摘要：目的 采用單細胞測序技術(shù)揭示非酒精性脂肪肝炎（NASH）小鼠肝組織T淋巴細胞單細胞水平的異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄組學特征，為研究T淋巴細胞在NASH中的作用機制提供新的依據(jù)。方法 6只C57BL/6雄性小鼠隨機分為普通飼料喂養(yǎng)的對照組和膽堿蛋氨酸缺乏飼料喂養(yǎng)的NASH組，每組各3只。造模6周后取小鼠肝組織進行單細胞RNA測序。分析T淋巴細胞單細胞亞群的特異性差異表達基因，分別行降維聚類、細胞類型注釋、t分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）、小提琴圖、基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。利用免疫熒光染色觀察兩組小鼠肝臟中Tcrα（T淋巴細胞分子標志）、Tcf7、Cxcr6（特征標志基因）的表達情況。計量資料兩組間比較采用成組t檢驗。結(jié)果 小鼠肝臟中共鑒定出2個T淋巴細胞亞群：（1）第6簇T淋巴細胞占比從對照組的58.5%降低到NASH組的48.7%。前4位特異性基因包括Nsg2、Cd8b1、Cd8a和Tcf7。該簇65%的細胞表達Tcf7（第6簇特征標志基因），定義為Tcf7 + T淋巴細胞亞群。GO和KEGG富集分析顯示，它們參與調(diào)控T淋巴細胞活化、白細胞黏附、結(jié)合泛素樣蛋白連接酶，以及輔助性T淋巴細胞（Th）17、Th1、Th2細胞分化等信號通路。（2）第7簇T淋巴細胞占比從對照組的41.5%增高到NASH組的51.3%。前4位特異性基因包括Cd40lg、Tcrg-C1、Il2rα和Cxcr6。該簇90%的細胞表達Cxcr6，定義為Cxcr6 + T淋巴細胞亞群。GO和KEGG富集分析提示，該亞群參與調(diào)控T淋巴細胞活化、細胞因子產(chǎn)生，以及T淋巴細胞受體信號通路、Th17細胞分化與MAPK信號通路。

免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，NASH組小鼠肝臟中Tcf7蛋白和Tcrα蛋白共染陽性區(qū)域減少（1.80%±0.67% vs 0.33%±0.13%，Plt;0.05），而Cxcr6蛋白和Tcrα蛋白共染陽性區(qū)域增加（0.50%±0.09% vs 2.66%±0.33%，Plt;0.001）。結(jié)論 NASH小鼠肝臟中 Tcf7 + T淋巴細胞的占比降低，而 Cxcr6 + T淋巴細胞的占比增高，揭示了 NASH小鼠肝組織 T淋巴細胞的特征和差異。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪性肝炎；T淋巴細胞；單細胞測序；小鼠，近交C57BL

基金項目：上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生健康委員會醫(yī)學學科建設(shè)項目（PWYgf2021-02）

Characteristics of T cells in the liver tissues of mice with nonalcoholic steatohepatitis

MAO Ting 1 ，XU Mingyi 1 ，WANG Jiayi 2

1. Department of Gastroenterology，Shanghai East Hospital，Tongji University，Shanghai 200120，China；2. Department of Gastroenterology，Shanghai General Hospital，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200080，China

Corresponding author：WANG Jiayi，18017028830@163.com （ORCID：0009-0004-8097-5288）

Abstract：Objective To investigate the heterogeneity and transcriptomic characteristics of T-cell subsets in the liver of mice with nonalcoholic steatohepatitis （NASH） at the single-cell level using single-cell RNA sequencing （scRNA-seq），and to provide a reference for studying the mechanism of action of T cells in NASH. Methods Six male C57BL/6 mice were randomly divided into control group fed with regular diet and NASH group fed with methionine-choline-deficient （MCD） diet，with three mice in each group，and liver tissue was collected for scRNA-seq after 6 weeks of modeling. Specific differentially expressed genes were analyzed between T-cell subsets，and related analyses were performed，including dimension clustering，cell type annotation，t-distributed stochastic neighbor embedding （t-SNE），violin plot，gene ontology （GO） functional enrichment analysis，and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis. Immunofluorescent staining was used to observe the expression of the T cell marker Tcrα and the specific marker genes Tcf7 and Cxcr6 in the liver of mice in the two groups. The independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups. Results Two T cell subsets were identified in the liver of mice，and the percentage of cluster 6 decreased from 58.5% in the control group to 48.7% in the NASH group. The top four specific genes were Nsg2，Cd8b1，Cd8a，and Tcf7. Tcf7，a characteristic marker gene for cluster 6，was expressed in 65% of cells in cluster 6，and therefore，cluster 6 was defined as Tcf7 + T cells. The GO and KEGG enrichment analyses showed that the differentially expressed genes of cluster 6 were involved in T cell activation，leukocyte adhesion，binding ubiquitin-like protein ligase，and the signaling pathways for Th17，Th1，and Th2 cell differentiation. The percentage of cluster 7 increased from 41.5% in the control group to 51.3% in the NASH group. The top four specific genes of cluster 7 were Cd40lg，Tcrg-C1，Il2rα，and Cxcr6. Cxcr6 was expressed in 90% of cells in cluster 7，and therefore，cluster 7 was defined as Cxcr6 + T cells. The GO and KEGG enrichment analyses showed that cluster 7 was involved in T cell activation，cytokine production，the T cell receptor signaling pathway，and the Th17 cell differentiation and MAPK signaling pathway. Immunofluorescence assay showed that compared with the control group，the NASH group showed a significant reduction in the area with positive co-expression of Tcf7 protein and Tcrα protein （1.80%±0.67% vs 0.33%±0.13%，Plt;0.05） and a significant increase in the area with positive co-expression of Cxcr6 protein and Tcrα protein （0.50%±0.09% vs 2.66%±0.33%，Plt;0.001）. Conclusion There is a reduction in the percentage of Tcf7 + T cells and an increase in the percentage of Cxcr6 +T cells in NASH mice，revealing the characteristics and differences of T cells in the liver of NASH mice.

Key words：Non-Alcoholic Steatohepatitis；T-Lymphocytes；Single-cell RNA Sequencing；Mice，Inbred C57BL

Research funding：Medical Discipline Construction Project of Pudong Health Committee of Shanghai （PWYgf2021-02）

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）進一步進展為肝硬化和肝細胞癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著肥胖和代謝綜合征的流行，NASH和NAFLD已成為全球慢性肝病的最主要病因，嚴重危害人民生命健康［1］。單細胞 RNA 測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一種在單細胞水平上對轉(zhuǎn)錄組進行擴增和測序的新技術(shù)［2］。相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序，單細胞RNA測序?qū)α私飧闻K非實質(zhì)細胞，如炎癥細胞尤為有效［3］。Su等 ［4］通過 scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)了健康和 NAFLD 小鼠肝臟中非實質(zhì)細胞的基因表達譜改變。T淋巴細胞是細胞免疫反應(yīng)的效應(yīng)細胞。近年來，人們逐漸認識到T淋巴細胞在 NAFLD 發(fā)病過程中的重要作用。Koda 等［5］發(fā)現(xiàn)，CD69 + CD103 ? CD8 + T 淋巴細胞在高脂高膽固醇誘導的NASH小鼠肝臟中顯著富集。有研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者的外周血中炎癥因子IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β1的水平和輔助性T淋巴細胞（Th）17的水平呈正相關(guān)［6］，且Th17細胞和IL-17的水平與NASH患者的病情嚴重程度呈正相關(guān)［7］。但在單細胞水平上研究T淋巴細胞在NASH中的特征改變?nèi)允怯斜匾?。因此，本研究采用scRNA-seq技術(shù)對健康小鼠和NASH小鼠的肝組織內(nèi)T淋巴細胞進行分群，旨在揭示NASH小鼠肝組織中不同T淋巴細胞亞群的轉(zhuǎn)錄組學特征。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選取8周齡C57BL/6雄性小鼠6只，隨機分為對照組和NASH組，每組各3只。對照組喂養(yǎng)普通飼料，NASH 組喂養(yǎng)膽堿蛋氨酸缺乏（methionine-choline-deficient，MCD）飼料，造模6周后處死小鼠，取肝組織進行scRNA-seq以獲得基因表達譜數(shù)據(jù)（上海鯨舟基因科技有限公司）［8］。

1.2 研究方法

1.2.1 scRNA-seq 使用 Seurat 3.0 軟件包讀取 scRNA-seq數(shù)據(jù)，并為每個數(shù)據(jù)創(chuàng)建一個Seurat對象。排除獨特分子標志lt;200或gt;10 000的細胞及線粒體基因含量高于25%的細胞，并根據(jù)獨特分子標志細胞總計數(shù)進行對數(shù)標準化后，對前2 000個高可變基因使用主成分分析的降維算法進行降維，隨后基于主成分分析降維結(jié)果以0.6的分辨率進行聚類。

1.2.2 細胞注釋和分簇 使用Seurat 3.0中的FindAllMarkers函數(shù)篩選出所有細胞類群中的標志基因，并使用 R 包Single R 1.4.1內(nèi)置的小鼠RNA測序數(shù)據(jù)庫作為參考數(shù)據(jù)集對細胞亞群進行細胞類型注釋。通過白細胞分化抗原3α（the cluster of the differentiation 3α，Cd3α）、白細胞分化抗原8α（Cd8α）、白細胞分化抗原4（Cd4）和T淋巴細胞受體α（T cell receptor alpha，Tcrα）來鑒定T淋巴細胞。

1.2.3 特異性差異表達基因（以下簡稱“特異性基因”）分析 使用 Seurat3.0 中的 FindMarkers 函數(shù)用于篩選scRNA-seq數(shù)據(jù)中的差異表達基因，設(shè)置log 2 （FC）gt;0.25為閾值，并對基因的顯著性P值進行檢驗矯正。隨后使用 t 分布隨機鄰域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）對數(shù)據(jù)進行可視化，再通過小提琴圖來可視化每個聚類中表達的特異性基因。

1.2.4 功能富集分析 采用Cluster Profiler R軟件包對特異性基因集進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO數(shù)據(jù)庫是從生物學過程、細胞組分、分子功能3個方面對基因和基因產(chǎn)物進行分類注釋。

1.2.5 免疫熒光染色 分別將對照組小鼠和 NASH 組小鼠肝臟切片進行烤片、脫蠟、水化、抗原修復和血清封閉后，加入以下一抗：Tcrα（Abcam公司，貨號：ab288432）、Tcf7（Abcam公司，貨號：ab315392）和Cxcr6（Boster公司，貨號：BA3082），并置于 4 ℃冰箱中孵育過夜。次日滴加Alexa 488（Yeasen公司，貨號：34106ES60）、Alexa 594（Yeasen 公司，貨號：33112ES60）標記的熒光二抗和DAPI染液后封片?？贵w稀釋倍數(shù)均為1∶200。使用熒光顯微鏡拍照觀察，并用Image J1.8.0軟件進行熒光面積占比測定。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 19.0、Graphpad prism 10和Image J軟件對熒光免疫結(jié)果進行統(tǒng)計分析和可視化處理。計量資料采用 x ˉ ±s表示，兩組間比較采用成組 t檢驗。特異性基因分析中的P值用Seurat 3.0軟件包中的Wilcoxon秩和檢驗和Bonferroni校正來檢驗，富集分析通過 ClusterProfiler 函數(shù)實現(xiàn)，并使用 Fisher 精確檢驗和FDR矯正。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NASH小鼠肝組織T淋巴細胞亞群的分群和各亞群的變化 從 NASH組小鼠和對照組小鼠的肝臟中分離出單細胞，得到來自對照組的4 336個細胞和來自NASH組的3 893個細胞［8］。通過分析所有細胞中表達不同的基因，共鑒定出21個細胞簇。其中，第6、7簇被鑒定為T淋巴細胞（圖1a）。比較兩組T淋巴細胞亞群的占比情況發(fā)現(xiàn)，第6簇T淋巴細胞的比例從對照組的58.5%降低到NASH組的48.7%，而第7簇T淋巴細胞則從對照組的41.5%增高到NASH組的51.3%（圖1b）。熱圖顯示了第6、7簇T淋巴細胞前10位特異性基因（圖1c）。

2.2 第6簇T淋巴細胞的轉(zhuǎn)錄組學特征 為進一步研究第6簇T淋巴細胞的轉(zhuǎn)錄組學特征，通過t-SNE分析顯示，第6簇T淋巴細胞的前10位特異性基因，包括神經(jīng)元特異性基因2（neuron-specific gene 2，Nsg2）、白細胞分化抗原8b1（the cluster of the differentiation 8 subunit beta 1，Cd8b1）、Cd8a、轉(zhuǎn)錄因子 7（transcription factor 7，Tcf7）（圖2a）和其他6個特異性基因（表1）。通過小提琴圖顯示第6簇前4位特異性基因（圖2b）。表1顯示，65%的第6簇T淋巴細胞表達Tcf7（pct_FC排名第4，但pct_FC前三的基因在第 6 簇 T 淋巴細胞中的表達率均低于50%）。因此Tcf7作為第6簇T淋巴細胞的特征標志基因，定義為Tcf7 + T淋巴細胞亞群。KEGG途徑富集分析顯示，第6簇T淋巴細胞參與T淋巴細胞受體、Th17細胞分化和Th1、Th2細胞分化等多個炎癥相關(guān)信號通路的調(diào)控（圖2c）。GO富集分析結(jié)果顯示，第6簇T淋巴細胞特異表達基因主要參與活化T淋巴細胞、白細胞細胞間黏附、磷酸化的負調(diào)控的生物學過程，核糖體、肌動蛋白細胞骨架、細胞質(zhì)的細胞組分，以及結(jié)合mRNA、結(jié)合泛素樣蛋白連接酶、結(jié)合鳥苷酸的分子功能（圖2d）。

2.3 第7簇T淋巴細胞的轉(zhuǎn)錄組學特征 t-SNE分析發(fā)現(xiàn)，第7簇T淋巴細胞特異性表達白細胞分化抗原40配體基因（Cd40lg）、γ鏈T細胞受體抗原1（T-cell receptors gamma-chain 1，Tcrg-C1）、白細胞介素2受體α（interleukin-2receptor α，Il2rα）、CXC 趨化因子受體 6（C-X-C motif chemokine receptor 6，Cxcr6）（圖3a）和其他6個基因（表2）。通過小提琴圖顯示出第7簇前4位特異性基因（圖3b）。表 2 顯示，在第 7 簇中，90% 的 T 淋巴細胞表達 Cxcr6（pct_FC排名第4，且pct_FC排名前3位的基因在第7簇T淋巴細胞中表達率均低于50%）。因此Cxcr6是第7簇T淋巴細胞的特征標志基因，定義為Cxcr6 + T淋巴細胞亞群。KEGG途徑富集分析顯示，第7簇顯著富集的通路包括T淋巴細胞受體信號通路、Th17細胞分化和MAPK信號通路（圖3c）。GO富集分析顯示，第7簇的特異性基因主要參與T淋巴細胞活化、免疫效應(yīng)過程的調(diào)控、細胞因子產(chǎn)生的生物學過程，細胞質(zhì)、核糖體、神經(jīng)元間突觸的細胞組分，以及結(jié)合嘌呤核糖核苷、結(jié)合GTP、泛素樣蛋白連接酶的分子功能（圖3d）。

2.4 免疫熒光驗證NASH小鼠肝組織中兩種T淋巴細胞的變化 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，NASH組小鼠肝組織Tcf7蛋白和Tcrα蛋白共染陽性區(qū)域顯著減少（1.80%±0.67% vs 0.33%±0.13%，Plt;0.05）（圖4a、b）；而Cxcr6蛋白和Tcrα蛋白共染陽性區(qū)域顯著增加（0.50%±0.09% vs 2.66%±0.33%，Plt;0.001）（圖 4c、d）。以上免疫熒光結(jié)果均與單細胞測序的分析趨勢一致。

3 討論

NASH是NAFLD病情進展的關(guān)鍵階段，以5%以上的肝細胞脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細胞氣球樣變?yōu)樘卣鳎?］，是一種影響了全球約1/4人口的慢性肝臟疾病，可發(fā)展為肝硬化和肝癌［10-11］，是當前研究熱點之一。但NASH發(fā)病機制尚不完全清楚［12］。

T淋巴細胞作為適應(yīng)型免疫的重要組成成分，占肝臟內(nèi)淋巴細胞的50%以上。根據(jù)識別抗原提呈細胞上不同類型的主要組織相容性復合物，T淋巴細胞可以被劃分為CD4 + T淋巴細胞和CD8 + T淋巴細胞［13］。Wolf等 ［14］發(fā)現(xiàn)，在MCD飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟中，CD8 + T淋巴細胞數(shù)量增高且活性增強，并引發(fā)由該種飲食所誘導的肝損傷，但不會影響肝內(nèi)脂質(zhì)代謝。Her等［15］發(fā)現(xiàn)CD4 + T淋巴細胞可能通過釋放促炎因子IL-17A和干擾素γ促進NAFLD有關(guān)的炎癥和脂肪變性向纖維化轉(zhuǎn)變過程。

相比于傳統(tǒng)細胞測序方法，單細胞測序不僅使獲得的遺傳信息更加精確，還能檢測微量的基因表達水平［16］。近年來，單細胞測序技術(shù)的應(yīng)用促進了人們對慢性肝臟疾病中 T淋巴細胞亞群復雜異質(zhì)性的了解。Li等［17］發(fā)現(xiàn)，與健康人群的肝臟相比，NAFLD患者肝臟內(nèi)的CD4 + T淋巴細胞數(shù)目增多，并發(fā)現(xiàn)了CD4 + T淋巴細胞內(nèi)4個差異表達基因（MIGI3、RCAN3、DOCK10和SAMD12）與NAFLD有關(guān)。Huang等［18］發(fā)現(xiàn)，在NAFLD斑馬魚肝臟內(nèi)，CD8 + T淋巴細胞可分為6個亞群（CD8-gzmk、CD8-rorc、CD8-ccl38.6、CD8-lta、CD8-mki67和CD8-mcm4），而CD4 + T淋巴細胞可分為4個亞群（CD4-foxp3a、CD4-cd28、CD4-cebpb和CD4-mki67）。

本研究通過對健康小鼠和MCD誘導的NASH小鼠的肝臟進行單細胞測序，重點研究篩選出的2個T淋巴細胞亞群：（1）第6簇T淋巴細胞在NASH小鼠肝臟中的占比從對照組的58.5%降低到NASH組的48.7%。65%的該簇T淋巴細胞表達Tcf7，因而作為該簇的標志基因。功能富集分析發(fā)現(xiàn)，該T淋巴細胞亞群主要發(fā)揮活化T淋巴細胞、白細胞細胞間黏附、結(jié)合泛素樣蛋白連接酶等作用，并參與調(diào)控Th17、Th1、Th2細胞分化等多個炎癥相關(guān)信號通路。免疫熒光染色結(jié)果證實，NASH組小鼠肝組織中Tcf7 + T淋巴細胞較對照組減少。Tcf7基因編碼產(chǎn)生T淋巴細胞因子1（T cell factor-1，TCF1），并參與Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路，在分化T淋巴細胞方面發(fā)揮重要作用。Yu等［19］發(fā)現(xiàn)，在Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路的調(diào)節(jié)下，TCF1通過誘導Gata結(jié)合蛋白3的產(chǎn)生促進Th2的分化。Th2細胞主要分泌細胞因子IL-4/5/6/10等，主要發(fā)揮抗炎作用［20］。過度表達的TCF1可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并抑制凋亡［21］。Gui等 ［22］發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性肝癌和正常肝組織相比，Tcf7 + CD8 + 記憶T淋巴細胞特異性富集于轉(zhuǎn)移性肝癌中。（2）此外，還發(fā)現(xiàn)第7簇T淋巴細胞的比例從對照組的41.5%增高到NASH組的51.3%。90%的該簇T淋巴細胞表達Cxcr6基因（作為標志基因）。GO富集分析提示，第7簇的特異性基因主要發(fā)揮T淋巴細胞活化和產(chǎn)生細胞因子的功能。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，第7簇T淋巴細胞顯著富集的通路包括T淋巴細胞受體信號通路、Th17細胞分化和MAPK信號通路。同時，免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，NASH組小鼠肝組織中Cxcr6 + T淋巴細胞增加。Cxcr6最初被發(fā)現(xiàn)表達于人類記憶T淋巴細胞［23］，表達Cxcr6基因的CD8 + T淋巴細胞可依賴IL-15促進肝細胞凋亡［24］，激活Cxcr6通路可促進肝內(nèi)自然殺傷T淋巴細胞聚集，進而加重肝內(nèi)炎癥反應(yīng)并促進肝纖維化［25］。但Tcf7 + T淋巴細胞和Cxcr6 + T淋巴細胞在NASH中的具體機制尚未有研究報道，有待進一步地深入研究。

綜上所述，通過 NASH小鼠肝臟的單細胞測序，在NASH中篩選出2個肝組織T淋巴細胞亞群：Tcf7 + T淋巴細胞的占比降低，推測其可能通過促進Th2細胞的分化發(fā)揮抗炎作用；而Cxcr6 + T淋巴細胞的占比增高，推測其可能通過MAPK信號通路發(fā)揮促炎作用。

倫理學聲明：本研究方案于2022年3月1日經(jīng)由上海市東方醫(yī)院（同濟大學附屬東方醫(yī)院）醫(yī)學倫理委員會審批，批號：［2022］研預審第（054）號，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：冒婷負責實驗和數(shù)據(jù)整理分析，撰寫論文；徐銘益負責數(shù)據(jù)分析和撰寫論文；王佳軼負責論文修改，對研究的思路和設(shè)計有關(guān)鍵貢獻。

參考文獻：

[1] YOUNOSSI ZM， KOENIG AB， ABDELATIF D， et al. Global epidemiol?ogy of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence， incidence， and outcomes[J]. Hepatology， 2016， 64（1）：73-84. DOI： 10.1002/hep.28431.

[2] LI J， LI YN， YANG JB， et al. Application of single cell sequencing technology in liver regeneration[J]. Chin J Dig Surg， 2023， 22（5）：663-666. DOI： 10.3760/cma.j.cn115610-20230316-00109.李鑒， 李勇男， 楊建寶， 等. 單細胞測序技術(shù)在肝再生中的應(yīng)用[J]. 中華消化外科雜志， 2023， 22（5）： 663-666. DOI： 10.3760/cma.j.cn115610-20230316-00109.

[3] HUNDERTMARK J， BERGER H， TACKE F. Single cell RNA sequencing in NASH[J]. Methods Mol Biol， 2022， 2455： 181-202. DOI： 10.1007/978-1-0716-2128-8_15.

[4] SU Q， KIM SY， ADEWALE F， et al. Single-cell RNA transcriptome landscape of hepatocytes and non-parenchymal cells in healthy and NAFLD mouse liver[J]. iScience， 2021， 24（11）： 103233. DOI：10.1016/j.isci.2021.103233.

[5] KODA Y， TERATANI T， CHU PS， et al. CD8 + tissue-resident memory T cells promote liver fibrosis resolution by inducing apoptosis of he?patic stellate cells[J]. Nat Commun， 2021， 12（1）： 4474. DOI： 10.1038/s41467-021-24734-0.

[6] LI WG， ZHOU YW， ZHANG XZ. Level and correlation of peripheral blood hypoxia-inducible factor-1α， regulatory T cell and helper T cell and inflammatory cytokines in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J/CD]. Chin J Liver Dis Electron Version， 2020， 12（4）：83-88. DOI： 10.3969/j.issn.1674-7380.2020.04.015.李文剛， 周運王， 張學政. 非酒精性脂肪性肝病患者外周血缺氧誘導因子-1α、調(diào)節(jié)性T細胞和輔助性T細胞17與炎性細胞因子水平及其相關(guān)性[J/CD]. 中國肝臟病雜志（電子版）， 2020， 12（4）： 83-88. DOI： 10.3969/j.issn.1674-7380.2020.04.015.

[7] LI Y， DU ZX， WANG MT， et al. Correlation between disease progres?sion and levels of T cells in patients with non-alcoholic fatty liver dis?ease[J]. J Clin Med Pract， 2020， 24（14）： 11-14， 18. DOI： 10.7619/jcmp.202014003.李陽， 杜志祥， 王牧婷， 等. 非酒精性脂肪性肝病患者病情進展與T細胞水平的相關(guān)性研究[J]. 實用臨床醫(yī)藥雜志， 2020， 24（14）： 11-14， 18.DOI： 10.7619/jcmp.202014003.

[8] LI HY， GAO YX， WU JC， et al. Single-cell transcriptome reveals a novel mechanism of C-Kit + -liver sinusoidal endothelial cells in NASH[J]. Cell Biosci， 2024， 14（1）： 31. DOI： 10.1186/s13578-024-01215-7.

[9] National Workshop on Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease， Chi?nese Society of Hepatology， Chinese Medical Association， Fatty Liver Expert Committee， Chinese Medical Doctor Association. Guidelines of prevention and treatment for nonalcoholic fatty liver disease： A 2018update[J]. J Clin Hepatol， 2018， 34（5）： 947-957. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2018.05.007.中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組， 中國醫(yī)師協(xié)會脂肪性肝病專家委員會. 非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018年更新版）[J].臨床肝膽病雜志， 2018， 34（5）： 947-957. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2018.05.007.

[10] YOUNOSSI Z， TACKE F， ARRESE M， et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis[J].Hepatology， 2019， 69（6）： 2672-2682. DOI： 10.1002/hep.30251.

[11] ZHANG SL， CAO MM， YANG F， et al. Analysis of the change trend of etiological burden of disease of liver cancer in the Chinese popula?tion from 1990 to 2019[J]. Chin J Dig Surg， 2023， 22（1）： 122-130.DOI： 10.3760/cma.j.cn115610-20221112-00687.張紹麗， 曹毛毛， 楊帆， 等. 1990—2019年中國人群肝癌各病因疾病負擔變化趨勢分析[J]. 中華消化外科雜志， 2023， 22（1）： 122-130. DOI：10.3760/cma.j.cn115610-20221112-00687.

[12] HARDY T， OAKLEY F， ANSTEE QM， et al. Nonalcoholic fatty liver disease： Pathogenesis and disease spectrum[J]. Annu Rev Pathol，2016， 11： 451-496. DOI： 10.1146/annurev-pathol-012615-044224.

[13] NOUREDDIN M， SANYAL AJ. Pathogenesis of NASH： The impact of multiple pathways[J]. Curr Hepatol Rep， 2018， 17（4）： 350-360. DOI：10.1007/s11901-018-0425-7.

[14] WOLF MJ， ADILI A， PIOTROWITZ K， et al. Metabolic activation of in?trahepatic CD8 + T cells and NKT cells causes nonalcoholic steato?hepatitis and liver cancer via cross-talk with hepatocytes[J]. Can?cer Cell， 2014， 26（4）： 549-564. DOI： 10.1016/j.ccell.2014.09.003.

[15] HER Z， TAN JHL， LIM YS， et al. CD4 + T cells mediate the develop?ment of liver fibrosis in high fat diet-induced NAFLD in humanized mice[J]. Front Immunol， 2020， 11： 580968. DOI： 10.3389/fimmu.2020.580968.

[16] ZHANG YZ， FU BQ， NIU CY， et al. The development of single cell se?quencing[J]. Acta Metrol Sin， 2023， 44（1）： 149-156. DOI： 10.3969/j.issn.1000-1158.2023.01.22.張永卓， 傅博強， 牛春艷， 等 . 單細胞測序技術(shù)的發(fā)展[J]. 計量學報，2023， 44（1）： 149-156. DOI： 10.3969/j.issn.1000-1158.2023.01.22.

[17] LI DR， ZHANG ZJ， ZHANG C， et al. Unraveling the connection be?tween Hashimoto’s Thyroiditis and non-alcoholic fatty liver disease：Exploring the role of CD4 + central memory T cells through integrated genetic approaches[J]. Endocrine， 2024， 85（2）： 751-765. DOI： 10.1007/s12020-024-03745-z.

[18] HUANG YY， LIU X， WANG HY， et al. Single-cell transcriptome land?scape of zebrafish liver reveals hepatocytes and immune cell inter?actions in understanding nonalcoholic fatty liver disease[J]. Fish Shellfish Immunol， 2024， 146： 109428. DOI： 10.1016/j.fsi.2024.109428.

[19] YU Q， SHARMA A， OH SY， et al. T cell factor 1 initiates the T helper type 2 fate by inducing the transcription factor GATA-3 and repress?ing interferon-gamma[J]. Nat Immunol， 2009， 10（9）： 992-999. DOI：10.1038/ni.1762.

[20] ROLLA S， ALCHERA E， IMARISIO C， et al. The balance between IL-17 and IL-22 produced by liver-infiltrating T-helper cells critically controls NASH development in mice[J]. Clin Sci （Lond）， 2016， 130（3）： 193-203. DOI： 10.1042/CS20150405.

[21] WANG ZY. Review on the mechanism of T-cell factor 3 in the pro?gression and metastasis of hepatocellular carcinoma[J]. J World Latest Med Inf， 2024， 24（16）： 43-46. DOI： 10.3969/j.issn.1671-3141.2024.016.009.王梓伊. T細胞因子3促進肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制的綜述[J]. 世界最新醫(yī)學信息文摘， 2024， 24（16）： 43-46. DOI： 10.3969/j.issn.1671-3141.2024.016.009.

[22] GUI MH， HUANG SL， LI SZ， et al. Integrative single-cell transcrip?tomic analyses reveal the cellular ontological and functional hetero?geneities of primary and metastatic liver tumors[J]. J Transl Med，2024， 22（1）： 206. DOI： 10.1186/s12967-024-04947-9.

[23] UNUTMAZ D， XIANG W， SUNSHINE MJ， et al. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse[J]. J Immunol， 2000， 165（6）： 3284-3292. DOI： 10.4049/jimmunol.165.6.3284.

[24] DUDEK M， PFISTER D， DONAKONDA S， et al. Auto-aggressive CXCR6 + CD8 T cells cause liver immune pathology in NASH[J]. Na?ture， 2021， 592（7854）： 444-449. DOI： 10.1038/s41586-021-03233-8.

[25] WEHR A， BAECK C， HEYMANN F， et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflam?mation and liver fibrosis[J]. J Immunol， 2013， 190（10）： 5226-5236.DOI： 10.4049/jimmunol.1202909.

收稿日期：2024-07-24；錄用日期：2024-09-23

本文編輯：林姣

引證本文：MAO T， XU MY， WANG JY. Characteristics of T cells in the liver tissues of mice with nonalcoholic steatohepatitis[J].J Clin Hepatol， 2025， 41（3）： 461-468.

冒婷， 徐銘益， 王佳軼 . 非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型肝組織 T淋巴細胞的特征分析[J]. 臨床肝膽病雜志， 2025， 41（3）：461-468.