樣品分析成本高、毒性大；而甲醇提取效果好，并隨著洗脫液中甲醇比例的增加其回收率也越高越穩(wěn)定，雜質(zhì)干擾越小^[26]。在洗脫液甲醇溶液中加入適量的三氟乙酸，能夠促進(jìn)MC-LR中多肽羧酸基團(tuán)質(zhì)子化過(guò)程，同時(shí)也減少了MC-LR基本基團(tuán)和色譜柱硅膠表面之間的相互作用，有利于洗脫^[27]。考察了用10 mL甲醇、0.05%三氟乙酸的甲醇、0.1%三氟乙酸的甲醇和0.5%三氟乙酸的甲醇分別作為洗脫液的效果。結(jié)果表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫液時(shí)，MC-LR的平均加標(biāo)回收率最高。故選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫液。

2.1.3 "洗脫時(shí)流速的優(yōu)化

對(duì)比了不同流速（1.0、2.0、5.0 mL·min^-1）條件下的洗脫效果（10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的甲醇溶液作為洗脫液）。結(jié)果表明，洗脫液在流速為2.0 mL·min^-1時(shí)，MC-LR的平均加標(biāo)回收率最高。若洗脫時(shí)速度過(guò)快，在固液兩相中溶質(zhì)無(wú)法達(dá)到平衡，會(huì)降低分離度，但洗脫時(shí)速度過(guò)慢，在溶液中溶質(zhì)會(huì)擴(kuò)散，進(jìn)而導(dǎo)致分離度降低。因此，選擇"""2.0 mL·min^-1作為洗脫時(shí)的流速。

2.2 "熒光檢測(cè)條件的選擇

采用高效液相色譜的熒光檢測(cè)器光譜掃描方法對(duì)微囊藻毒素-LR的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別進(jìn)行了掃描，進(jìn)而確定了MC-LR的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，分別為λ_ex=251 nm和λ_em=296 nm。在λ_ex=238 nm時(shí)不同λ_em波長(zhǎng)下的響應(yīng)值如圖1所示^[28]，在λ_em=296 nm時(shí)不同λ_ex波長(zhǎng)下的響應(yīng)值如圖 2所示，在"""""""λ_ex"=251 nm時(shí)不同λ_em波長(zhǎng)下的響應(yīng)值如圖 3所示。

2.3 "方法的線性關(guān)系和檢出限

準(zhǔn)確量取20 μg·mL^-1的微囊藻毒素-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用色譜純甲醇稀釋至刻度線，混勻備用，此時(shí)貯備液中微囊藻毒素-LR 的質(zhì)量濃度為2.0 μg·mL^-1。將微囊藻毒素-LR的貯備液用色譜純甲醇分別稀釋至1、5、10、50、100、250 μg·L^-1等6個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度，待儀器穩(wěn)定后分別上樣測(cè)定。10 μg·L^-1微囊藻毒素-LR標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖4所示。

再分別以不同微囊藻毒素-LR質(zhì)量濃度（x）作為橫坐標(biāo)，以其信號(hào)響應(yīng)值色譜峰面積（y）作為縱坐標(biāo)，繪制MC-LR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，MC-LR質(zhì)量濃度為1～250 μg·L^-1時(shí)，其質(zhì)量濃度與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系很好，線性的回歸方程為y=4.066 2x+4.810 8，其相關(guān)系數(shù)為0.999 9。該方法檢出限的測(cè)定是在樣品中通過(guò)添加工作曲線最低質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并經(jīng)過(guò)前處理，然后按照該方法測(cè)定，以儀器響應(yīng)信號(hào)的3倍和10倍信噪比（S/N）分別計(jì)算方法的檢出限和定量限^[29]。該方法測(cè)定的微囊藻毒素-LR的檢出限和定量限分別為0.008、0.028 μg·L^-1，遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)GB 3838—2002中規(guī)定的微囊藻毒素-LR控制的標(biāo)準(zhǔn)限值1 μg·L^-1和國(guó)標(biāo)中規(guī)定的微囊藻毒素-LR的檢出限0.1 μg·L^-1（GB/T 20466—2006）和0.06 μg·L^-1（GB/T 5750.8—2023.16）。

該方法中的微囊藻毒素-LR在遠(yuǎn)低于現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其響應(yīng)值與質(zhì)量濃度之間仍具有很好的線性關(guān)系，且方法檢出限也遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)方法要求，故該方法能夠滿足飲用水中微囊藻毒素-LR的分析測(cè)定要求。

2.4 "方法的精密度和準(zhǔn)確度

2.4.1 "空白水樣的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

分別量取實(shí)驗(yàn)室的空白水樣各1 000 mL（n=6），向空白水樣中添加適量微囊藻毒素-LR的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加標(biāo)后空白水樣中微囊藻毒素-LR的質(zhì)量濃度分別為0.002、0.050、0.200 μg·L^-1，經(jīng)上述前處理的方法處理定容至1.0 mL后，進(jìn)行上機(jī)分析測(cè)定，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，微囊藻毒素-LR的平均加標(biāo)回收率為81.75%～90.08%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.58%～6.82%，遠(yuǎn)高于現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中微囊藻毒素-LR的加標(biāo)回收率（60%），且滿足分析檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)要求^[30]。

2.4.2 "實(shí)際水樣的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

按照上述前處理方法和色譜條件對(duì)畢節(jié)市倒天河水庫(kù)和利民水庫(kù)的水樣分別進(jìn)行了分析測(cè)定，所測(cè)樣品均未檢出微囊藻毒素-LR；再分別取利民水庫(kù)的水樣各1 000 mL（n=6），添加適量微囊藻毒""素-LR的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加標(biāo)后實(shí)際水樣中微囊藻毒""素-LR的質(zhì)量濃度分別為0.002、0.050、0.200 μg·L^-1，經(jīng)上述前處理的方法處理定容至1.0 mL后，進(jìn)行上機(jī)分析測(cè)定，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，微囊藻毒素-LR平均加標(biāo)回收率為88.33%～95.89%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.10%～5.20%。該方法的實(shí)際水樣加標(biāo)回收率較高，優(yōu)于國(guó)標(biāo)，具有很強(qiáng)的實(shí)踐可操作性，適用于對(duì)飲用水中痕量微囊藻毒素-LR的測(cè)定。

3 "結(jié)"論

首次建立了一種測(cè)定飲用水中微囊藻毒素-LR的熒光檢測(cè)高效液相色譜法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微囊藻毒素-LR的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為λ_ex=251 nm和λ_em=296 nm。該方法條件下微囊藻毒素-LR在遠(yuǎn)低于現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其響應(yīng)值與質(zhì)量濃度之間仍具有很好的線性關(guān)系，其檢出限為0.008 μg·L^-1，定量限為0.028 μg·L^-1，遠(yuǎn)低于現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。微囊藻毒素-LR在空白水樣和實(shí)際水樣中的平均加標(biāo)回收率分別為81.75%～90.08%和88.33%～95.89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.58%～6.82%和3.10%～5.20%，加標(biāo)回收率較高，均優(yōu)于國(guó)標(biāo)。該方法對(duì)飲用水中微囊藻毒素-LR的測(cè)定具有準(zhǔn)確度和靈敏度高、樣品前處理快捷簡(jiǎn)便、基質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足飲用水中微囊藻毒素-LR的分析監(jiān)測(cè)要求，可以適用于測(cè)定飲用水中微囊藻毒""""素-LR的質(zhì)量濃度，具有重要的實(shí)際指導(dǎo)意義。

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Determination of Microcystin-LR in Drinking Water by HPLC Fluorescence Chromatography

ZHAO Wenjin¹， LIU Peiyou¹， GU Guifei^"2

（1. Ecological Environment Monitoring Center of Bijie， Bijie Guizhou 551700，"China;

2. Zhouyi Tea Plantation of Bijie， Bijie Guizhou 551700，"China）

Abstract："A high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of microcystin-LR in drinking water was developed for the first time. Samples were extracted and purified by HLB solid phase extraction column. The SHIM PACK CLC-ODS column was used as chromatography column， and the mobile phase was a mixture of methanol （0.1%TFA）-water （volume ratio 60∶40） at a flow rate of 1.0 mL·min^-1. The column temperature kept 40 ℃， injection volume was 10.0 μL and the fluorescence detector was used to detect the sample. The results showed that MC-LR had the highest response when the wavelength stayed at λ_ex=251 nm/λ_em=296 nm. The regression equation of MC-LR was y=4.066 2x+4.810 8 when the linear range was 1.00–250 μg·L^-1， and the linear correlation coefficient of MC-LR was 0.999 9. The limit of quantitation of MC-LR was 0.028 μg·L^-1， and the detection limit was 0.008 μg·L^-1"in water. The average recoveries"of MC-LR in blank water samples"and actual water samples"were"""81.75%–90.08%"and 88.33%–95.89%， and their relative standard deviations"（RSD） were"3.58%–6.82%"and 3.10%–5.20%. The method is fast， efficient， simple， has good accuracy and precision， and is suitable for the detection and analysis of microcystin-LR in drinking water.

Key words："Microcystin -LR; HPLC; Fluorescence chromatography; Drinking water