摘 要 以金枕榴蓮的花粉為材料,采用新鮮花粉直接噴金法和常規(guī)生物電鏡樣品制備2種方法處理,對(duì)榴蓮花粉進(jìn)行了掃描電鏡觀察,分析了榴蓮花粉的形態(tài)特征并比較了2種處理方法對(duì)花粉電鏡觀察的影響。結(jié)果表明:金枕花粉粒為球形,大小為(60.99±3.50)μm×(62.57±3.77)μm,P/E值為0.98±0.04?;ǚ勖劝l(fā)器官為散孔,萌發(fā)孔有圓形和橢圓形兩種,大小為(14.04±1.70)μm×(9.29±1.35)μm,P/E值1.53±0.17,單個(gè)花粉粒萌發(fā)孔數(shù)量不一,萌發(fā)孔數(shù)量(單面)多為1~3個(gè)。榴蓮花粉含水量較豐富,外壁柔軟易褶皺變形,直接噴金法很難維持花粉的正常形態(tài),常規(guī)制樣方法雖處理復(fù)雜,但能保持花粉形態(tài)與表面特征完整。明晰了金枕榴蓮花粉粒形態(tài)特征,為研究榴蓮的遺傳多樣性提供科學(xué)依據(jù),并對(duì)榴蓮花粉電鏡樣品處理有重要的指導(dǎo)意義。
關(guān)鍵詞 金枕榴蓮;花粉形態(tài);掃描電鏡;制樣方法
中圖分類號(hào):S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.05.016
榴蓮(Durio zibethinus Murr.)屬錦葵科(Malvaceae)榴蓮屬(Durio),又名韶子、麝香貓果,是一種全球聞名的熱帶水果,因其獨(dú)特的香氣、特色的外殼和濃郁的味道在全世界范圍內(nèi)大受歡迎,被譽(yù)為“水果之王”[1]。榴蓮富含蛋白質(zhì)、脂類和氨基酸,有強(qiáng)大的保健功能,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中,榴蓮提取物可作為消炎藥治療炎癥和水腫,榴蓮蛋白酶還可治療支氣管炎、急性肺炎等多種炎癥[2]。榴蓮原產(chǎn)于東南亞[3],根據(jù)泰中農(nóng)業(yè)貿(mào)易協(xié)會(huì)提供的數(shù)據(jù),2023年全球榴蓮產(chǎn)量主要集中在印度尼西亞(35.4%)、泰國(guó)(33.2%)、越南(19.3%)和馬來(lái)西亞(11.2%)等國(guó),其中印度尼西亞是全球最大的榴蓮生產(chǎn)國(guó),榴蓮產(chǎn)量高達(dá)158萬(wàn)t。2024年中國(guó)—東盟榴蓮產(chǎn)業(yè)大會(huì)發(fā)布的數(shù)據(jù)表明,我國(guó)是榴蓮消費(fèi)大國(guó),2023年鮮榴蓮進(jìn)口量與進(jìn)口額均創(chuàng)歷史新高,分別達(dá)142.59萬(wàn)t和67.16億美元,約占全球出口榴蓮的82%,較2022年分別增長(zhǎng)了72.87%和65.56%[4]。自2019年德勝40株景觀榴蓮開花結(jié)果事件以來(lái),我國(guó)榴蓮種植業(yè)進(jìn)入規(guī)模化種植階段[5]。目前,我國(guó)榴蓮栽培區(qū)域主要集中在北緯18°以南,即海南省三亞、樂東、保亭和萬(wàn)寧等地;廣西、廣東和云南均有少量種植。據(jù)2024年相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)榴蓮栽培面積約2 667 hm2,掛果面積約267 hm2,產(chǎn)量約250 t,榴蓮產(chǎn)業(yè)展現(xiàn)出了巨大的發(fā)展?jié)摿褪袌?chǎng)價(jià)值。
前人研究發(fā)現(xiàn),我國(guó)榴蓮研究領(lǐng)域主要集中在外殼吸附性能、風(fēng)味物質(zhì)、果實(shí)采后貯藏品質(zhì)、果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)功能成分等方面,而種植技術(shù)、種質(zhì)資源引種試種、優(yōu)良品種選育、病蟲害防控等方面研究較少[6]?;ǚ郏鳛橹参锝缰谐休d著遺傳信息的雄性生殖細(xì)胞,在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程中演化出獨(dú)特形態(tài)特征?;ǚ劢Y(jié)構(gòu)遺傳保守性好,因此在花粉分析、鑒定時(shí),花粉形態(tài)研究是基礎(chǔ)之一[7],而掃描電鏡的發(fā)展帶動(dòng)了花粉形態(tài)學(xué)研究[8]。掃描電鏡能提供高分辨率的圖像,常用于觀察植物的根莖表皮及其橫切面形態(tài),如花粉粒的三維立體形態(tài)、種子與果實(shí)的整體形態(tài)、種皮特征和孢子的微觀形態(tài)等[9]。近年來(lái)掃描電子顯微鏡的應(yīng)用能直接且清晰地揭示植物花粉的形狀、大小及外壁紋飾、生殖孔形態(tài)等超微結(jié)構(gòu)特征,不僅加深了對(duì)花粉形態(tài)復(fù)雜性的認(rèn)識(shí),更為植物在屬、亞屬乃至種間水平的分類、鑒別與分析提供了強(qiáng)有力的證據(jù)與依據(jù)[10]。榴蓮自交授粉很難,授粉不良,有的自花不育,因此主要依賴異花授粉。而在榴蓮栽培中,人工輔助授粉才能保障榴蓮生長(zhǎng),因此,研究榴蓮花粉對(duì)榴蓮育種具有重要影響。在榴蓮花粉的研究方面,對(duì)不同品種榴蓮花粉活性及人工授粉已有相關(guān)研究[11],而關(guān)于榴蓮花粉掃描電鏡的形態(tài)觀察未見有報(bào)道。
此研究以金枕榴蓮為材料,利用新鮮花粉直接噴金法和常規(guī)生物電鏡樣品制備2種方法對(duì)金枕榴蓮花粉的形態(tài)特征進(jìn)行觀察,以明確適合榴蓮成熟花粉掃描電鏡觀察的方法,進(jìn)一步明晰榴蓮花粉粒形態(tài)特征,為研究榴蓮遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。
1" 材料與方法
1.1" 試驗(yàn)材料
采樣地位于海南省保亭黎族苗族自治縣七仙嶺全球熱帶果樹博覽中心的榴蓮種植基地。保亭黎族苗族自治縣屬于熱帶季風(fēng)氣候,雨熱充沛,年平均氣溫24.2~26.2 ℃,年平均降水量1 575.1~2 324.7 mm,是適宜榴蓮種植的區(qū)域之一。于2022年5月和8月榴蓮盛花期,任意選取3株3~5年生健康的金枕榴蓮樹,每株環(huán)繞四周采摘6朵花瓣剛展開、大小相似、無(wú)損傷的榴蓮花,每朵花單獨(dú)置于1個(gè)封口袋中備用。
1.2" 試驗(yàn)方法
1.2.1" 常規(guī)掃描電鏡樣品制備及觀察
榴蓮花粉常規(guī)掃描電鏡樣品的制備參考何樂平等[12]方法。選取新鮮榴蓮花,用鑷子摘取完好的花囊5~8個(gè),置于2 mL 離心管中,加入1 mL 由0.1 mol·L-1、pH值6.8磷酸緩沖液配制而成的2.5%戊二醛溶液,4 ℃條件下固定12 h;0.1 mol·L-1、pH值6.8磷酸緩沖液漂洗15 min,漂洗3次,以確保沖洗掉固定液;然后進(jìn)行酒精梯度脫水,酒精濃度梯度由低至高依次為30%、50%、70%、85%、95%和100%,每梯度脫水15 min;隨后用乙酸異戊酯置換材料中的酒精,每次15 min,重復(fù)2次;用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥,干燥后在解剖鏡下用解剖針剖開花藥,取出花粉,將花粉粘在樣品臺(tái)上,噴金,使用日立TM4000PIus 掃描電鏡對(duì)花粉的形狀、外壁紋飾等進(jìn)行觀測(cè)拍照,測(cè)量單?;ǚ鄣臉O軸長(zhǎng)(P)和赤道軸長(zhǎng)(E)。
1.2.2" 新鮮花粉直接噴金法掃描電鏡樣品的制備及觀察
在顯微鏡下,直接取出花粉粒群粘于導(dǎo)電膠的一面,另一面粘于掃描顯微鏡樣品臺(tái),使用直接噴金的方法,用掃描電鏡(日立 HITACHI S-3400N)對(duì)花粉進(jìn)行觀察并拍照記錄相關(guān)數(shù)據(jù),具體方法見參考文獻(xiàn)[12]。使用日立TM4000PIus 掃描電鏡對(duì)榴蓮花粉的形狀、花粉狀態(tài)、外壁紋飾和萌發(fā)孔等進(jìn)行觀測(cè)拍照,并測(cè)量單?;ǚ鄣臉O軸長(zhǎng)(P)和赤道軸長(zhǎng)(E),萌發(fā)孔大小等數(shù)據(jù)。
2" 結(jié)果與分析
由圖1a、1b、1c可知,金枕榴蓮的花粉粒為圓球形,大小為(60.99±3.50)μm×(62.57±3.77)μm,P/E值為0.98±0.04。花粉萌發(fā)器官為散孔,萌發(fā)孔有圓形和橢圓形兩種,大小為(14.04±1.70)μm×(9.29±1.35)μm,P/E值1.53±0.17,單個(gè)花粉粒萌發(fā)孔數(shù)量不一,萌發(fā)孔數(shù)量(單面)多為1~3個(gè)(圖1a、圖1b),包括孔蓋和孔環(huán),無(wú)花粉外壁的區(qū)域呈環(huán)狀,被一圈向外突起的、類似于瓶口的“孔環(huán)”結(jié)構(gòu)包圍,中央則被蓋子狀的“孔蓋”結(jié)構(gòu)覆蓋(圖1b)。萌發(fā)孔散布于球面,花粉外壁光滑,無(wú)明顯紋飾。
采用常規(guī)掃描電鏡樣品制備方法處理金枕榴蓮成熟花粉,在掃描電鏡下可觀察到完整的花粉形態(tài),花粉顆粒飽滿,萌發(fā)孔結(jié)構(gòu)、花粉外壁形態(tài)清晰可見,十分容易辨認(rèn),花粉間分散性較好,粘連程度低(圖1c),但花粉粒表面容易粘連其他細(xì)小雜質(zhì),但不影響總體形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察。相比之下,使用新鮮花粉直接噴金法觀察榴蓮花粉,花粉粒凹陷變形,脫水皺縮,花粉外壁出現(xiàn)褶皺甚至破裂,萌發(fā)孔形態(tài)模糊變形,難以辨認(rèn)(圖1d、圖1e);花粉間分散性差,花粉粒成堆粘連、交叉重疊(圖1f),難以觀察其外壁形態(tài)與結(jié)構(gòu)。
3" 討論與結(jié)論
榴蓮屬于被子植物門雙子葉植物綱錦葵目錦葵科榴蓮屬,也有人認(rèn)為榴蓮屬于錦葵目木棉科。錦葵目錦葵科的蜀葵Althaea rosea、木芙蓉Hibiscus mutabilis、海島棉Gossypium barbadense、冬葵 Malva crispa花粉的掃描電鏡發(fā)現(xiàn),這些花粉均為球形,花粉粒比榴蓮花粉略大[13]。其中蜀葵花粉表面紋飾均有刺狀紋,具體表現(xiàn)為二型刺,其突起(第二型刺)明顯短于第一型刺,形似瘤狀突起,先端圓滑,不同品種蜀葵花粉的突起長(zhǎng)度不一、數(shù)量不一[14]。據(jù)前人研究總結(jié),錦葵科植物花粉形態(tài)的進(jìn)化趨勢(shì)基本如下:花粉形狀由近球形轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐?,花粉大小由中等(直?5~50 μm)演變?yōu)檩^大(直徑50~100 μm),再到大(100~200 μm),萌發(fā)孔由3孔溝演變?yōu)樯⒖?,表面紋飾由短刺轉(zhuǎn)變?yōu)槎痛?;花粉表面平滑轉(zhuǎn)變?yōu)榛ǚ郾砻婷芗w粒狀突起[15-16]。金枕榴蓮花粉粒為球形,大小為(60.99±3.50)μm×(62.57±3.77)μm,P/E值為0.98±0.04,花粉萌發(fā)器官為散孔,說(shuō)明金枕榴蓮在錦葵科中可能屬于較原始的類群。
植物各品種間的花粉特征存在差異,因此,可以根據(jù)花粉形態(tài)等特征進(jìn)行歸類,并大致判斷物種間的親緣關(guān)系。在錦葵目木棉科木棉樹Bombax malabaricum的花粉觀察實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),木棉花粉粒比金枕榴蓮花粉略大,且極面觀為三角形,赤面觀為橢圓形,表面紋飾為粗網(wǎng)狀[11],花粉形態(tài)與金枕榴蓮花粉差異較大。因此,推測(cè)金枕榴蓮在分類上更接近錦葵科。
掃描電鏡具有高分辨率、圖像清晰、立體直觀等優(yōu)良特點(diǎn),目前已被廣泛運(yùn)用于植物孢子、花粉等微觀形態(tài)的觀察?;ǚ蹣悠分苽涫潜WC掃描電鏡觀察結(jié)果清晰且準(zhǔn)確的關(guān)鍵步驟[17]。不同種類或相同種類不同成熟度的花粉,有不同的花粉樣品制備方法。何樂平等[12]認(rèn)為,采用直接噴金的方法更適合成熟的擬南芥花粉觀察;而常規(guī)的樣品制作方法能保持發(fā)育早期的花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整度,更有利于發(fā)育早期的花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察。在梔子屬花粉的研究中發(fā)現(xiàn),花粉外壁較薄且含水量較高,如果使用直接干燥的方法,花粉粒的水分流失迅速,同時(shí)受到表面張力的作用,花粉表面結(jié)構(gòu)易塌陷、皺縮及變形[18],因此,梔子屬花粉形態(tài)掃描電鏡觀察宜采用常規(guī)掃描電鏡樣品制備方法。直接噴金法簡(jiǎn)單便捷、費(fèi)時(shí)短、能保持花粉的活體狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn),此法能較好地保持青島老鸛草花粉的原始狀態(tài),且花粉表面的細(xì)微結(jié)構(gòu)清晰可見[19]。因此,直接噴金處理材料的方法更適合老鸛草花粉的掃描電鏡觀察。在枇杷花粉電鏡觀察的實(shí)驗(yàn)中,研究者比較觀測(cè)了新鮮花粉、風(fēng)干花粉、戊二醛固定花粉和醋酸酐分解花粉的形態(tài),發(fā)現(xiàn)戊二醛固定花粉、醋酸酐分解花粉與新鮮花粉的形狀、大小均無(wú)差異,僅風(fēng)干花粉外壁表面大都發(fā)生不同程度的凹陷或萎縮[20],因此,使用戊二醛固定花粉的常規(guī)制作方法更適合枇杷花粉的掃描電鏡觀察。
與直接噴金法相比,常規(guī)電鏡處理方法主要用到戊二醛、磷酸緩沖液、超臨界CO2等樣品。戊二醛作為一種高效的固定劑,在維持花粉等細(xì)微生物結(jié)構(gòu)方面起著重要作用,能夠牢固地固定花粉顆粒,確保在后續(xù)處理步驟中,花粉形態(tài)與表面特征得以完好保留。采用磷酸緩沖液進(jìn)行漂洗是這一流程中的關(guān)鍵步驟。磷酸緩沖液不僅能有效去除花粉表面附著的雜質(zhì)、多余黏液等不利因素,還能通過其適宜的pH值環(huán)境保護(hù)花粉內(nèi)部的生物活性物質(zhì)不受破壞,進(jìn)一步提升了樣品的純凈度和觀察質(zhì)量。在干燥環(huán)節(jié),利用超臨界CO2的獨(dú)特性質(zhì),在接近其臨界溫度和壓力的條件下進(jìn)行干燥,能徹底消除傳統(tǒng)干燥方法中因液體表面張力引起的樣品收縮和損傷問題。這樣一來(lái),花粉樣品在干燥過程中能保持原有的形態(tài)和細(xì)節(jié),極大地提高了掃描電鏡下觀察的圖像清晰度和分辨率。
在選擇花粉掃描電鏡處理方法時(shí),應(yīng)根據(jù)花粉的種類、發(fā)育時(shí)期及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡染唧w情況進(jìn)行處理。常規(guī)制作方法適用范圍廣,花粉形態(tài)與表面特征完整度較高,但制作方法復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格,對(duì)于某些外壁較厚且含水量低的花粉[21]來(lái)說(shuō),直接噴金法掃描電鏡觀察即可滿足研究需要。榴蓮花粉含水量較豐富,外壁柔軟容易褶皺變形,直接噴金法掃描電鏡觀察很難維持花粉較正常的形態(tài),因此,在榴蓮花粉的電鏡觀察實(shí)驗(yàn)中建議采用常規(guī)制樣方法。
榴蓮的生殖生物學(xué)研究中,榴蓮花粉形態(tài)對(duì)于理解榴蓮的適應(yīng)性、進(jìn)化歷程及繁殖機(jī)制至關(guān)重要。為了更深入地探究榴蓮花粉的形態(tài)特征,采用新鮮材料花粉直接噴金與常規(guī)生物電鏡樣品制備2種方法對(duì)金枕榴蓮花粉進(jìn)行了觀察,豐富了對(duì)榴蓮屬花粉形態(tài)的認(rèn)識(shí),并推動(dòng)榴蓮屬花粉聚類分析等相關(guān)研究的進(jìn)程。將新鮮材料花粉直接噴金與常規(guī)生物電鏡樣品制備2種方法相結(jié)合對(duì)比,能夠相互驗(yàn)證2種方法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過對(duì)比分析2種方法下榴蓮花粉的形態(tài)特征可進(jìn)一步探討樣品制備過程對(duì)花粉形態(tài)的影響,優(yōu)化樣品處理流程,提高形態(tài)分析的準(zhǔn)確性和效率。此外,這一研究還將為榴蓮種質(zhì)資源的保護(hù)、遺傳改良及人工授粉技術(shù)的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù),促進(jìn)榴蓮產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。未來(lái),隨著電鏡技術(shù)的不斷進(jìn)步和跨學(xué)科融合,更簡(jiǎn)單可靠的掃描電鏡處理方法將在榴蓮花粉形態(tài)學(xué)、植物系統(tǒng)學(xué)及農(nóng)業(yè)育種等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用,為探索植物生殖生物學(xué)的奧秘貢獻(xiàn)更多力量。
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(責(zé)任編輯:易" 婧)
收稿日期:2024-10-03
基金項(xiàng)目:熱帶果樹榴蓮種質(zhì)資源的收集引進(jìn)、鑒定評(píng)價(jià)及本土種苗繁育技術(shù)研究(ZDYF2021XDNY116)。
作者簡(jiǎn)介:張琳(2001—),在讀碩士,主要從事熱帶果樹栽培及病蟲害防治研究。E-mail:luckyliana@163.com。
*為通信作者,E-mail:zhifu555@163.com。