摘 要：熱帶地區(qū)植物資源種類(lèi)豐富，有極大的種質(zhì)資源安全保存需求。超低溫（液氮）凍存是植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的重要手段，雖需針對(duì)特定物種進(jìn)行技術(shù)優(yōu)化，但在實(shí)際應(yīng)用后最為節(jié)省空間，且只需定期補(bǔ)充液氮，極大降低了種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存過(guò)程中的人力物力投入。經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，植物超低溫保存技術(shù)現(xiàn)已在種子、莖尖、花粉等多種類(lèi)型材料上實(shí)現(xiàn)冷凍后成活與再生。為系統(tǒng)總結(jié)并全面介紹超低溫保存技術(shù)在熱帶作物種質(zhì)資源安全保存和農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中的應(yīng)用，本綜述以休眠莖段和試管苗莖尖的超低溫保存為主線(xiàn)，回顧了植物超低溫保存的研究歷史與技術(shù)發(fā)展，側(cè)重介紹了超低溫保存技術(shù)在熱帶作物莖尖、種子（胚）、花粉、細(xì)胞懸浮系和愈傷組織中的研究進(jìn)展；同時(shí)也對(duì)熱帶作物超低溫保存后遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)研究進(jìn)行介紹，展望了超低溫保存在熱帶作物莖尖、頑拗性種子和胚性愈傷組織和細(xì)胞等材料長(zhǎng)期保存中的重要作用。

關(guān)鍵詞：熱帶作物；超低溫保存；種質(zhì)資源；遺傳穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

植物種質(zhì)資源保存是種質(zhì)創(chuàng)制和作物育種工作的基礎(chǔ)，目前主要有棲息地原位保存、種質(zhì)圃和種子庫(kù)保存、離體試管保存和離體超低溫保存等方式[1-3]。我國(guó)十分重視作物種質(zhì)資源的安全保存工作，現(xiàn)已建立一系列的國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)、植物園和種質(zhì)資源圃（庫(kù)）以安全保存作物及其野生資源[3]。熱帶地區(qū)植物遺傳多樣性豐富，其多樣的種質(zhì)資源經(jīng)過(guò)人類(lèi)數(shù)千年的馴化和傳播，形成眾多全球性的重要作物。2022 年全球產(chǎn)量最高的十大作物中有6 種（甘蔗、玉米、水稻、油棕、木薯和番茄）起源于熱帶地區(qū)[4]。這些作物的產(chǎn)業(yè)發(fā)展在保障全球糧食安全和助力消除貧困上具有極大的發(fā)展前景[5-6]。然而傳統(tǒng)的熱帶作物資源田間保存受到極端天氣和病蟲(chóng)害的威脅；其野生資源也受到耕地開(kāi)墾和土地開(kāi)發(fā)等人為因素的影響，亟需加強(qiáng)重要熱帶作物資源的離體保存工作[1]。

種子凍存是最為簡(jiǎn)單的作物離體資源保存方式[7]。然而多數(shù)熱帶作物種子不耐低溫和脫水干燥，無(wú)法干燥后直接凍存；甘蔗、香蕉和甘薯等重要熱帶作物資源主要依賴(lài)無(wú)性繁殖，難以獲得種子進(jìn)行凍存[8]，因此，試管苗保存和超低溫保存是熱帶作物資源離體保存的2 種主要方式[8-9]。

超低溫保存技術(shù)可將種質(zhì)資源凍存在液氮（?196 ℃）或液氮蒸汽（?196～?150 ℃）中，該溫度下細(xì)胞分裂和代謝等生命活動(dòng)停滯，由此降低離體組織培養(yǎng)長(zhǎng)期繼代導(dǎo)致的遺傳變異風(fēng)險(xiǎn)，是長(zhǎng)期保存種質(zhì)資源的理想方式[7-8， 10]。植物離體材料超低溫保存工作開(kāi)展前需要建立和優(yōu)化超低溫冷凍再生體系，經(jīng)過(guò)60 余年的發(fā)展，目前已在植物上實(shí)現(xiàn)種子（胚）、冬季休眠莖段、莖尖、花粉、懸浮細(xì)胞和胚性愈傷組織等材料的冷凍后再生[11]。超低溫保存體系主要依賴(lài)于植物組織培養(yǎng)，雖體系優(yōu)化耗費(fèi)一定時(shí)間和人力物力，但體系建立后只需定期補(bǔ)充液氮，可大大降低后續(xù)人力物力投入，是國(guó)際公認(rèn)最為經(jīng)濟(jì)的種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存方式[8]。

面對(duì)種質(zhì)資源安全保存技術(shù)的實(shí)際需求，本研究將對(duì)植物超低溫保存技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用進(jìn)行綜述，并介紹該技術(shù)在重要熱帶作物種質(zhì)資源安全保存的研究和實(shí)際應(yīng)用，有利于促進(jìn)超低溫保存技術(shù)更好地服務(wù)于熱帶作物種質(zhì)資源安全保存和科研育種工作。

1 植物超低溫保存技術(shù)的歷史與發(fā)展

20 世紀(jì)中葉，溫帶木本作物冬季休眠枝條的液氮超低溫保存首次獲得成功[12]。隨后超低溫保存技術(shù)在試管苗莖尖上的發(fā)展極大地促進(jìn)了植物無(wú)性繁殖材料的超低溫保存，也影響了其他類(lèi)型植物材料的超低溫保存方式。

1.1 休眠莖段的超低溫保存

20 世紀(jì)50 年代末，超低溫保存首先在溫帶桑樹(shù)冬季休眠枝條上開(kāi)展優(yōu)化[12]。該研究切取直徑0.8 cm、長(zhǎng)度為2～15 cm 的休眠莖段，在程序降溫儀中以0.5 ℃/min 的速率降溫至?30 ℃后迅速投入液氮中進(jìn)行保存。莖段超低溫保存結(jié)束后移入?30 ℃保持4 h，隨后轉(zhuǎn)入0 ℃環(huán)境進(jìn)一步恢復(fù)[12]。該體系應(yīng)用扦插技術(shù)對(duì)莖段恢復(fù)培養(yǎng)，并成功獲得柳樹(shù)（Salix sp.）和楊樹(shù)（Populus sp.）的超低溫保存再生植株[12]。該技術(shù)后續(xù)應(yīng)用芽接等技術(shù)對(duì)超低溫保存后的休眠莖段進(jìn)行恢復(fù)再生，并在蘋(píng)果、梨、樹(shù)莓等木本作物的超低溫保存中獲得成功[13]。美國(guó)農(nóng)業(yè)部的作物種質(zhì)資源保存中心應(yīng)用超低溫保存技術(shù)保存超過(guò)2100 份的蘋(píng)果資源（Malus spp.），超過(guò)90%的基因型材料能夠達(dá)到40%的再生率[14]。然而該技術(shù)僅適用于溫帶耐寒作物的超低溫保存，且需要在休眠期取材，無(wú)法應(yīng)用于熱帶作物的安全保存。

1.2 早期試管苗莖尖一步與兩步冷凍法

基于植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，20 世紀(jì)70年代后期有學(xué)者開(kāi)始研究植物離體資源的超低溫保存，并在馬鈴薯（Solanum goniocalyx）試管苗莖尖上獲得植株再生[15]。該方法切取馬鈴薯帶2～4 片葉原基的試管苗莖尖，在含有1.0 mg/LBenzyladenien（BA）的培養(yǎng)基上穩(wěn)定培養(yǎng)3 d 后置于10%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液進(jìn)行1 h 冷凍保護(hù)，隨后投入液氮進(jìn)行冷凍保存。解凍時(shí)將莖尖快速轉(zhuǎn)入35 ℃的液體培養(yǎng)基中浸沒(méi)1 min，隨后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)，得到11%的莖尖再生率。早期的試管苗莖尖超低溫保存體系多用DMSO 進(jìn)行冷凍保護(hù)，且多參照休眠莖段超低溫保存方法應(yīng)用兩步法進(jìn)行冷凍，在馬鈴薯[16]、草莓（Fragaria×ananassaDuch. cv. Redcoat）[17]和木薯（Manihot esculentaCrantz）[18]等作物上獲得冷凍后再生。然而兩步冷凍法需將莖尖緩慢降溫至-30～-20 ℃，會(huì)給非休眠狀態(tài)的莖尖組織帶來(lái)極大的低溫傷害，因此，在熱帶作物超低溫保存中的實(shí)際應(yīng)用極其有限。

1.3 包埋干燥法

受20 世紀(jì)80 年代應(yīng)用海藻酸鈣包埋植物組織制作人工種子的啟示[19]，F(xiàn)ABRE 等[20]在馬鈴薯莖尖超低溫保存中先將浸有莖尖的3%海藻酸鈉溶液滴入0.1 mol/L 的氯化鈣溶液，生成包裹著莖尖的海藻酸鈣小球。隨后應(yīng)用0.5 mol/L 蔗糖對(duì)包埋后的莖尖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，接著在無(wú)菌空氣流中干燥4 h 后將包埋有莖尖的小球轉(zhuǎn)入冷凍管中投入液氮進(jìn)行凍存，由此建立包埋干燥法。在隨后的十多年間，此方法在蘋(píng)果、柑橘（Citrus spp.）、葡萄（Vitis spp.）和菊花（Chrysanthemum morifolium）等作物的莖尖、愈傷組織、體胚等材料上獲得成功[21]。該方法應(yīng)用物理干燥的方式對(duì)材料進(jìn)行冷凍保護(hù)，不適合對(duì)脫水干燥敏感的物種。包埋干燥法在熱帶作物如木薯[22]和咖啡（Coffeaspp.）[23]莖尖的超低溫保存中也有報(bào)道，但獲得較低再生率并表現(xiàn)很強(qiáng)的基因型差異性。

1.4 玻璃化法與包埋玻璃化法

1990 年，一種名為植物玻璃化溶液（plantvitrification solution， PVS）的冷凍保護(hù)劑首次應(yīng)用于柑橘懸浮細(xì)胞的超低溫保存[24]。該溶液包含有甘油（30%，W/V）、乙二醇（15%，W/V）、二甲基亞砜（15%，W/V）和0.4 mol/L 的蔗糖，且冷凍和解凍過(guò)程中在?115 ℃附近表現(xiàn)明顯的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變[24]。應(yīng)用該溶液作為冷凍保護(hù)劑可極大地減少冷凍和解凍中植物細(xì)胞內(nèi)外的自由水結(jié)晶，降低冷凍傷害[24]。在莖尖超低溫保存中，PVS2溶液于1991 年首次應(yīng)用于康乃馨（Diathus caryophyllusL.）的莖尖，該方法將莖尖使用海藻酸鈣包埋后進(jìn)行PVS2 冷凍保護(hù)，被稱(chēng)為包埋玻璃化法（encapsulation-vitrification）[25]。一年后，PVS2溶液成功應(yīng)用于甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]非包埋莖尖的超低溫保存中并獲得64%的再生率，該方法被稱(chēng)為玻璃化法（vitrification）[26]。

CHAROENSUB 等[27]在木薯上建立了較為成熟的玻璃化法莖尖超低溫保存體系。該體系在冷凍保護(hù)前首先將莖尖預(yù)培養(yǎng)在含有0.3 mol/L 蔗糖的固體培養(yǎng)基上16 h，隨后使用含2 mol/L 甘油和0.4 mol/L 蔗糖的加載液處理莖尖20 min。冷凍保護(hù)應(yīng)用PVS2 溶液在常溫下進(jìn)行45 min 的處理，該方法在木薯莖尖超低溫保存后獲得75%的再生率。CHAROENSUB 等[28]還建立了包埋玻璃化法木薯莖尖超低溫保存體系。包埋后的莖尖較直接處理相比，往往需要更長(zhǎng)的預(yù)培養(yǎng)和冷凍保護(hù)時(shí)間，對(duì)于PVS2 耐受性差的莖尖，延緩PVS2的滲透速率有助于減輕冷凍保護(hù)時(shí)所受的滲透脅迫。

玻璃化法克服了許多物種不耐物理干燥的缺點(diǎn)，至今仍是種子、愈傷組織和胚性細(xì)胞懸浮系等材料超低溫保存的主要方法之一[10]。

1.5 小滴玻璃化法

由于玻璃化溶液在莖尖超低溫保存獲得巨大成功，加之應(yīng)用鋁箔條為載體實(shí)現(xiàn)快速“冷凍—解凍”能夠獲得更高的莖尖冷凍后再生率，PANIS等[29]以鋁箔條為載體與PVS2 冷凍保護(hù)相結(jié)合，在香蕉（Musa spp.）上優(yōu)化建立了廣譜性更高的香蕉超低溫保存體系，并將其命名為小滴玻璃化法（droplet vitrification）。該方法應(yīng)用1.0 mm 的香蕉試管苗莖尖為材料，經(jīng)過(guò)30 min 含有2 mol/L甘油和0.4 mol/L 蔗糖的加載液預(yù)處理后，在冰上應(yīng)用PVS2 進(jìn)行30 min 冷凍保護(hù)，隨后將莖尖轉(zhuǎn)至鋁箔條上預(yù)先準(zhǔn)備好的PVS2 小液滴中并快速投入液氮進(jìn)行冷凍[29]。冷凍保存結(jié)束后將莖尖同鋁箔條一起快速裝入充分預(yù)冷的冷凍管后在液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存[29]。解凍時(shí)在液氮表面擰開(kāi)冷凍管后將帶有莖尖的鋁箔條快速轉(zhuǎn)入預(yù)先備好的1.2 mol/L 蔗糖卸載液中快速解凍，并短暫浸泡20 min 以稀釋莖尖中的PVS2 冷凍保護(hù)劑，之后將莖尖轉(zhuǎn)至恢復(fù)培養(yǎng)基上再生培養(yǎng)[29]。小滴玻璃化法可基于已有的玻璃化和包埋玻璃化體系進(jìn)行快速優(yōu)化，操作簡(jiǎn)便，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于馬鈴薯、大蒜（Allium sativum）、蘋(píng)果等試管苗莖尖的超低溫保存[30]，在熱帶作物木薯、甘蔗（Saccharumspp.）、菠蘿（Ananas comosus）等作物也有研究和應(yīng)用[31-32]。

1.6 鋁盤(pán)玻璃化法/干燥法

為提高莖尖冷凍保護(hù)過(guò)程的簡(jiǎn)便性，降低冷凍保護(hù)操作中對(duì)莖尖造成的機(jī)械損傷，HIRAI[33]將莖尖應(yīng)用海藻酸鈣包埋的技術(shù)粘附在鋁箔條上，隨后進(jìn)行冷凍保護(hù)的各項(xiàng)操作，該方法被命名為gelled droplet-vitrification。該研究團(tuán)隊(duì)隨后定制有凹槽的鋁片，以方便莖尖更好地粘附在鋁盤(pán)上。莖尖粘附后可參照小滴玻璃化和包埋玻璃化法的體系進(jìn)行冷凍保護(hù)，并由此建立鋁盤(pán)玻璃化法（vitrification Cryo-plate，V Cryo-plate）[34]；也可冷凍保護(hù)時(shí)采用空氣流干燥的方式，由此建立了鋁盤(pán)干燥法（dehydration Cryo-plate，D Cryoplate）[35]。2 種方法都能實(shí)現(xiàn)快速冷凍和解凍操作，并在馬鈴薯上獲得80%～100%的超低溫保存再生率[36]。熱帶作物莖尖超低溫保存主要應(yīng)用VCryo-plate 的方式進(jìn)行。VIANNA 等[37]應(yīng)用鋁盤(pán)玻璃化法建立了細(xì)柱西番蓮（Passiflora suberosa）的莖尖超低溫保存體系：該方法從萌發(fā)40 d 腋芽上切取莖尖，經(jīng)過(guò)0.3 mol/L 蔗糖預(yù)培養(yǎng)對(duì)莖尖進(jìn)行粘附。莖尖先轉(zhuǎn)入添加有3%海藻酸鈉溶液的凹槽中，隨后在凹槽中滴入0.1 mol/L 的氯化鈣溶液與海藻酸鈉發(fā)生反應(yīng)，由此完成粘附并進(jìn)行后續(xù)的冷凍保護(hù)操作[37]。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，該研究在PVS3溶液常溫下冷凍保護(hù)45～90 min 后獲得最高再生率（50%～60%）[37]。

鋁盤(pán)玻璃化法可基于小滴玻璃化法進(jìn)行建立，且能獲得更加一致的再生率[38]。包埋干燥和應(yīng)用玻璃化溶液進(jìn)行冷凍保護(hù)和莖尖超低溫保存的主要流程見(jiàn)圖1。

2 重要熱帶作物莖尖超低溫保存研究進(jìn)展

植物莖尖是植物生長(zhǎng)與發(fā)育的重要器官，具有較高的遺傳穩(wěn)定性，保存有特定的植物性狀，是植物開(kāi)展超低溫保存的重要材料來(lái)源，尤其適用于以無(wú)性繁殖為主作物的超低溫保存。莖尖超低溫保存依賴(lài)成熟的莖尖離體培養(yǎng)和再生體系，目前已在香蕉、木薯、菠蘿、甘蔗等重要熱帶作物上獲得成功應(yīng)用。

2.1 香蕉

香蕉是目前開(kāi)展超低溫保存最為成功的熱帶作物。早期香蕉莖尖的冷凍保護(hù)主要在高濃度蔗糖預(yù)培養(yǎng)后通過(guò)空氣流干燥進(jìn)行[39]。隨后有研究者將此方法與PVS2 冷凍保護(hù)做對(duì)比，結(jié)果表明結(jié)合PVS2 冷凍保護(hù)與快速冷凍/解凍的操作步驟獲得最高的再生率[40]。該方法隨后經(jīng)過(guò)優(yōu)化并命名為小滴玻璃化法[29]，并在香蕉種質(zhì)資源的實(shí)際保存中獲得極大成功[41]。國(guó)際香蕉交換中心（International Musa Transit Center）應(yīng)用小滴玻璃化法開(kāi)展香蕉莖尖超低溫保存工作近20 年，截至2020 年已成功保存1100 份香蕉資源[8]。

2.2 木薯

木薯是開(kāi)展莖尖超低溫保存研究最早的作物之一，早期先后試驗(yàn)了DMSO 兩步冷凍法[18]和包埋干燥法[22]，在部分木薯基因型上獲得冷凍后再生。隨著玻璃化溶液在香蕉莖尖超低溫保存上的成功應(yīng)用，DUMET 等[42]參照香蕉小滴玻璃化體系，應(yīng)用PVS2 冰上處理30 min 對(duì)木薯試管苗莖尖進(jìn)行“快速冷凍—超低溫保存—快速解凍”試驗(yàn)，獲得38%～48%再生率，高于包埋干燥法7%～14%的再生率。國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心CIAT隨后應(yīng)用小滴玻璃化法對(duì)100 份經(jīng)包埋干燥法冷凍再生率低于30%的基因型進(jìn)行超低溫保存，超過(guò)70 個(gè)木薯基因型材料獲得高于30%的再生率[43]。上述研究表明小滴玻璃化法在木薯莖尖超低溫保存上有極大的應(yīng)用潛力。然而上述方法借鑒香蕉莖尖超低溫保存技術(shù)，并未針對(duì)木薯進(jìn)行優(yōu)化，在木薯上還有極大的提升潛力。

2.3 菠蘿

莖尖超低溫保存對(duì)菠蘿的特異種質(zhì)保存具有重要的意義。GONZáLEZ-ARNAO 等[44]于20 世紀(jì)90 年代末對(duì)比了包埋干燥法與PVS2 玻璃化法對(duì)菠蘿莖尖的保存效果，結(jié)果表明只有玻璃化法能夠獲得穩(wěn)定的莖尖再生。隨后冷凍保護(hù)液PVS3也成功應(yīng)用于菠蘿莖尖的超低溫保存[45]，且應(yīng)用PVS3 建立的包埋玻璃化法在菠蘿上獲得更高的超低溫保存再生率[46]。應(yīng)用最新的小滴玻璃化超低溫保存方法，SOUZA 等[31]應(yīng)用0.5～1 mm 的菠蘿莖尖為外植體，在共計(jì)16 個(gè)菠蘿栽培和野生種中得到90%的平均再生率，表明小滴玻璃化法在菠蘿莖尖超低溫保存中具有廣譜性，可以應(yīng)用于菠蘿種質(zhì)資源的實(shí)際保存[31]。

2.4 甘蔗

20 世紀(jì)90 年代初，在法國(guó)、意大利和古巴等國(guó)家科研人員的合作下，應(yīng)用包埋干燥法的甘蔗莖尖在超低溫保存中獲得成功再生[47-48]。該體系應(yīng)用3%的海藻酸鈉包埋莖尖，在5 個(gè)基因型上獲得38%～91%的再生率[47-48]。參照香蕉小滴玻璃化法的流程，BARRACO 等[49]在2 份甘蔗資源上對(duì)PVS2 和PVS3 的冷凍保護(hù)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化后獲得20%～37%的再生率，低于包埋干燥法的53%～60%。為了提高小滴玻璃化法甘蔗莖尖超低溫保存后的再生率，VOLK 等[50]在冷凍保護(hù)中添加谷胱甘肽、抗壞血酸等物質(zhì)，但沒(méi)有進(jìn)一步提升再生率。KAYA 等[51]在甘蔗莖尖超低溫保存上對(duì)比了包埋玻璃化法與小滴玻璃化法，結(jié)果表明小滴玻璃化法能夠獲得更高的再生率。VOLK 等[50]還應(yīng)用包埋干燥法[49]和鋁盤(pán)玻璃化法對(duì)甘蔗莖尖進(jìn)行超低溫保存試驗(yàn)，獲得0～50%的再生率。上述研究表明現(xiàn)有的甘蔗莖尖超低溫保存體系存在明顯的基因型差異性，除繼續(xù)對(duì)冷凍保護(hù)步驟進(jìn)行優(yōu)化外，還需加強(qiáng)在蔗糖預(yù)培養(yǎng)、加載等步驟的優(yōu)化工作。

2.5 其他熱帶作物

甘薯主要依賴(lài)無(wú)性繁殖，也是開(kāi)展莖尖超低溫保存研究最早的作物之一。最新的甘薯莖尖超低溫保存主要應(yīng)用小滴玻璃化法[52]：國(guó)際馬鈴薯中心的研究團(tuán)隊(duì)在2014 年首次報(bào)道了甘薯小滴玻璃化法超低溫保存體系的構(gòu)建與優(yōu)化，該體系應(yīng)用30～45 min PVS2 冰上冷凍保護(hù)，在24 份甘薯資源中獲得1.7%～66%的再生率[53]。WILMS 等[54]應(yīng)用甘薯誘導(dǎo)的腋芽進(jìn)行體系優(yōu)化，莖尖在短暫加載液（2 mol/L 甘油+0.4 mol/L蔗糖）處理后，進(jìn)行PVS2 冷凍保護(hù)，在10 個(gè)甘薯基因型上獲得10%～84%的再生率，其中7 份資源的冷凍后再生率達(dá)到40%以上[54]。小滴玻璃化法由于其操作更為簡(jiǎn)便，是熱帶作物莖尖超低溫保存應(yīng)用最多的技術(shù)手段，已在山藥、芋頭等根莖類(lèi)作物[52]，牛大力（Millettia speciosa Champ.）[55]、巴戟天（Morinda officinalis How.）[56]等熱帶藥用和瀕危物種， 蘭花（ Orchidaceae ） [57] 、巢蕨（Neottopteris nidus）[58]和紅掌（Anthurium andraeanumLind.）[59-60]等熱帶花卉資源，油梨等熱帶木本作物[61]上獲得成功。小滴玻璃化法和鋁盤(pán)玻璃化法在重要熱帶作物莖尖超低溫保存中的主要步驟詳見(jiàn)表1。

3 熱帶作物種子超低溫保存研究進(jìn)展

3.1 種子

種子是植物種質(zhì)資源保存主要的材料來(lái)源之一[64]，根據(jù)種子的貯藏行為可分為3 類(lèi)：（1）正常型種子，可干燥至含水量低于7%，并能在?10 ℃下長(zhǎng)期保存[65]；（2）頑拗型種子，不耐干燥且對(duì)低溫非常敏感，無(wú)法直接干燥后冷凍保存[66]；（3）中間型種子，可以干燥至含水量為6%～12%，但與正常型種子相比，其活力喪失相對(duì)較快[67]。據(jù)估計(jì)，全世界8%的開(kāi)花植物的種子為頑拗型種子，但在熱帶地區(qū)，這一比例高達(dá)50%[65， 68]。液氮超低溫保存可以延長(zhǎng)傳統(tǒng)型種子的凍存期限，也是目前頑拗性種子長(zhǎng)期保存唯一可行的技術(shù)手段[69]。種子冷凍保存后的存活率與含水量密切相關(guān)，因而需在冷凍保存前確定種子的最佳含水量[70]。

咖啡是種子超低溫保存研究較多的熱帶作物，BECWAR 等[71]研究表明咖啡（Coffea arabica）種子能夠耐受8%的水分含量，但直接液氮凍存后無(wú)法萌發(fā)[71]。該研究還表明緩慢冷卻能夠提高咖啡種子超低溫保存后的萌發(fā)率。DUSSERT 等[70]隨后在9 份咖啡資源上開(kāi)展種子保存試驗(yàn)，同樣發(fā)現(xiàn)咖啡C. arabica 緩慢冷卻比快速冷卻獲得更高的再生率，而C. racemosa 等3 個(gè)咖啡種應(yīng)用2種冷凍方式均能獲得較高再生率（67%～81%）。該研究還發(fā)現(xiàn)咖啡種子中的結(jié)合水含量與脂質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，脂質(zhì)含量較高的種子更容易在冷凍中受到傷害。針對(duì)咖啡C. arabica 保存需緩慢冷卻帶來(lái)的操作不便，COELHO 等[72]優(yōu)化了該種咖啡種子快速冷凍保存體系，使該種子緩慢干燥至20%含水量后可直接投入液氮保存。

為對(duì)空氣鳳梨資源（Tillandsia spp.）開(kāi)展長(zhǎng)期保存，OLIVEIRA 等[73]將20 種空氣鳳梨種子放入冷凍管中，并于活性硅膠上干燥至7%的種子含水量后快速浸入液氮進(jìn)行450 d 的冷凍保存，13種空氣鳳梨的種子獲得80%的再生率。多數(shù)蘭科植物的種子能夠忍受一定程度的脫水干燥[74]，PRITCHARD[75]將蘭花7 個(gè)屬的成熟種子干燥至5%～11%后直接投入液氮冷凍處理，解凍后種子萌發(fā)率沒(méi)有下降，其中Anacamptis morio（藍(lán)紫倒距蘭）的種子超低溫保存后獲得更高的萌發(fā)率[74-78]。此外包埋干燥與玻璃化等莖尖超低溫保存技術(shù)也應(yīng)用于蘭科種子的超低溫保存，為無(wú)法直接干燥的蘭科種子提供了新的冷凍保護(hù)方法[79-80]。HU等[81]將臺(tái)灣本地蘭（Bletilla formosana）的種子應(yīng)用玻璃化法于PVS2 中脫水處理30 min，經(jīng)超低溫保存后獲得91%的萌發(fā)率，且保存1 a 的種子萌發(fā)率維持不變。

3.2 種胚

種胚承載種子的遺傳信息，體積小，與其他材料相比耐脫水和耐低溫能力強(qiáng)，是影響種子成功保存的關(guān)鍵[82-84]。一些熱帶作物的種子體積過(guò)大或者種皮過(guò)厚，無(wú)法對(duì)種子內(nèi)的種胚進(jìn)行有效干燥，因而需在凍存前將種胚取出，對(duì)其干燥后冷凍保存。

椰子種子體積過(guò)大，為了長(zhǎng)期保存其種質(zhì)資源，SISUNANDAR 等[85]將其種胚取出，直接干燥后進(jìn)行液氮凍存。該研究表明種胚8 h 快速干燥后經(jīng)快速冷凍—解凍處理獲得最高的萌發(fā)率，此外新鮮種胚的冷凍后萌發(fā)率（40%）也高于與經(jīng)過(guò)12 d 運(yùn)輸?shù)碾x體種胚（20%）?；诖烁稍锓椒ǎ琒ISUNANDAR 等[86]對(duì)不同成熟度的椰子種胚進(jìn)行超低溫保存試驗(yàn)，結(jié)果表明11 月齡的種胚冷凍后再生率最高（60%），但椰子采摘后需在3周內(nèi)分離種胚。在咖啡和菠蘿蜜的冷凍保存中，與未成熟或完全成熟的種胚相比，成熟中期收獲的種胚更適合超低溫保存[87-88]。棕櫚科植物的種胚對(duì)直接干燥耐受性較強(qiáng)，相似的種胚超低溫保存技術(shù)也實(shí)現(xiàn)了油棕（Elaeis guineensis）和布迪椰屬（Butia capitata）種胚的長(zhǎng)期保存[89-90]。

芭蕉屬植物種皮較為堅(jiān)硬，為更有效地干燥脫水，ESQUIVEL 等[91]將2 種不同基因型的野蕉種胚在超凈工作臺(tái)中干燥后浸入液氮進(jìn)行保存，解凍后得到最低80%的萌發(fā)率。SINGH 等[92]研究了野蕉（Musa balbisiana）種子的冷凍保存特性，結(jié)果表明種胚可以在超低溫保存前干燥脫水至5%～10%的相對(duì)含水量，該研究還發(fā)現(xiàn)種胚離體培養(yǎng)是野蕉種子冷凍后萌發(fā)的必須手段。

對(duì)于種胚無(wú)法直接干燥的頑拗型種子，參照莖尖冷凍保護(hù)方式對(duì)種胚進(jìn)行脫水干燥能夠提高種胚超低溫保存后的成活與萌發(fā)率。在咖啡種胚超低溫保存研究中，VALDéS 等[93]應(yīng)用PVS3 玻璃化冷凍保護(hù)液對(duì)咖啡（Coffea arabica）種胚脫水干燥后進(jìn)行冷凍，獲得了100%的種胚萌發(fā)率。為對(duì)鱗花木屬（Lepisanthes fruticosa）植物種子實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存，BUSTAM 等[94]應(yīng)用PVS2 冷凍保護(hù)液優(yōu)化建立了玻璃化法種胚超低溫保存體系，獲得67%的萌發(fā)率。超低溫保存技術(shù)在重要熱帶作物種子（胚）保存中的研究成果見(jiàn)表2。

4 熱帶作物花粉、懸浮細(xì)胞與愈傷組織超低溫保存研究進(jìn)展

4.1 花粉

花粉是單細(xì)胞雄配子體，包含了物種單倍體基因組的所有信息，使其成為種質(zhì)資源保存和交換的重要材料[101]?；ǚ郾４娌粌H有效地克服了親本在不同時(shí)間和不同地理位置雜交的障礙，也是保護(hù)植物遺傳多樣性的有效手段。在各種花粉冷凍保存方法中，含水量高低是影響保存成功的關(guān)鍵要素，且超低溫保存能夠極長(zhǎng)地延長(zhǎng)花粉保存時(shí)間[102]。

在熱帶作物花粉保存中，KARUN 等[103]將椰子2 個(gè)品種的花粉干燥至含水量7.5%后，用鋁箔進(jìn)行包裹直接浸入液氮中，解凍后獲得26%～32%花粉萌發(fā)率；長(zhǎng)期保存試驗(yàn)表明花粉活力連續(xù)3 a保持25%以上，由此驗(yàn)證了椰子花粉超低溫長(zhǎng)期保存的可行性。在重要熱帶油料作物油棕上，TANDON等[104]將新鮮開(kāi)放的雄花序花粉干燥1 h至含水量23.3%后投入液氮進(jìn)行超低溫保存，保存8 a 后解凍獲得54%的花粉萌發(fā)率，與對(duì)照相比沒(méi)有顯著變化?；ǚ鄢蜏乇４娴某晒κ艿交ㄆ诤突ǚ鄣某墒於鹊挠绊憽NILKUMAR 等[105]發(fā)現(xiàn)在火龍果花朵完全開(kāi)放時(shí)采集的新鮮花粉超低溫保存后萌發(fā)率最高，達(dá)到71.26%，而在開(kāi)花前2 h 和開(kāi)花后10 h 采集的花粉冷凍后無(wú)法萌發(fā)。CHAUDHURY 等[106]于晴天上午8：00—10：00間的花藥開(kāi)裂時(shí)收集芒果與荔枝花粉并用環(huán)己烷對(duì)花粉在運(yùn)輸過(guò)程中進(jìn)行短暫保存，超低溫保存前將保存液濾除后進(jìn)行干燥，隨后投入液氮超低溫保存。該方法現(xiàn)已應(yīng)用于180 份芒果資源花粉與19 份荔枝資源花粉的長(zhǎng)期保存，且超低溫保存4 a 后的花粉未發(fā)現(xiàn)活力下降[106]。VEENA 等[107]發(fā)現(xiàn)芒果花粉存活力短、對(duì)干燥敏感性高的特點(diǎn)，可考慮到基因型、季節(jié)和區(qū)域的差異，適當(dāng)延長(zhǎng)干燥時(shí)間。超低溫保存技術(shù)在重要熱帶作物花粉保存中的研究成果詳見(jiàn)表3。

4.2 懸浮細(xì)胞

植物懸浮細(xì)胞是一種能夠持續(xù)增殖、保持均一分散的細(xì)胞團(tuán)，由多個(gè)未分化的單細(xì)胞組成，是遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體[113-114]。細(xì)胞懸浮系的建立花費(fèi)大量時(shí)間，且需不斷地繼代以保持細(xì)胞活力，對(duì)胚性懸浮細(xì)胞開(kāi)展超低溫保存，能夠降低其在長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)過(guò)程中導(dǎo)致胚性特征喪失以及發(fā)生遺傳變異的風(fēng)險(xiǎn)[115-116]。懸浮細(xì)胞冷凍保存前主要應(yīng)用冷凍保護(hù)液對(duì)細(xì)胞脫水干燥[117-118]。早期的冷凍保護(hù)液種類(lèi)較多，在甘蔗細(xì)胞懸浮系的低溫保存中FINKLE 等[117]發(fā)現(xiàn)含有8%葡萄糖、10%DMSO 與10% PEG（均為w/V）的冷凍保護(hù)液能使懸浮細(xì)胞忍受冷凍保存。GNANAPRAGASAM等[118]在甘蔗懸浮細(xì)胞超低溫保存研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)0.33 mol/L 山梨醇預(yù)培養(yǎng)3 d 后，應(yīng)用添加0.5 mol/L 甘油、0.5 mol/L 山梨醇和1.0 mol/L 蔗糖的冷凍保護(hù)劑能夠獲得最高的冷凍后成活率。在香蕉懸浮系的超低溫保存研究中，PANIS 等[119]采用甘油和DMSO 混合液進(jìn)行低溫保護(hù)，結(jié)果顯示DMSO 占5%時(shí)效果最好。在此基礎(chǔ)上GEORGET等[120]對(duì)香蕉懸浮系超低溫保存的預(yù)培養(yǎng)步驟進(jìn)行優(yōu)化，最終在冷凍保護(hù)前采用三步蔗糖預(yù)培養(yǎng)。上述香蕉懸浮系的超低溫保存均采用兩步冷凍法進(jìn)行冷凍[119-120]。

目前在植物上冷凍保護(hù)應(yīng)用最廣的PVS2 玻璃化溶液同樣適用于熱帶作物懸浮系超低溫保存。李艷娜等[121]應(yīng)用兩步梯度PVS2 冷凍保護(hù)對(duì)巴西蕉、北大矮蕉和粵優(yōu)抗1 號(hào)的香蕉懸浮細(xì)胞進(jìn)行超低溫保存，獲得較高的再生率。謝玉明等[122]在荔枝上建立了玻璃化法胚性懸浮細(xì)胞超低溫保存體系，該體系采用山梨醇預(yù)培養(yǎng)結(jié)合兩步PVS2冷凍保護(hù)，獲得27.1%的超低溫保存成活率。為了對(duì)油棕細(xì)胞懸浮系進(jìn)行超低溫保存，WEI 等[89]應(yīng)用蔗糖預(yù)培養(yǎng)結(jié)合PVS2 冷凍保護(hù)的方式進(jìn)行超低溫保存，獲得68.33%成活率。李運(yùn)合等[123]應(yīng)用30 min PVS3 玻璃化溶液冷凍保護(hù)對(duì)芒果胚性培養(yǎng)物細(xì)胞和愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行超低溫保存，存活率分別為94.7%和0，表明胚性培養(yǎng)物細(xì)胞較普通愈傷組織相比具有更強(qiáng)的耐脫水和冷凍能力。

4.3 愈傷組織

愈傷組織由薄壁細(xì)胞組成，一般被分為非胚性愈傷和胚性愈傷[124]。胚性愈傷組織可能會(huì)因長(zhǎng)期繼代而造成體細(xì)胞變異，或致使體胚潛力下降甚至徹底喪失[125]。超低溫保存可以有效遏制愈傷組織變異的發(fā)生，降低長(zhǎng)期保存帶來(lái)再生能力喪失的風(fēng)險(xiǎn)。早在1979 年，ULRICH 等[126]已對(duì)甘蔗愈傷組織超低溫保存開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)復(fù)合冷凍保護(hù)劑（8%葡萄糖+10% DMSO+10% PEG）能夠獲得較好的冷凍保護(hù)作用。簡(jiǎn)令成等[127]將上述冷凍保護(hù)劑與0.5 mol/L 山梨糖醇+10% DMSO 溶液在甘蔗愈傷組織超低溫保存中進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)后者冷凍保護(hù)效果更好，這可能與試驗(yàn)材料基因型的不同有關(guān)。MARTíNEZ-MONTERO 等[128]還應(yīng)用0.3～0.75 mol/L 蔗糖+10% DMSO為冷凍保護(hù)劑成功保存了3 個(gè)甘蔗雜交種的胚性愈傷組織。MARTíNEZ-MONTERO 等[129]隨后對(duì)甘蔗胚性愈傷組織誘導(dǎo)的體胚團(tuán)進(jìn)行超低溫保存試驗(yàn)，并應(yīng)用小滴玻璃化法獲得了55%的成活率。除甘蔗之外，應(yīng)用PVS2 玻璃化溶液還建立了橡膠[130]、龍眼[131-132]、荔枝[133]等熱帶作物愈傷組織的超低溫保存體系（表4）。

5 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)與農(nóng)藝性狀對(duì)比

莖尖與體胚等無(wú)性繁殖材料攜帶原始母株的遺傳信息，超低溫保存可降低上述材料長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)帶來(lái)的遺傳變異風(fēng)險(xiǎn)，但保存操作中的脫水干燥和冷凍解凍分別給細(xì)胞帶來(lái)滲透脅迫和冷凍傷害，給DNA 帶來(lái)?yè)p傷，對(duì)再生植株的遺傳穩(wěn)定性造成不利影響[134]。因而對(duì)超低溫保存后的再生植株開(kāi)展遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)十分必要。

由于莖尖的遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，目前絕大多數(shù)經(jīng)過(guò)優(yōu)化的莖尖超低溫保存體系能夠維持凍存資源的遺傳穩(wěn)定性[30， 135]。AGRAWAL 等[136]對(duì)超低溫保存后的香蕉Sommarani Monthan（AAB 基因型）開(kāi)展農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)和遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，研究表明除1 棵再生植株果皮顏色更綠外，其余植株與對(duì)照相比表現(xiàn)相同的生長(zhǎng)和產(chǎn)量特性；同時(shí)應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)。AGRAWAL 等[137]隨后還對(duì)香蕉田間吸芽、試管苗單芽和叢芽超低溫保存后的再生植株應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)超低溫保存過(guò)程帶來(lái)的變異率增加。在菠蘿和三角葉薯蕷（Dioscorea deltoidea）上應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)同樣表明玻璃化法超低溫保存體系能夠保持資源的遺傳穩(wěn)定性[63， 138]。然而在甘蔗中的研究表明莖尖超低溫保存獲得的再生植株遺傳穩(wěn)定性存在基因型差異，其中基因型NG 57-024 超低溫冷凍后表現(xiàn)98.5%的基因一致性，且變異差異發(fā)生在PVS2 冷凍保護(hù)之后，而其余兩份甘蔗基因型Halaii 與H83-6179 中未檢測(cè)到DNA 多態(tài)性[51]。

胚性愈傷組織的誘導(dǎo)經(jīng)歷脫分化過(guò)程，該過(guò)程可能給組織帶來(lái)更高的遺傳變異風(fēng)險(xiǎn)[139]，因而更需關(guān)注其超低溫保存后的遺傳穩(wěn)定性。GANTAIT等[140]對(duì)油棕胚性懸浮系誘導(dǎo)獲得的多胚體超低溫保存后，應(yīng)用RAPD 和ISSR 分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性條帶。WELEWANNI等[141]對(duì)椰子花序誘導(dǎo)所得的胚性愈傷組織在超低溫保存前后進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性評(píng)估，該研究對(duì)11個(gè)SSR 分子標(biāo)記的位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，同樣未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)。SISUNANDAR 等[142]還對(duì)4 個(gè)椰子品種的合子胚進(jìn)行超低溫保存，并對(duì)保存后得到的再生植株與保存前后的材料進(jìn)行對(duì)比，未發(fā)現(xiàn)在形態(tài)學(xué)和染色體數(shù)上的變異；應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記和基因組甲基化水平檢測(cè)同樣未發(fā)現(xiàn)保存前后的明顯差異。

然而超低溫保存過(guò)程中脅迫處理會(huì)給組織帶來(lái)表觀遺傳水平的變化，且變化具有一定的可逆性[135]，可能會(huì)對(duì)再生植株性狀產(chǎn)生影響[143]，但在熱帶作物的研究上十分缺乏。ADU-GYAMFI 等[144]在可可（Theobroma cacao L.）上的研究發(fā)現(xiàn)其體胚經(jīng)超低溫保存后得到的再生植株形態(tài)發(fā)生變化，且該變化與表觀遺傳水平的變化有關(guān)，但其變化部分可逆。綜上所述，雖然超低溫保存不會(huì)明顯提高保存材料的遺傳變異水平，但其帶來(lái)的表觀遺傳變化值得深入研究。

6 展望

隨著國(guó)家對(duì)植物種質(zhì)資源安全保存的重視和種業(yè)振興工作的開(kāi)展，植物野生資源、作物育種中間材料和優(yōu)良商業(yè)品種的安全保存變得尤為重要。許多發(fā)達(dá)國(guó)家的農(nóng)業(yè)科研單位和重要國(guó)際農(nóng)業(yè)組織已經(jīng)開(kāi)展植物資源的超低溫保存工作，以減少種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的人力物力投入。熱帶作物與溫帶作物相比耐冷性和干燥耐受性較差，超低溫保存體系建立的難度更大。

莖尖由于遺傳穩(wěn)定性高，取材較為方便，是香蕉、甘蔗、木薯等以無(wú)性繁殖為主的熱帶作物開(kāi)展超低溫保存的重要材料來(lái)源。目前最有效的莖尖超低溫保存技術(shù)應(yīng)用PVS2 等冷凍保護(hù)液進(jìn)行脫水干燥，并結(jié)合小滴玻璃化、鋁盤(pán)玻璃化法等快速冷凍—解凍手段冷凍保存。莖尖超低溫保存體系依賴(lài)成熟的莖尖和莖段組織培養(yǎng)再生技術(shù)（圖2），雖然在香蕉和菠蘿等作物上獲得成功，但在甘蔗、木薯等重要熱帶作物上還需優(yōu)化。此外咖啡、可可和芒果等熱帶木本作物超低溫保存工作的開(kāi)展還需克服組織離體再生困難帶來(lái)的挑戰(zhàn)。

超低溫保存是熱帶植物頑拗型種子實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存的唯一手段，為更有效地對(duì)種子進(jìn)行冷凍保護(hù)，往往需將種胚取出進(jìn)行干燥后和超低溫保存。許多熱帶作物的種胚能夠耐受直接空氣干燥后超低溫保存。當(dāng)種胚無(wú)法直接干燥時(shí)，可參照莖尖應(yīng)用玻璃化溶液進(jìn)行冷凍保護(hù)。目前種胚超低溫保存技術(shù)已在咖啡、野蕉和棕櫚科等植物上建立，在橡膠、可可等重要熱帶木本作物長(zhǎng)期安全保存和育種上還有更廣闊的研究應(yīng)用前景。種胚超低溫保存同樣依賴(lài)種胚離體培養(yǎng)技術(shù)，以促進(jìn)種胚解凍后的萌發(fā)生長(zhǎng)。

超低溫保存還可應(yīng)用于熱帶作物花粉、胚性懸浮系、愈傷組織等高價(jià)值組織細(xì)胞的長(zhǎng)期保存。熱帶作物花粉可直接干燥后超低溫保存，操作較為簡(jiǎn)單；而胚性愈傷組織、懸浮系和普通愈傷的超低溫保存依賴(lài)?yán)鋬霰Ｗo(hù)溶液進(jìn)行脫水干燥（圖2）。胚性愈傷組織和懸浮系的超低溫保存技術(shù)已在香蕉、甘蔗、荔枝等熱帶作物上成功建立，可降低上述材料長(zhǎng)期繼代導(dǎo)致的變異和活力下降問(wèn)題，在其他重要熱帶作物上也有極高的研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，超低溫保存技術(shù)雖然需要根據(jù)不同材料類(lèi)型選用不同的方案進(jìn)行優(yōu)化，但體系建立后是最有效的種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存手段。熱帶地區(qū)作為全球生物多樣性水平最高的區(qū)域，有更多植物種質(zhì)安全保存的實(shí)際需求。超低溫保存體系在熱帶作物上的研究和應(yīng)用能更好地支持熱帶作物品種、野生瀕危資源和高價(jià)值組織細(xì)胞長(zhǎng)期安全保存，支撐熱帶農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和科技的可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1] SALGOTRA R K， CHAUHAN B S. Genetic diversity， conservation，and utilization of plant genetic resources[J]. Genes，2023， 14（1）： 174.

[2] VOLK G M， CARVER D， IRISH B M， MAREK L， FRANCESA， GREENE S， KHOURY C K， BAMBERG J， DELRIO A， WARBURTON M L， BRETTING P K. Safeguardingplant genetic resources in the United States during global climatechange[J]. Crop Science， 2023， 63（4）： 2274-2296.

[3] 辛霞， 尹廣鹍， 張金梅， 陳曉玲， 何娟娟， 劉運(yùn)霞， 黃雪琦，盧新雄. 作物種質(zhì)資源整體保護(hù)策略與實(shí)踐[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2022， 23（3）： 636-643.

XIN X， YIN G K， ZHANG J M， CHEN X L， HE J J， LIU YX， HUANG X Q， LU X X. Strategies and practices of theintegrated conservation system for crop germplasm resources[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2022， 23（3）：636-643. （in Chinese）

[4] Food and Agriculture Organization of the United Nations.FAOSTAT 2022[EB/OL]. （2024-04-12）[2024-09-05]. https：//www.fao.org/faostat/en/#data/QC.

[5] TURNER W R， BRANDON K， BROOKS T M， GASCON C，GIBBS H K， LAWRENCE K S， MITTERMEIER R A，SELIG E R. Global biodiversity conservation and the alleviationof poverty[J]. BioScience， 2012， 62（1）： 85-92.

[6] TSCHARNTKE T， CLOUGH Y， WANGER T C， JACKSONL， MOTZKE I， PERFECTO I， VANDERMEER J， WHITBREADA. Global food security， biodiversity conservationand the future of agricultural intensification[J]. BiologicalConservation， 2012， 151（1）： 53-59.

[7] WALTERS C， PENCE V C. The unique role of seed bankingand cryobiotechnologies in plant conservation[J]. PlantsPeople Planet， 2020， 3（1）： 83-91.

[8] PANIS B， NAGEL M， VAN DEN HOUWE I. Challengesand prospects for the conservation of crop genetic resourcesin field genebanks， in in vitro collections and/or in liquid nitrogen[J]. Plants， 2020， 9（12）： 1634.

[9] NORMAH M N， SULONG N， REED B M. Cryopreservationof shoot tips of recalcitrant and tropical species： advancesand strategies[J]. Cryobiology， 2019， 87： 1-14.

[10] SAKAI A， ENGELMANN F. Vitrification， encapsulationvitrificationand droplet-vitrification： a review[J]. Cryo-Letters，2007， 28（3）： 151-172.

[11] PANIS B. Sixty years of plant cryopreservation： from freezinghardy mulberry twigs to establishing reference crop collectionsfor future generations[J]. Acta Horticulturae， 2019，1234： 1-7.

[12] SAKAI A. Survival of the twig of woody plants at ?196 ℃[J].Nature， 1960， 185： 393-394.

[13] SAKAI A， NISHIYAMA Y. Cryopreservation of wintervegetative buds of hardy fruit trees in liquid nitrogen[J].HortScience， 1978， 13（3）： 225-227.。

[14] JENDEREK M M， REED B M. Cryopreserved storage ofclonal germplasm in the USDA National Plant GermplasmSystem[J]. In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant，2017， 53： 299-308.

[15] GROUT B W W， HENSHAW G G. Freeze preservation ofpotato shoot-tip cultures[J]. Annals of Botany， 1978， 42（181）：1227-1229.

[16] TOWILL L E. Improved survival after cryogenic exposure ofshoot tips derived from in vitro plantlet cultures of potato[J].Cryobiology， 1983， 20（5）： 567-573.

[17] KARTHA K K， LEUNG N L， PAHL K. Cryopreservation ofstrawberry meristems and mass propagation of plantlets[J].Journal of the American Society for Horticultural Science，1980， 105（4）： 481-484.。

[18] KARTHA K K， LEUNG N L， MROGINSKI L A. In vitrogrowth responses and plant regeneration from cryopreservedmeristems of cassava （Manihot esculenta Crantz）[J]. Zeitschriftfür Pflanzenphysiologie， 1982， 107（2）： 133-140.

[19] REDENBAUGH K， PAASCH B D， NICHOL J W， KOSSLERM E， VISS P R， WALKER K A. Somatic seeds： encapsulationof asexual plant embryos[J]. Nature Biotechnology，1986， 4（9）： 797-801.

[20] FABRE J， DEREUDDRE J. Encapsulation dehydration anew approach to cryopreservation of Solanum shoot-tips[J].Cryo-Letters， 1990， 11： 413-426.

[21] ENGELMANN F， ARNAO M T G， WU Y， ESCOBAR R.Development of encapsulation dehydration[M]. New York：Springer， 2008： 59-75.

[22] ENGELMANN F， BENSON E E， CHABRILLANGE N，GONZALEZ ARNAO M T， MARI S， MICHAUX-FERRIEREN， PAULET F， GLASZMANN J C， CHARRIER A.Cryopreservation of several tropical plant species using encapsulation/dehydration of apices[M]. Dordrecht， The Netherlands：Springer， 1995： 315-320.

[23] MARI S， ENGELMANN F， CHABRILLANGE N， HUET C，MICHAUX-FERRIèRE N. Histo-cytological study of apicesof coffee （Coffea racemose and C. sessiliflora） in vitro plantletsduring their cryopreservation using the encapsulationdehydrationtechnique[J]. Cryo-Letters， 1995， 16： 289-298.

[24] SAKAI A， KOBAYASHI S， OIYAMA I. Cryopreservationof nucellar cells of navel orange （Citrus sinensis Osb. Var.brasiliensis Tanaka） by vitrification[J]. Plant Cell Reports，1990， 9： 30-33.

[25] TANNOURY M， RALAMBOSOA J， KAMINSKI M，DEREUDDRE J. Cryopreservation by vitrification of coatedshoot tips of carnation （Diathus caryophyllus L.） cultured invitro[J]. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences， 1991，313（13）： 633-638.

[26] TOWILL L E， JARRETT R L. Cryopreservation of sweetpotato [Ipomoea batatas （L.） Lam] shoot tips by vitrification[J]. Plant Cell Reports， 1992， 11： 175-178.

[27] CHAROENSUB R， PHANSIRI S， SAKAI A， YONGMANITCHAIW. Cryopreservation of cassava in vitro-grown shoottips cooled to ?196 ℃ by vitrification[J]. Cryo-Letters， 1999，20（2）： 89-94.

[28] CHAROENSUB R， HIRAI D， SAKAI A. Cryopreservationof in vitro-grown shoot tips of cassava by encapsulation-vitrificationmethod[J]. Cryo-Letters， 2004， 25（1）： 51-58.

[29] PANIS B， PIETTE B， SWENNEN R. Droplet vitrification ofapical meristems： a cryopreservation protocol applicable toall Musaceae[J]. Plant Science， 2005， 168（1）： 45-55.

[30] WANG M R， LAMBARDI M， ENGELMANN F， PATHIRANAR， PANIS B， VOLK G M， WANG Q C. Advances incryopreservation of in vitro-derived propagules： technologiesand explant sources[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2021， 144： 7-20.

[31] SOUZA F V D， KAYA E， DE JESUS VIEIRA L， DESOUZA E H， DE OLIVEIRA AMORIM B， SKOGERBOED， MATSUMOTO T， ALVES A A C， DA SILVA LEDO A，JENDEREK M M. Droplet-vitrification and morphohistologicalstudies of cryopreserved shoot tips of cultivated andwild pineapple genotypes[J]. Plant Cell Tissue and OrganCulture， 2016， 124： 351-360.

[32] KAVIANI B， KULUS D. Cryopreservation of endangeredornamental plants and fruit crops from tropical and subtropicalregions[J]. Biology， 2022， 11（6）： 847.

[33] HIRAI D. Gelled droplet vitrification improves recovery ofcryopreserved potato germplasm[J]. Cryo-Letters， 2011，32（4）： 287-296.

[34] YAMAMOTO S， RAFIQUE T， PRIYANTHA W S， FUKUIK， MATSUMOTO T， NIINO T. Development of a cryopreservationprocedure using aluminum cryo-plates[J]. Cryo-Letters， 2011， 32（3）： 256-265.

[35] NIINO T， WUNNA， WATANABE K， NOHARA N， RAFIQUET， YAMAMOTO S， FUKUI K， VALLE ARIZAGAM， MARTINEZ C R C， MATSUMOTO T， ENGELMANNF. Cryopreservation of mat rush lateral buds by air dehydrationusing aluminum cryo-plate[J]. Plant Biotechnology， 2014，31（3）： 281-287.

[36] YAMAMOTO S， WUNNA， RAFIQUE T， VALLE ARIZAGAM， FUKUI K， GUTIERREZ E J C， MARTINEZ C RC， WATANABE K， NIINO T. The aluminium cryo-plate increasesefficiency of cryopreservation protocols for potatoshoot tips[J]. American Journal of Potato Research， 2015， 92：250-257.

[37] VIANNA M G， GARCIA R O， MANSUR E， ENGELMANNF， PACHECO G. Oxidative stress during the cryopreservationof Passiflora suberosa L. shoot tips using the V-cryoplatetechnique： determination of the critical stages of theprotocol[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2019， 139：369-379.

[38] BENELLI C， CARVALHO L S O， EL MERZOUGUI S，PETRUCCELLI R. Two advanced cryogenic procedures forimproving Stevia rebaudiana （Bertoni） cryopreservation[J].Plants， 2021， 10（2）： 277.

[39] PANIS B， TOTTé N， VAN NIMMEN K， WITHERS L A，SWENNEN R. Cryopreservation of banana （Musa spp.）meristem cultures after preculture on sucrose[J]. Plant Science，1996， 121（1）： 95-106.

[40] AGRAWAL A， SWENNEN R， PANIS B. A comparison offour methods for cryopreservation of meristems in banana（Musa spp.）[J]. Cryo-Letters， 2004， 25（2）： 101-110.

[41] 李建國(guó)， 張守梅， 陳厚彬， 徐春香， 王澤槐. 應(yīng)用莖尖滴凍法超低溫保存香蕉資源研究[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2010， 27（5）：745-751.

LI J G， ZHANG S M， CHEN H B， XU C X， WANG Z H.Study on the cryopreservation of in vitro shoot tips of Musagermplasm by droplet vitrification[J]. Journal of Fruit Science，2010， 27（5）： 745-751. （in Chinese）

[42] DUMET D， DIEBIRU E， ADEYEMI A， AKINYEMI O，GUEYE B， FRANCO J. Cryopreservation for the ‘in perpetuity’conservation of yam and cassava genetic resources[J].Cryo-Letters， 2013， 34（2）： 107-118.

[43] ESCOBAR R H， MU?OZ L， RIOS A， Nú?EZ A， TOHME J. Using a droplet-vitrification method to partially overcomethe recalcitrance of cassava to cryostorage[J]. Acta Horticulturae，2014， 1039： 227-232.

[44] GONZáLEZ-ARNAO M T， RAVELO M M， VILLAVICENCIOC U， MARTINEZ-MONTERO M E， ENGELMANNF. Cryopreservation of pineapple （Ananas comosus） apices[J].Cryo-Letters， 1998， 19： 375-382.

[45] MARTíNEZ-MONTERO M E， MARTíNEZ J， ENGELMANNF， GONZALEZ-ARNAO M T. Cryopreservation ofpineapple [Ananas comosus （L.） Merr] apices and calluses[J].Acta Horticulturae， 2005， 666： 127-131.

[46] GáMEZ-PASTRANA R， MARTíNEZ-OCAMPO Y， BERISTAINC I， GONZáLEZ-ARNAO M T. An improved cryopreservationprotocol for pineapple apices using encapsulation-vitrification[J]. Cryo-Letters， 2004， 25（6）： 405-414.

[47] GONZáLEZ-ARNAO M T， ENGELMANN F， HUET C，URRA C. Cryopreservation of encapsulated apices of sugarcane：effect of freezing procedure and histology[J]. Cryo-Letters， 1993， 14： 303-308.

[48] PAULET F， ENGELMANN F， GLASZMANN J C. Cryopreservationof apices of in vitro plantlets of sugarcane （Saccharumsp. hybrids） using encapsulation/dehydration[J].Plant Cell Reports， 1993， 12： 525-529.

[49] BARRACO G， SYLVESTRE I， ENGELMANN F. Comparingencapsulation-dehydration and droplet-vitrification forcryopreservation of sugarcane （Saccharum spp.） shoot tips[J].Scientia Horticulturae， 2011， 130（1）： 320-324.

[50] VOLK G M， JENDEREK M M， STATTS E， SHEPHERD A，BONNART R， LEDO A， AYALA-SILVA T. Challenges inthe development of a widely applicable method for sugarcane（Saccharum spp.） shoot tip cryopreservation[J]. ActaHorticulturae， 2019， 1234： 335-342.

[51] KAYA E， SOUZA F V D. Comparison of two PVS2-basedprocedures for cryopreservation of commercial sugarcane（Saccharum spp.） germplasm and confirmation of geneticstability after cryopreservation using ISSR markers[J]. InVitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant， 2017， 53：410- 417.

[52] ZHANG A L， WANG M R， LI Z， PANIS B， BETTONI J C，VOLLMER R， XU L， WANG Q C. Overcoming challengesfor shoot tip cryopreservation of root and tuber crops[J].Agronomy， 2023， 13（1）： 219.

[53] VOLLMER R， PANTA A， TAY D， ROCA W， ELLIS D.Effect of sucrose preculture and PVS2 exposure on the cryopreservationof sweet potato shoot tips [Ipomoea batatas （L.）Lam.] using the PVS2 droplet vitrification[J]. Acta Horticulturae，2014， 1039： 265-272.

[54] WILMS H， SLEZIAK N F， VAN DER AUWERAER M，BRANDS M， VERLEIJE M， HARDEMAN D， ANDRE E，PANIS B. Development of a fast and user-friendly cryopreservationprotocol for sweet potato genetic resources[J]. ScientificReports， 2020， 10： 14674.

[55] LI Z， LI T， XU L， PANIS B. Cryopreservation of Calleryaspeciosa （Champ.） schot through droplet-vitrification[J].Propagation of Ornamental Plants， 2013， 13（4）： 189-195.

[56] 顏航， 李春燕， 李志英， 王敏瑞， 荊永琳， 王小冰， 李玉蓮，陳浪欣， 徐立. 巴戟天離體保存與莖尖小滴玻璃化法超低溫保存體系的構(gòu)建[J]. 分子植物育種， 2024， 22（19）： 6477-6484.

YAN H， LI C Y， LI Z Y， WANG M R， JING Y L， WANG XB， LI L Y， CHEN L X， XU L. Construction of in vitro preservationand shoot tips droplet-vitrification cryopreservationsystem of Morinda officinalis how[J]. Molecular PlantBreeding， 2024， 22（19）： 6477-6484. （in Chinese）

[57] DAS C M， DEVI S D， KUMARIA S， REED B M. Lookingfor a way forward for the cryopreservation of orchid diversity[J]. Cryobiology， 2021， 102： 1-14.

[58] LI T， XU L， LI Z， PANIS B. Cryopreservation of Neottopterisnidus prothallus and green globular bodies by droplet-vitrification[J]. Cryo-Letters， 2013， 34（5）： 481-489.

[59] KHOR S P， YEOW L C， POOBATHY R， ZAKARIA R，CHEW B L， SUBRAMANIAM S. Droplet-vitrification ofAranda Broga Blue orchid： role of ascorbic acid on the antioxidantsystem and genetic fidelity assessments via RAPD andScoT markers[J]. Biotechnology Reports， 2020， 26： e00448.

[60] 高潔， 李志英， 張玄兵， 謝龍海， 陳瑩， 朱振芬， 符運(yùn)柳，徐立. 紅掌小滴玻璃化法超低溫保存研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2023， 44（9）： 1909-1916.

GAO J， LI Z Y， ZHANG X B， XIE L H， CHEN Y， ZHU Z F，F(xiàn)U Y L， XU L. Cryopreservation of Anthurium andraeanumby droplet vitrification[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，2023， 44（9）： 1909-1916. （in Chinese）

[61] O’BRIEN C， HITI-BANDARALAGE J C A， FOLGADO R，LAHMEYER S， HAYWARD A， FOLSOM J， MITTER N.First report on cryopreservation of mature shoot tips of twoavocado （Persea americana Mill.） rootstocks[J]. Plant CellTissue and Organ Culture， 2021， 144： 103-113.

[62] RAFIQUE T， YAMAMOTO S， FUKUI K， MAHMOOD Z，TAKAO N. Cryopreservation of sugarcane using the V cryoplatetechnique[J]. Cryo-Letters， 2015， 36（1）： 51-59.

[63] SHARMA N， MALHOTRA EV， CHANDRA R， GOWTHAMIR， SULTAN S M， BANSAL S， SHANKAR M， AGRAWALA. Cryopreservation and genetic stability assessmentof regenerants of the critically endangered medicinalplant Dioscorea deltoidea Wall. ex Griseb. for cryobankingof germplasm[J]. In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant， 2022， 58： 521-529.

[64] LININGTON S H， PRITCHARD H W. Encyclopedia ofbiodiversity[M]. San Diego： Academic Press， 2001： 165-181.

[65] TWEDDLE J C， DICKIE J B， BASKIN C C， BASKIN J M.Ecological aspects of seed desiccation sensitivity[J]. Journalof Ecology， 2003， 91（2）： 294-304.

[66] SERSHEN， PERUMAL A， VARGHESE B， GOVENDER P，RAMDHANI S， BERJAK P. Effects of elevated temperatureson germination and subsequent seedling vigour in recalcitrantTrichilia emetica seeds[J]. South African Journal ofBotany， 2014， 90： 153-162.

[67] JOSHI G， PHARTYAL S S， KHAN M R， ARUNKUMAR AN. Recalcitrant morphological traits and intermediate storagebehaviour in seeds of Mesua ferrea， a tropical evergreen species[J]. Seed Science and Technology， 2015， 43（1）： 121-126.

[68] MARQUES A， NIJVEEN H， SOMI C， LIGTERINK W，HILHORST H. Induction of desiccation tolerance in desiccationsensitive Citrus limon seeds[J]. Journal of IntegrativePlant Biology， 2019， 61（5）： 624-638.

[69] NAGEL M， PENCE V， BALLESTEROS D， LAMBARDI M，POPOVA E， PANIS B. Plant cryopreservation： principles，applications， and challenges of banking plant diversity at ultralowtemperatures[J]. Annual Review of Plant Biology，2024， 75： 797-824.

[70] DUSSERT S， CHABRILLANGE N， ROCQUELIN G，ENGELMANN F， LOPEZ M， HAMON S. Tolerance of coffee（Coffea spp.） seeds to ultra-low temperature exposure inrelation to calorimetric properties of tissue water， lipidcomposition， and cooling procedure[J]. Physiologia Plantarum，2001， 112（4）： 495-504.

[71] BECWAR M R， STANWOOD P C， LEONHARDT K W.Dehydration effects on freezing characteristics and survivalin liquid nitrogen of desiccation-tolerant and desiccation-sensitive seeds[J]. Journal of the American Society forHorticultural Science， 1983， 108（4）： 613-618.

[72] COELHO S V B， ROSA S D V F， FERNANDES J S. Cryopreservationof coffee seeds： a simplified method[J]. SeedScience and Technology， 2017， 45（3）： 1-12.

[73] OLIVEIRA R S D， SOUZA F V D， SANTOS I L D，SOUZA S O， AONA L Y S， DE SOUZA E H. Cryopreservationand low-temperature storage of seeds of Tillandsiaspecies （Bromeliaceae） with ornamental potential[J]. 3 Biotech，2021， 11（4）： 186.

[74] PRITCHARD H W， POYNER A L C， SEATON P T. Interspecificvariation in orchid seed longevity in relation to ultra-dry storage and cryopreservation[J]. Lindleyana， 1999，14（2）： 92-101.

[75] PRITCHARD H W. Liquid nitrogen preservation of terrestrialand epiphytic orchid seed[J]. Cryo-Letters， 1984， 5： 295-300.

[76] WANG J H， GE J G， FENG L， BIAN H W， HUANG C N.Cryopreservation of seeds and protocorms of Dendrobiumcandidum[J]. Cryo-Letters， 1998， 19： 123-128.

[77] NIKISHINA T V， POPOV A S， KOLOMEITSEVA G L，GOLOVKIN B N. Effect of cryopreservation on seed germinationof rare tropical orchids[J]. Russian Journal of PlantPhysiology， 2001， 48： 810-815.

[78] POPOV A S， POPOVA E V， NIKISHINA T V， KOLOMEYTSEVAG L. The development of juvenile plants of thehybrid orchid Bratonia after seed cryopreservation[J]. Cryo-Letters， 2004， 25（3）： 205-212.

[79] HIRANO T， GODO T， MII M， ISHIKAWA K.Cryopreservation of immature seeds of Bletilla striata byvitrification[J]. Plant Cell Reports， 2005， 23： 534-539.[80] POPOVA E， KIM H H， SAXENA P K， ENGELMANN F，PRITCHARD H W. Frozen beauty： the cryobiotechnology oforchid diversity[J]. Biotechnology Advances， 2016， 34（4）：380-403.

[81] HU W H， YANG Y H， LIAW S I， CHANG C. Cryopreservationthe seeds of a Taiwanese terrestrial orchid， Bletillaformosana （Hayata） Schltr. by vitrification[J]. BotanicalStudies， 2013， 54： 33-38.

[82] 李慶榮， 鄭郁善. 頑拗性種子種質(zhì)超低溫保存研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003， 25（4）： 608-612.

LI Q R， ZHENG Y S. Advances in research on cryopreservationof recalcitrant seeds[J]. Acta Agriculturae UniversitatisJiangxiensis， 2003， 25（4）： 608-612. （in Chinese）

[83] CHANDEL K P S， CHAUDURY R， RADHAMANI J， MALIKS K. Desiccation and freezing sensitivity in recalcitrantseeds of tea， cocoa and jackfruit[J]. Annals of Botany， 1995，76（5）， 443-450.

[84] GONZáLEZ-BENITO M E， PEREZ C. Cryopreservation ofembryonic axes of two cultivars of hazelnut （Corylus avellalnaL.）[J]. Cryo-letters， 1994， 15（1）： 41-46.

[85] SISUNANDAR， SOPADE P A， SAMOSIR Y M S， RIVALA， ADKINS S W. Dehydration improves cryopreservation ofcoconut （Cocos nucifera L.）[J]. Cryobiology， 2010， 61（3）：289-296.

[86] SISUNANDAR， NOVARIANTO H， MASHUD N， SAMOSIRY M S， ADKINS S W. Embryo maturity plays an importantrole for the successful cryopreservation of coconut（Cocos nucifera）[J]. In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant， 2014， 50： 688-695.

[87] ABDELNOUR-ESQUIVEL A， VILLALOBOS V， ENGELMANNF. Cryopreservation of zygotic embryos of Coffeaspp.[J]. Cryo-Letters， 1992， 13： 297-302.

[88] CHAUDHURY R， MALIK S K. Desiccation and freezingsensitivity during seed development in jackfruit[J]. SeedScience Technology， 2004， 32（3）： 785-795.

[89] WEI Q， SHI P， KHAN F S， HTWE Y M， ZHANG D， LI Z，WEI X， YU Q， ZHOU K， WANG Y. Cryopreservation andcryotolerance mechanism in zygotic embryo and embryogeniccallus of oil palm[J]. Forests， 2023， 14（5）： 966.

[90] FRUGERI G C， NOGUEIRA G F， DE SOUZA A L X，SCHERWINSKI-PEREIRA J E. Conservation strategies forButia capitata [Mart. （Becc.） Arecaceae]， a threatened palmtree from Brazilian savannah biome， through zygotic embryocryopreservation[J]. International Journal of Plant Biology，2023， 14（3）： 612-624.

[91] ESQUIVEL A， MORA A， VILLALOBOS V. Cryopreservationof zygotic embryos of Musa acuminata （AA） and Musabalbisiana （BB）[J]. Cryo-Letters， 1992， 13（3）： 59-164.

[92] SINGH S， AGRAWAL A， KUMAR R， THANGJAM R，JOHN K J. Seed storage behavior of Musa balbisiana Colla，a wild progenitor of bananas and plantains： implications forex situ germplasm conservation[J]. Scientia Horticulturae，2021， 280： 109926.

[93] VALDéS Y C， SHUKLA M R， GONZáLEZ VEGA M E，SAXENA P K. Improved conservation of coffee （Coffeaarabica L.） germplasm via micropropagation and cryopreservation[J]. Agronomy， 2021， 11（9）： 1861.

[94] BUSTAM S， ALI M S M， SINNIAH U R， SHAMSUDDINN， KADIR A M A. Short-term storage of seeds and cryopreservationof embryonic axes of Lepisanthes fruticose[J]. AnnualResearch amp; Review in Biology， 2021， 36（7）： 112-123.

[95] GENEROSO A L， GARVALHO V S， WALTER R，CAMPBELL G， DA SILVA ARAúJO L， SANTANA J G S，DA CUNHA M. Mature-embryo culture in the cryopreservationof passion fruit （Passiflora edulis Sims） seeds[J]. ScientiaHorticulturae， 2019， 256： 108638.

[96] SAJINI K K， KARUN A， AMARNATH C H， ENGELMANNF. Cryopreservation of coconut （Cocos nucifera L.） zygoticembryos by vitrification[J]. Cryo-Letters， 2011， 32（4）：317-328.

[97] SILVA S S S， SOUZA E H，SOUZA F V D， MAX D A S，ROSSI M L， COSTA M A P C. Post-seminal developmentand cryopreservation of endemic or endangered bromeliads[J]. Anais da Academia Brasileira de Ciências， 2021，93（1）： e20191133.

[98] ASHMORE S E， DREW R A， O’BRIEN C， PARISI A.Cryopreservation of papaya （Carica Papaya L.） seed： overcomingdormancy and optimizing seed desiccation and storageconditions[J]. Acta Horticulturae， 2009， 839： 229-236.

[99] THAMMASIRI K. Cryopreservation of seeds of a Thai orchid（Doritis pulcherrima Lindl.） by vitrification[J].Cryo-Letters， 2000， 21（4）： 237-244.

[100] JITSOPAKUL N， THAMMASIRI K， ISHIKAWA K. Cryopreservationof Bletilla striata mature seeds， 3-day germinatingseeds and protocorms by droplet-vitrification[J].Cryo-Letters， 2008， 29（6）： 517-526.

[101] 陳珊. 花粉超低溫保存的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2007， 13（7）： 39-40.

CHEN S. Cryopreservation on pollen[J]. Anhui AgriculturalScience Bulletin， 2007， 13（7）： 39-40. （in Chinese）

[102] DINATO N B， IMACULADA SANTOS I R， ZANATTOVIGNA B B， DE PAULA A F， FáVERO A P. Pollen cryopreservationfor plant breeding and genetic resources conservation[J]. Cryo-Letters， 2020， 41（3）： 115-127.

[103] KARUN A， SAJINI KK， NIRAL V， AMARNATH C H，REMYA P， RAJESH M K， SAMSUDEEN K， JERARD B A，ENGELMANN F. Coconut （Cocos nucifera L.） pollen cryopreservation[J]. Cryo-Letters， 2014， 35（5）： 407-417.

[104] TANDON R， CHAUDHURY R， SHIVANNA K R. Cryopreservationof oil palm pollen[J]. Current Science， 2007，92（2）： 182-183.

[105] ANILKUMAR G S， RAJASEKHARAN P E. Pollen cryopreservationprotocol for dragon fruit， pollen cryopreservationprotocols[M]. New York： Springer， 2023： 113-122.

[106] CHAUDHURY R， MALIK， S K， RAJAN S. An improvedpollen collection and cryopreservation method for highly recalcitranttropical fruit species of mango （Mangifera indicaL.） and litchi （Litchi chinensis Soon.）[J]. Cryo-Letters， 2010，31（3）： 268-278.

[107] VEENA G L， MASTIHOLI L， RAJASEKHARAN P E.Pollen cryopreservation in mango， pollen cryopreservationprotocols[M]. New York： Springer， 2023： 199-211.

[108] EKARATNE S N R， SENATHIRAJAH S. Viability andstorage of pollen of the oil palm， Elaeis guineensis Jacq[J].Annuals of Botany， 1983， 51（5）： 661-668.

[109] VISHWAKARMA P K， VINCENT L， VASUGI C， RAJASEKHARANP E. Effect of cryopreservation on pollen viability，fertility and morphology of different Psidium species[J].Cryobiology， 2021， 98： 112-118.

[110] NAVYA B L， RAJASEKHARAN P E， GUTAM S. PollenCryopreservation in Jackfruit （Artocarpus heterophyllus） forcrop improvement， pollen cryopreservation protocols[M].New York： Springer， 2023： 135-145.

[111] SILVA R L D， SOUZA E H D， DE JESUS VIEIRA L，PELACANI C R， SOUZA F V D. Cryopreservation of pollenof wild pineapple accessions[J]. Scientia Horticulturae，2017， 219： 326-334.

[112] GANESHAN S. Cryogenic preservation of papaya pollen[J].Scientia Horticulturae， 1986， 28： 65-70.

[113] 李丹， 秦青， 趙琪， 戴紹軍. 植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)答非生物脅迫蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2016， 3： 225-227.

LI D， QIN Q， ZHAO Q， DAI S J. Abiotic stress-responsiveproteomics in plants suspension cultured cells[J]. ModernAgricultural Science and Technology， 2016， 3： 225-227. （inChinese）

[114] BABICH O， SUKHIKH S， PUNGIN A， IVANOVA S， ASYAKINAL， PROSEKOV A. Modern trends in the in vitroproduction and use of callus， suspension cells and root culturesof medicinal plants[J]. Molecules， 2022， 27（17）： 5513.

[115] MUSTAFA N， DE WINTER W， VAN IREN F， VERPOORTER. Initiation， growth and cryopreservation of plant cellsuspension cultures[J]. Nature Protocols， 2011， 6： 715-742.

[116] WANG B， ZHANG Z， YIN Z， FENG C， WANG Q. Noveland potential application of cryopreservation to plant genetictransformation[J]. Biotechnology Advances， 2012， 30（3）：604-612.

[117] FINKLE B J， ULRICH J M. Effects of cryoprotectants incombination on the survival of frozen sugarcane cells[J].Plant Physiology， 1979， 63（4）： 598-604.

[118] GNANAPRAGASAM S， VASIL I K. Plant regenerationfrom a cryopreserved embryogenic cell suspension of a commercialsugarcane hybrid （Saccharum sp.）[J]. Plant Cell Reports，1990， 9（8）： 419-423.

[119] PANIS B， WITHERS L A， LANGHE E D. Cryopreservationof Musa suspension cultures and subsequent regeneration ofplants[J]. Cryo-Letters， 1990， 11： 337-350.

[120] GEORGET F， ENGELMANN F， DOMERGUE R， C?TE F.Morpho-histological study of banana （Musa spp. cv. GrandeNaine [AAA]） cell suspensions during cryopreservation andregeneration[J]. Cryo-Letters， 2009， 30（6）： 398-407.

[121] 李艷娜， 尉義明， 胡桂兵， 陳厚彬， 徐春香. 香蕉胚性細(xì)胞懸浮系玻璃化法超低溫保存及再生植株遺傳穩(wěn)定性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2010， 37（6）： 899-905.

LI Y N， WEI Y M， HU G B， CHEN H B， XU C X. Plant regenerationvia somatic embryogenesis after cryopreservationof embryogenic cell suspensions of banana （Musa spp. AAA）by vitrification and the genetic stability of regenerated plant[J].Acta Horticulturae Sinica， 2010， 37（6）： 899-905. （in Chinese）

[122] 謝玉明， 曾繼吾， 張秋明， 易千軍. 玻璃化法超低溫保存荔枝胚性懸浮細(xì)胞[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2008， 29（5）： 622-625.

XIE Y M， ZENG J W， ZHANG Q M， YI Q J. Cryopreservationof litchi embryogenic suspension cells by vitrificationtechnique[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2008， 29（5）：622-625. （in Chinese）

[123] 李運(yùn)合， 李玉生， 張金梅， 陳曉玲， 趙艷華， 吳永杰. 芒果細(xì)胞超低溫保存存活機(jī)理[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2016， 52（10）：1474-1480.

LI Y H， LI Y S， ZHANG J M， CHEN X L， ZHAO Y H， WUY J. The survival mechanism of mango cells duringcryopreservation[J]. Plant Physiology Journal， 2016， 52（10）：1474-1480. （in Chinese）

[124] 盛德策， 李鳳蘭， 劉忠華. 植物體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)胞生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2008， 28（1）： 204-215.

SHENG D C， LI F L， LIU Z H. Advances in the cytobiologyof plant somatic embryogenesis[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2008， 28（1）： 204-215. （in Chinese）

[125] BRETON D， HARVENGT L， TRONTIN J F O， FAVRE JM. High subculture frequency， maltose-based and hormonefreemedium sustained early development of somatic embryosin maritime pine[J]. In Vitro Cellular amp; DevelopmentalBiology-Plant， 2005， 41（4）： 494-504.

[126] ULRICH J M， FINKLE B J， MOORE P H， GINOZA H.Effect of a mixture of cryoprotectants in attaining liquid nitrogensurvival of callus cultures of a tropical plant[J]. Cryobiology，1979， 16（6）： 550-556.

[127] 簡(jiǎn)令成， 孫德蘭， 孫龍華. 甘蔗愈傷組織超低溫保存中一些因素的研究[J]. 植物學(xué)報(bào)， 1987， 29（2）： 123-131.

JIAN L C， SUN D L， SUN L H. Studies on factors in cryopreservationof sugarcane calluses[J]. Acta Botanica Sinica，1987， 29（2）： 123-131. （in Chinese）

[128] MARTíNEZ-MONTERO M E， GONZáLEZ-ARNAO M T，BORROTO-NORDELO C， PUENTES-DIAZ C， ENGELMANNF. Cryopreservation of sugarcane embryogenic callususing a simplified freezing process[J]. Cryo-Letters， 1998，19（7）： 171-176.

[129] MARTíNEZ-MONTERO M E， MARTíNEZ J， ENGELMANNF. Cryopreservation of sugarcane somatic embryos[J].Cryo-Letters， 2008， 29（3）： 229-242.

[130] ZHOU Q N， SUN A H， LI Z， HUA Y W， JIANG Z H， HUANGT D， DAI X M， HUANG H S. Cryopreservation and plantregeneration of anther callus in Hevea by vitrification[J]. AfricanJournal of Biotechnology， 2012， 11： 7212-7217.

[131] 郭玉瓊， 賴(lài)鐘雄， 呂柳新. 玻璃化法超低溫保存龍眼胚性愈傷組織的初步探討[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006， 35（3）： 262-265.

GUO Y Q， LAI Z X， LYU L X. Preliminary study on cryopreservationof longan calli by vitrification[J]. Journal of FujianAgriculture and Forestry University （Natural ScienceEdition）， 2006， 35（3）： 262-265. （in Chinese）

[132] MATSUMOTO K， RAHARJO S H T， DHEKNEY S，MOON P A， LITZ R E. Cryopreservation and somatic embryogenesis of Dimocarpus longan calli[J]. Pesquisa AgropecuáriaBrasileira， 2004， 39（12）： 1261-1263.。

[133] 郭玉瓊， 賴(lài)鐘雄， 呂柳新. 玻璃化法超低溫保存荔枝胚性愈傷組織及其植株再生[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2007， 36（1）： 34-37.

GUO Y Q， LAI Z X， LYU L X. Cryopreservation of embryogeniccalli by vitrification and plant regeneration viasomatic embryogenesis in litchi[J]. Journal of Fujian Agricultureand Forestry University （Natural Science Edition），2007， 36（1）： 34-37. （in Chinese）

[134] REN L， WANG M R， WANG Q C. ROS-induced oxidativestress in plant cryopreservation： occurrence and alleviation[J].Planta， 2021， 254（6）： 124.

[135] WANG M R， BI W， SHUKLA M R， HAMBORG Z，BLYSTAD D R， SAXENA P K， WANG Q C. Epigeneticand genetic integrity， metabolic stability， and field performanceof cryopreserved plants[J]. Plants， 2021， 10（9）： 1889.

[136] AGRAWAL A， TYAGI R K， GOSWAMI R. Cryobankingof banana （Musa sp.） germplasm in India： evaluation of agronomicand molecular traits of cryopreserved plants[J]. ActaHorticulturae， 2011（908）： 129-138.

[137] AGRAWAL A， SANAYAIMA R， SINGH R， TANDON R，VERMA S， TYAGI R K. Phenotypic and molecular studiesfor genetic stability assessment of cryopreserved bananameristems derived from field and in vitro explant sources[J].In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant， 2014， 50：345-356

[138] LI Y R， SONG X P， WU J M， LI C N， LIANG Q， LIU X H，WANG W Z， TAN H W， YANG L T. Sugar industry andimproved sugarcane farming technologies in China[J]. SugarTech， 2016， 18（6）： 603-611.

[139] BAIRU M W， AREMU A O， VAN STADEN J. Somaclonalvariation in plants： causes and detection methods[J]. PlantGrowth Regulation， 2011， 63： 147-173.

[140] GANTAIT S， SINNIAH U R， SURANTHRAN P， PALANYANDYS R， SUBRAMANIAM S. Improved cryopreservationof oil palm （Elaeis guineensis Jacq.） polyembryoids usingdroplet vitrification approach and assessment of geneticfidelity[J]. Protoplasma， 2015， 252： 89-101.

[141] WELEWANNI I， PERERA C， JAYASEKERA A， BANDUPRIYAD. Recovery， histological observations and geneticintegrity in coconut （Cocos nucifera L.） embryogenic callicryopreserved using encapsulation-dehydration procedure[J].Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka，2020， 48（2）： 175-186.

[142] SISUNANDAR， RIVAL A， TURQUAY P， SAMOSIR Y，ADKINS S W. Cryopreservation of coconut （Cocos nuciferaL.） zygotic embryos does not induce morphological， cytologicalor molecular changes in recovered seedlings[J]. Planta，2010， 232： 435-447.

[143] HARDING K. Genetic integrity of cryopreserved plant cells：a review[J]. Cryo-Letters， 2004， 25（1）： 3-22.

[144] ADU-GYAMFI R， WETTEN A， LóPEZ C M R. Effect ofcryopreservation and post-cryopreservation somatic embryogenesison the epigenetic fidelity of cocoa （Thebromacacao L.）[J]. PLoS One， 2016， 11（7）： e0158857.

基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2021YFC2600603）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（No. 1630032023011）。