摘 要：SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1）是植物中的一個(gè)開花時(shí)間調(diào)節(jié)因子，屬于MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SOC1 參與多種生物過程，包括花器官發(fā)育、開花時(shí)間控制以及對(duì)環(huán)境刺激和激素信號(hào)的響應(yīng)。本研究通過遮蔭和噴施樂斯本的方式對(duì)蓮霧進(jìn)行催花處理，統(tǒng)計(jì)處理后的葉芽和花芽數(shù)量以及成花枝率，同時(shí)，利用課題組現(xiàn)有的蓮霧轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，篩選出調(diào)控蓮霧開花的候選基因SsSOC1，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)研究遮蔭處理和噴施樂斯本藥劑處理下蓮霧不同時(shí)期和組織中SsSOC1 表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示：經(jīng)過遮蔭處理的蓮霧樹體芽點(diǎn)、葉片、葉尖以及葉柄中的SsSOC1 基因表達(dá)量顯著增加，其中葉尖的相對(duì)表達(dá)量最高。本研究成功克隆了蓮霧黑糖芭比品種的SsSOC1 基因，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行啟動(dòng)子分析、蛋白理化性質(zhì)分析、保守功能域的預(yù)測(cè)和序列比對(duì)。結(jié)果表明：SsSOC1 基因的開放閱讀框長(zhǎng)度為654 bp，共編碼217 個(gè)氨基酸，其編碼蛋白的理論等電點(diǎn)為9.37，分子式為C1076H1794N322O334S10，分子量為24.91 kDa，帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Lys+Arg）為40，帶負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為32，脂肪系數(shù)為80.64，總平均親水性系數(shù)（GRAVY）為–0.729，不穩(wěn)定系數(shù)為66.17；蓮霧SsSOC1 蛋白結(jié)構(gòu)不含β-折疊，不屬于分泌蛋白與膜結(jié)構(gòu)蛋白，亞細(xì)胞定位顯示其主要存在于細(xì)胞核中，屬于不穩(wěn)定的親水性堿性蛋白，該蛋白具有MADS_MEF2_like 和K-Box保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)隸屬于MADS 超級(jí)家族和K-Box 超級(jí)家族，該結(jié)構(gòu)域的起止氨基酸位點(diǎn)為第3～75 位和第88～171 位，符合MADS 蛋白家族與K-Box 家族的典型結(jié)構(gòu)特征；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，蓮霧SsSOC1 序列與油葉蒲桃的同源性最高；通過花序侵染法將SsSOC1 基因轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn)35S：：SsSOC1 表現(xiàn)出早花表型，蓮座葉數(shù)量比野生型要少。本研究初步確定了SsSOC1 基因在成花方面的重要作用，并揭示蓮霧遮蔭與成花相關(guān)的內(nèi)在調(diào)控機(jī)理，為蓮霧生產(chǎn)提供指導(dǎo)意義，以及為蓮霧反季節(jié)栽培技術(shù)改良提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蓮霧；成花；SsSOC1；基因克??；轉(zhuǎn)錄活性分析；表達(dá)模式分析

中圖分類號(hào)：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

蓮霧[Syzygium samarangense （BI.） Merr.etPerry]是桃金娘科蒲桃屬常綠果樹，又名洋蒲桃，被譽(yù)為“水果皇帝”，以其清甜的口味和高水分含量而深受東南亞地區(qū)消費(fèi)者的喜愛[1]。蓮霧最先被引進(jìn)我國(guó)臺(tái)灣，目前在廣東、廣西、福建等地大規(guī)模種植[2]。蓮霧具有一年多次開花結(jié)果的特點(diǎn)，但主要開花結(jié)果時(shí)期在夏季。南方夏季高溫多雨，容易遭受到病蟲害的侵襲，導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)參差不齊，而且夏季水果大量上市，價(jià)格不具優(yōu)勢(shì)，因此科研人員對(duì)蓮霧的產(chǎn)期調(diào)節(jié)技術(shù)開展了較多研究[3]。

對(duì)于大多數(shù)植物而言，遮蔭會(huì)導(dǎo)致光線不足，限制植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，導(dǎo)致徒長(zhǎng)和過度的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，從而引起營(yíng)養(yǎng)器官與生殖器官之間的競(jìng)爭(zhēng)，不利于開花。然而，對(duì)于蓮霧來說，遮蔭處理卻具有促進(jìn)開花的作用[4]。遮蔭處理可以使蓮霧的葉芽和花芽進(jìn)入休眠狀態(tài)，控制新梢的生長(zhǎng)抽生，減少整個(gè)樹體養(yǎng)分的消耗，提高蓮霧的開花率[5]。早期的研究者對(duì)蓮霧的印度紅品種進(jìn)行了產(chǎn)期調(diào)控實(shí)驗(yàn)[6]，通過噴施蓮霧促花靈、多效唑和催花劑，結(jié)合環(huán)剝、遮蔭、斷根等措施，實(shí)現(xiàn)了印度紅蓮霧反季節(jié)開花，并獲得了比正造果更好的品質(zhì)和更高的經(jīng)濟(jì)效益。研究發(fā)現(xiàn)，樂斯本可以促進(jìn)蓮霧提前開花，但其促進(jìn)蓮霧開花的機(jī)制并未明晰。最近，一些學(xué)者開始對(duì)蓮霧的基因組學(xué)進(jìn)行研究，挖掘與蓮霧生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因，但這些基因大多數(shù)與蓮霧果實(shí)成熟相關(guān)[7-8]，有關(guān)蓮霧開花相關(guān)基因的研究報(bào)道較少。

SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSIONOF CONSTANS 1）及其同源基因編碼MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子[9]，影響植物的成花過程。SOC1 通常作為生殖階段轉(zhuǎn)換的潛在標(biāo)記基因[10]，在擬南芥中，AtSOC1 過表達(dá)的植株表現(xiàn)出早花的現(xiàn)象，并且相較于野生型植株，AtSOC1 過表達(dá)的植株蓮座葉數(shù)量較少，表明SOC1 在調(diào)控?cái)M南芥開花中起重要作用。SOC1 通過多種途徑促進(jìn)植物開花[11]，它整合來自長(zhǎng)日照、自主和春化途徑的多種開花信號(hào)并參與花發(fā)育[12-13]。此外，它還整合了來自植物年齡和赤霉素的開花信號(hào)[14]，是植物開花信號(hào)的重要整合子。在光周期途徑中，CO（CONSTANS）并不直接作用于SOC1，而是激活FT（FLOWERING LOCUS T）后再調(diào)控SOC1[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，即使關(guān)閉FT 與SOC1 之間的作用通路，赤霉素途徑仍能激活SOC1[16]。目前對(duì)于蓮霧SOC1 基因的功能分析未見報(bào)道。為此，本研究開展SsSOC1 基因的功能分析，為進(jìn)一步研究SsSOC1 在蓮霧成花等方面的功能提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試材料為8 年生黑糖芭比蓮霧品種，采自廣州市天河區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)果園（23°9?40?N，113°21?18?E）。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)用材料為哥倫比亞野生型擬南芥（Columbia-0）。

1.1.2 菌株及載體

植物雙元表達(dá)載體pGreenII-35S-C1 由高用順老師惠贈(zèng)；pMD18-T 購自TaKaRa 公司；大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101 購自上海唯地生物技術(shù)有限公司購。

1.1.3 主要試劑

多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（RNA prep Pure）、植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒[HiScript? II Q RTSuperMix for qPCR（+gDNA wiper）]、同源重組試劑盒（ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit）購自諾唯贊（南京）公司；qPCR 試劑（HieffUNICON? Power qPCR SYBR Green MasterMix）、菌落PCR 鑒定試劑（Hieff? PCR MasterMix）購自翌圣生物科技（上海）有限公司；PCR高保真酶（PrimeSTAR? Max DNA Polymerase）購自寶生生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、LB 培養(yǎng)基、Glufosinate Ammonium 10%Solution（Basta）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.4 引物

內(nèi)參基因選用β -actin 基因，使用Primer Premier 5.0（Premier 公司）軟件設(shè)計(jì)引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR 采用LightCycler? 480 Real-Time PCR system 儀器（Roche， Basel， Switzerland）。熒光定量采用艾科瑞（湖南）生物的SYBRGreen Pro TagHS 預(yù)混型qPCR 試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 遮蔭處理后蓮霧花芽、成花枝率及枝梢長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)

為了探究遮蔭處理對(duì)黑糖芭比蓮霧樹體成花的影響，分別記錄未經(jīng)遮蔭處理[對(duì)照組，光合有效外輻射（ PARe ）： （1448.9±41.3）μmol/（m2·s），0%遮蔭率]與經(jīng)過遮蔭處理[處理組，PARe：（145.2±12.1）μmol/（m2·s），90%遮蔭率]在解除遮蔭處理后21 d 時(shí)的花芽數(shù)、成花枝率（以成花枝的數(shù)量除蓮霧樹體總成熟枝數(shù)）以及枝梢長(zhǎng)度。

1.2.2 遮蔭對(duì)蓮霧SsSOC1 基因表達(dá)水平的影響分析

在遮蔭期間，每隔3 d 采集1 次芽點(diǎn)（在對(duì)照組中為葉芽，處理組中為花芽）、葉片、葉尖以及葉柄。采集后的各個(gè)組織立即用液氮進(jìn)行冷凍處理，于–80 ℃冰箱保存，之后進(jìn)行RNA 提取再反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用qRT-PCR 技術(shù)進(jìn)行SsSOC1 基因不同組織的表達(dá)模式分析。反應(yīng)體系：cDNA 稀釋模板3 μL，Primer F（0.25 μmol/L）1 μL，Primer R（0.25 μmol/L）1 μL，SYBR GreenPCR Master mix 5 μL。反應(yīng)程序參照qPCR 試劑（ Hieff UNICON? Power qPCR SYBR GreenMaster Mix）說明書。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 基于轉(zhuǎn)錄組篩選出合適的序列，在NCBI 數(shù)據(jù)庫使用ORF finder 工具找到最長(zhǎng)開放閱讀框（ORF），根據(jù)最長(zhǎng)ORF 區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行克隆測(cè)序。利用在線工具（表2）對(duì)SsSOC1 進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫的BLAST 功能篩選與SsSOC1 基因相似的不同于蓮霧的其他物種中的SOC1 基因，獲得其蛋白質(zhì)序列，利用MEGA 7.0 軟件中的NJ 法對(duì)其構(gòu)建進(jìn)化樹，其中boostrap 設(shè)置為1000，用以驗(yàn)證可信度。

1.2.4 目的基因克隆及載體構(gòu)建

使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取蓮霧總RNA，得到RNA 樣品后，取1 μL 樣品使用Thermo scientificNanoDrop 2000 測(cè)定總RNA 濃度及純度。取2 μL樣品通過瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA 的完整性和濃度。用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于基因擴(kuò)增。利用課題組現(xiàn)有的蓮霧轉(zhuǎn)錄組查找到SsSOC1 序列（Unigene0006265）后，于Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)SsSOC1 的擴(kuò)增引物（SsSOC1-pMD18-T-F，SsSOC1-pMD18-T-R，表1）。以反轉(zhuǎn)錄后所得cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增SsSOC1 編碼區(qū)片段，反應(yīng)體系：2×PCR buffer forKOD FX 25 μL ， 2 mmol/L dNTPs 10 μL ，10 pmol/μL 正/反引物各1.5 μL，Template cDNA1 μL，KOD FX（1.0 U/μL）1 μL，ddH2O 補(bǔ)充至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)。4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定目的片段大小后，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。目的片段經(jīng)過回收后采用同源重組試劑盒與pMD18-T 載體連接，連接后均勻涂布于含100 mg/mL Amp 抗性的LB 固體培養(yǎng)基上，平板倒置，37 ℃培養(yǎng)12 h。使用無菌的槍頭將單個(gè)菌落挑至20 mL 滅菌水中混勻，37 ℃孵育30 min。取1 μL 作為PCR 模板，進(jìn)行菌液PCR 及電泳鑒定，將含有目的基因片段加入含100 mg/mL Amp的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)8 h 后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證后用質(zhì)粒提取試劑盒提取pMD18-T-SsSOC1 質(zhì)粒。以pMD18-T-SsSOC1 載體質(zhì)粒為模板，使用引物（SsSOC1-C1- F/SsSOC1-C1-R）對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用Hind III 和Xba I 限制性內(nèi)切酶對(duì)pGreen II-35S-C1 載體進(jìn)行酶切。以未酶切質(zhì)粒為對(duì)照采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。隨后進(jìn)行切膠回收。純化后的目的基因片段與線性化功能載體使用同源重組試劑盒將pGreenII-35S-C1 載體與SsSOC1 基因片段連接。反應(yīng)體系：SsSOC1 基因片段100 ng，pGreenII-35S-C1 線性化載體100 ng，5×CE II Buffer 4 μL，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃ 30 min，0 ℃ 5 min。隨后轉(zhuǎn)化至DH5α，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR 鑒定，鑒定完成后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒保存。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥過表達(dá)實(shí)驗(yàn)

取100 ng pGreenII-35S-C1-SsSOC1 質(zhì)粒加入50 μL農(nóng)桿菌感受態(tài)（GV3101）中，撥打混勻，冰上靜置5 min，液氮5 min，37 ℃水浴5 min，冰浴5 min；加入700 μL 無抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，于28 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h；6000 r/min 離心1 min；留取100 μL 左右上清液輕輕吹打重懸，將菌塊涂布于含Rif 25 mg/L+Kan 50 mg/L 的LB 平板上倒置，28 ℃培養(yǎng)2 d。挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，最后將檢測(cè)正確的農(nóng)桿菌保存于10%甘油中，并于–80 ℃保存。采用花序浸染法[17]進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，含有重組質(zhì)粒的上述甘油農(nóng)桿菌，在含有Rif 25 mg/L+Kan 50 mg/L 的LB 平板上劃線，于28 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h。吸取4 mL 搖濃的菌液加入到200 mL 含相應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)至OD600=1.0；5000 r/min 離心10 min，收集細(xì)胞并懸浮于0.5%蔗糖滲透培養(yǎng)液（含有0.02% Silwet-77），調(diào)整OD600=0.8；將盛花期擬南芥花完全浸入農(nóng)桿菌懸浮液中侵染2 min，放入黑色托盤中，置于黑暗環(huán)境下避光培養(yǎng)24 h 后于正常光照下培養(yǎng)。

1.2.6 陽性苗的鑒定

將收取到的T0 代種子經(jīng)過4 ℃低溫浸泡后均勻播撒在花盤中，在生長(zhǎng)條件為23 ℃，長(zhǎng)日照（16 h/8 h）培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)至1 周左右時(shí)（子葉展平），噴施0.1%Basta 進(jìn)行篩選。取葉片組織提取DNA 和RNA，隨后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳和定量PCR 的測(cè)定，對(duì)檢測(cè)正確的陽性苗和野生型植株進(jìn)行跟蹤觀察，待擬南芥抽薹開花長(zhǎng)至1 cm 時(shí)，統(tǒng)計(jì)所需天數(shù)以及蓮座葉數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel、SPSS（v 26.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性分析，使用GraphPad Prism（v8.0.2）軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遮蔭處理對(duì)蓮霧成花的影響

遮蔭處理對(duì)蓮霧樹體中的花芽數(shù)、成花枝率及新梢長(zhǎng)度有著顯著的影響（圖1），經(jīng)過遮蔭處理（T）的花芽數(shù)比未經(jīng)遮蔭處理（CK）高123.39%。同時(shí)，處理組的成花枝率比對(duì)照組高115.06%。而處理組蓮霧樹體的新梢長(zhǎng)度明顯短于對(duì)照組，表明一定程度的遮蔭處理會(huì)減短新梢長(zhǎng)度。

2.2 遮蔭處理對(duì)蓮霧不同組織部位中SsSOC1基因表達(dá)水平的影響

在對(duì)照組的各個(gè)組織中，SsSOC1 的相對(duì)表達(dá)量差異不大，且數(shù)值較低。但遮蔭處理組蓮霧的芽點(diǎn)、葉片、葉尖以及葉柄中的SsSOC1 相對(duì)表達(dá)量均增加，其中，葉尖中的SsSOC1 相對(duì)表達(dá)量最高，是對(duì)照組的10 倍；葉柄中的SsSOC1 相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組之間差異最大，是對(duì)照組的14倍；處理組花芽中的SsSOC1 相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組葉芽的4 倍（圖2）。

2.3 SsSOC1 基因的克隆

本研究從黑糖芭比蓮霧葉片中提取總RNA，并用1%濃度的瓊脂糖膠檢測(cè)其質(zhì)量，膠圖顯示質(zhì)量良好（圖3A）。反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，以其為模板，用PCR 擴(kuò)增出SsSOC1 編碼區(qū)序列，獲得全長(zhǎng)654 bp 的目的基因（圖3B）。為驗(yàn)證得到的SsSOC1序列的準(zhǔn)確性，將擴(kuò)增的SsSOC1 編碼區(qū)序列與pMD18-T 載體進(jìn)行連接并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增獲得的基因序列與轉(zhuǎn)錄組中對(duì)應(yīng)的基因序列完全一致（Unigene0006265），成功得到目的基因SsSOC1（圖3C）。

2.4 SsSOC1 蛋白序列結(jié)構(gòu)分析

利用相關(guān)在線工具對(duì)蓮霧的SsSOC1 蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，SsSOC1 蛋白的理論等電點(diǎn)為9.37，分子式為C1076H1794N322O334S10，分子量為24.91 kDa，帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Lys+Arg）為40，帶負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為32，脂肪系數(shù)為80.64，總平均親水性系數(shù)（GRAVY）為–0.729，不穩(wěn)定系數(shù)為66.17；SsSOC1 蛋白親水性最低點(diǎn)值為–3.144，疏水性最高點(diǎn)值為2.122（圖4A），推測(cè)該蛋白為親水性蛋白；SsSOC1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占比最高，為60.83%，延伸鏈和無規(guī)則卷曲占比分別為9.22%、25.81%，無β-折疊（圖4B），SsSOC1 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)見圖4C；SsSOC1 蛋白具有MADS_MEF2_like 和K-Box 保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)隸屬于MADS 超級(jí)家族和K-Box 超級(jí)家族，該結(jié)構(gòu)域的起止氨基酸位點(diǎn)為第3～75 位和第88～171 位，符合MADS蛋白家族與K-Box 家族的典型結(jié)構(gòu)特征（圖4D）；SsSOC1 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示SsSOC1蛋白不含信號(hào)肽（圖4E）；SsSOC1 蛋白的跨膜區(qū)域檢測(cè)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白不是分泌蛋白與膜結(jié)構(gòu)蛋白，定位于細(xì)胞核中（圖4F）。

2.5 SsSOC1 蛋白同源序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 功能對(duì)SsSOC1 的氨基酸序列與油葉蒲桃（Syzygiumoleosum）、大桉（Eucalyptus grandis）、銀葉玫瑰木（Rhodamnia argentea）、胡桃（Juglans regia）、歐洲榛（Corylus avellana）、小果胡桃與核桃雜交種（Juglans microcarpa × Juglans regia）、棗（Ziziphus jujuba）、歐洲凱木（Alnus glutinosa）、美國(guó)山核桃（Carya illinoinensis）、可可（Theobromacacao）、楊梅（Morella rubra）、石榴（Punicagranatum）、白櫟（Quercus lobata）、榴蓮（Duriozibethinus）、山核桃（Carya cathayensis）、川桑（Morus notabilis）等16 種植物的SOC1 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，蓮霧SsSOC1 蛋白序列與油葉蒲桃的同源性最高，相似度高達(dá)99.08%，而與川桑的蛋白序列同源性最低，相似度只有78.24%（圖5A）。利用MEGA 7 軟件構(gòu)建SsSOC1 氨基酸序列與以上16 個(gè)物種的SOC1 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5B），發(fā)現(xiàn)蓮霧與油葉蒲桃聚于同一分支，親緣關(guān)系相比其他物種最近，而與小果胡桃與核桃雜交種、胡桃的親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。

2.6 SsSOC1 基因的功能分析

為了驗(yàn)證蓮霧SsSOC1 基因的功能，本研究構(gòu)建過表達(dá)載體35S：：SsSOC1，并將其轉(zhuǎn)入哥倫比亞野生型擬南芥中，通過噴施Basta 和PCR 鑒定篩選轉(zhuǎn)基因植株，觀察轉(zhuǎn)基因的開花相關(guān)表型，并統(tǒng)計(jì)T1 和T2 代的開花時(shí)間和蓮座葉數(shù)量。通過觀察轉(zhuǎn)基因后代表型，并與野生型擬南芥（WT）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)35S：：SsSOC1 株系營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期明顯短于野生型植株，并且其抽薹時(shí)間顯著提前（圖6A），在抽薹開花時(shí)，葉片數(shù)量與野生型相比明顯減少（圖6B），成功轉(zhuǎn)入SsSOC1 基因的植株平均提早8 d 開花（圖6C）。結(jié)果表明成功轉(zhuǎn)入SsSOC1 基因能夠使擬南芥的開花時(shí)間提前。

3 討論

遮蔭對(duì)蓮霧的開花時(shí)間已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道[18]。目前，大多數(shù)蓮霧種植者使用遮蔭技術(shù)結(jié)合化學(xué)調(diào)控來調(diào)節(jié)蓮霧的開花，然而這種調(diào)控機(jī)制的具體原理仍知之甚少。遮蔭對(duì)植物的生長(zhǎng)影響復(fù)雜，不同植物受到的影響也各不相同。遮蔭對(duì)紅椿（Toonaciliata）、香樟（Cinnamomum camphora）[19]幼苗和擬單性木蘭（Parakmeria yunnanensis）[20]不利，會(huì)顯著抑制苗高和地徑。然而，對(duì)于移栽期的超級(jí)水稻，遮蔭后植株高度顯著增加[21]。此外，遮蔭也促進(jìn)了油茶（Camellia oleifera）的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)[22]。

本課題組前期已對(duì)SsSOC1 基因和SsCOP1基因進(jìn)行了基礎(chǔ)的功能驗(yàn)證，并初步探究了遮蔭處理對(duì)蓮霧光合特性的影響[3]。本研究基于前期研究結(jié)果展開更為細(xì)致的探索，重點(diǎn)分析SsSOC1 的結(jié)構(gòu)、特性以及其在蓮霧中的具體作用。

SOC1 在對(duì)植物成花的過程發(fā)揮著重要的作用，是花器官分生組織形成過程中的關(guān)鍵基因之一，其能夠整合外界以及內(nèi)在因素等各種信號(hào)，從而激活下游花器官發(fā)育相關(guān)基因[23]。經(jīng)過遮蔭處理蓮霧的葉片、花芽、葉尖以及葉柄中SsSOC1相對(duì)表達(dá)量都增加。其中，葉尖在處理組中SsSOC1相對(duì)表達(dá)量最高，葉柄中SsSOC1 的相對(duì)表達(dá)量在處理組與對(duì)照組之間的差異最大。

SOC1 基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，是典型的MIKC蛋白[24]。本研究克隆了蓮霧的SOC1 基因并命名為SsSOC1，利用ProtParam、ProtScale 以及Prabi等在線工具對(duì)SsSOC1 進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SsSOC1 中不存在β-折疊，α-螺旋占比最高，其屬于不穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)，不含信號(hào)肽且無跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于分泌蛋白和膜結(jié)構(gòu)蛋白，定位于細(xì)胞核。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)SsSOC1 中存在MADS_MEF2_like 和K-Box 保守結(jié)構(gòu)域。通過多重序列比對(duì)以及構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)SsSOC1 蛋白與油葉蒲桃SOC1 蛋白的同源性最高，與其他植物的SOC1序列同源性均在75%以上，表明SOC1 序列在多數(shù)物種中具有著極大的保守性，這對(duì)于今后分析蓮霧中K-box 基因家族具有重要的便利性，可通過了解其他物種K-box 基因家族中SOC1 基因的功能機(jī)制，推測(cè)蓮霧SOC1 基因的詳細(xì)表達(dá)模式和作用機(jī)制。

據(jù)報(bào)道，過表達(dá)SOC1 基因可以促進(jìn)植株提前開花，而SOC1 基因突變體則會(huì)導(dǎo)致植株開花延遲[25]。本研究轉(zhuǎn)入SsSOC1 基因的植株開花時(shí)間早于野生型植株，并且蓮座葉數(shù)量顯著少于野生型植株。這成功驗(yàn)證了SsSOC1 基因的轉(zhuǎn)入對(duì)提早開花表型的促進(jìn)作用，與預(yù)期效果一致。

果樹的產(chǎn)量在一定程度上決定于當(dāng)年開花的數(shù)量以及質(zhì)量。蓮霧是我國(guó)新興果樹品種，經(jīng)濟(jì)效益較高，但其開花數(shù)量及時(shí)間的不穩(wěn)定極大地限制了其經(jīng)濟(jì)效益，本研究能夠?yàn)榻窈笈嘤荒陜?nèi)多次開花、反季節(jié)開花并且高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的蓮霧品種提供一定的指導(dǎo)，同時(shí)本研究基于蓮霧基因組學(xué)，對(duì)蓮霧中SOC1 基因編碼的蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系以及其在不同時(shí)期不同組織的表達(dá)差異進(jìn)行分析，初步鑒定了調(diào)控蓮霧開花的主要基因之一的SsSOC1，并且對(duì)其進(jìn)行了基因驗(yàn)證得出了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為深入揭示蓮霧開花結(jié)實(shí)過程中SOC1 基因的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] SHü Z H， MEON Z， TIRTAWINATA R， THANARUT C.Wax apple production in selected tropical asian countries[J].Acta Horticulturae， 2008， 773： 161-164.

[2] 鄭加協(xié)， 周紅玲， 張少平， 鄭云云. 漳州蓮霧產(chǎn)期調(diào)節(jié)技術(shù)研究[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2016， 33（12）： 1517-1522.

ZHENG J X， ZHOU H L， ZHANG S P， ZHENG Y Y. Astudy on the techniques for producing off-season wax applesin Zhangzhou[J]. Journal of Fruit Science， 2016， 33（12）：1517-1522. （in Chinese）

[3] 蔡昕成. 遮陰對(duì)蓮霧葉片光合特性的影響及SsSOC1 和SsCOP1 的功能驗(yàn)證[D]. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2021.

CAI X C. Effects of shading on photosynthetic characteristicsof wax apple leaf and functional verification of SsSOC1and SsCOP1[D]. Guangzhou： South China AgriculturalUniversity， 2021. （in Chinese）

[4] 楊軍. 黑網(wǎng)遮陰調(diào)節(jié)蓮霧產(chǎn)期技術(shù)介紹[J]. 臺(tái)灣農(nóng)業(yè)探索，2004（2）： 34-35.

YANG J. Introduction of the technique of controlling thebirth time of wax apple by shading with black net[J]. TaiwanAgricultural Research， 2004（2）： 34-35. （in Chinese）

[5] 鄭武生. 黑珍珠蓮霧產(chǎn)期調(diào)節(jié)技術(shù)[J]. 福建果樹， 2009（3）：77-78.

ZHENG W S. Timing regulation technology of black pearllotus fog[J]. Fujian Fruit Trees， 2009（3）： 77-78. （in Chinese）

[6] 劉代興， 趙志平， 李國(guó)華. 印尼紅蓮霧產(chǎn)期調(diào)控試驗(yàn)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007（2）： 39-42.

LIU D X， ZHAO Z P， LI G H. Off-season production andflower forcing techniques for Indo Red wax apple[J]. GuangdongAgricultural Sciences， 2007（2）： 39-42. （in Chinese）

[7] 聶珂， 匡鳳元， 張珅， 吳光斌， 陳發(fā)河. 蓮霧果實(shí)采后木質(zhì)素合成相關(guān)MYB 基因家族及其作用分析[J]. 保鮮與加工， 2022， 22（1）： 92-101， 109.

NIE K， KUANG F Y， ZHANG S， WU G B， CHEN F H.Lignin synthesis related MYB gene family and the functionanalysis of postharvest wax apple fruits[J]. Storage andProcess， 2022， 22（1）： 92-101，109. （in Chinese）

[8] 魏秀清， 許玲， 章希娟， 余東， 陳志峰. 蓮霧轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析及其分子標(biāo)記開發(fā)[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45（3）：541-551.

WEI X Q， XU L， ZHANG X J， YU D， CHENG Z F. Analysison SSR information in transcriptome and development ofmolecular markers in wax apple[J]. Acta Horticulturae Sinica，2018， 45（3）： 541-551. （in Chinese）

[9] HELLIWELL C A， WOOD C C， ROBERTSON M， JAMESP W， DENNISAL E S. The Arabidopsis FLC protein interactsdirectly in vivo with SOC1 and FT chromatin and is partof a high-molecular-weight protein complex[J]. The PlantJournal， 2006， 46（2）： 183-192.

[10] WIGGE P A. Integration of spatial and temporal informationduring floral induction in Arabidopsis[J]. Science， 2005，309（5737）： 1056-1059.

[11] IMMINK R G H， POSé D， FERRARIO S， OTT F，KAUFMANN K， VALENTIM F L， DE F S， VANDER W F，VAN D A D J， SCHMID M， ANGENENT G C. Characterizationof SOC1's central role in flowering by the identificationof its upstream and downstream regulators[J]. PlantPhysiology， 2012， 160（1）： 433-449.

[12] 齊聯(lián)聯(lián)， 宿強(qiáng)， 張珂. SOC1 調(diào)控植物開花時(shí)間的分子機(jī)制[J]. 草業(yè)科學(xué)， 2022， 39（1）： 149-160.

QI L L， XU Q， ZHANG K. Molecular mechanism of floweringtime regulate by SOC1[J]. Pratacultural Science， 2022，39（1）： 149-160. （in Chinese）

[13] 曲雪亭， 劉龍飚， 張旸， 丁兵. 花期調(diào)控中SOC1 基因探究進(jìn)展[J]. 分子植物育種， 2022， 20（5）： 1537-1547.

QU X T， LIU L B， ZHANG Y， DING B. Research progressof SOC1 gene in flowering regulation[J]. Molecular PlantBreeding， 2022， 20（5）： 1537-1547. （in Chinese）

[14] LEE J， LEE I. Regulation and function of SOC1， a floweringpathway integrator[J]. Journal Citation Indicator， 2010， 61（9）：2247-2254.

[15] YOO S K， CHUNG K S， KIM J， LEE J H， HONG S M，YOOS J， YOO S Y， LEE J S， AHN J H. CONSTANS activatesSUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1through FLOWERING LOCUS T to promote flowering inArabidopsis[J]. Plant Physiology， 2005， 139（2）： 770-778.

[16] GOCAL G F， SHELDON C C， GUBLER F， MORITZ T，BAGNALL D J， MACMILLAN C P， LI S F， PARISH R W，DENNIS E S， WEIGEL D， KING R W. GAMYB-like genes，flowering， and gibberellin signaling in Arabidopsis[J]. PlantPhysiology， 2001， 127（4）： 1682-1693.

[17] ZHANG X R， HENRIQUES R， LIN S， LIN S S， NIU Q W，CAI N H. Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana using the floral dip method[J]. NatureProtocols， 2006， 1（2）： 641-646.

[18] SUN D Y， CAI X C， HU C Z， ALI A， YANG Y Y， DU Y Q，WU G L， ZHOU B Y. Effects of shading on photosyntheticcharacteristics of wax apple leaves[J]. Notulae BotanicaeHorti Agrobotanici Cluj-Napoca， 2024， 52（1）： 13367.

[19] 梁俊林， 毛繪友， 郭麗， 付楊， 吳福忠， 張健， 劉洋. 遮陰對(duì)3 種珍貴鄉(xiāng)土闊葉樹種幼苗生長(zhǎng)及光合作用的影響[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2019， 34（4）： 57-63.

LIANG J L， MAO H Y， GUO L， FU Y， WU G Z， ZHANG J，LIU Y. Influence of shading on the seedling growth of threeprecious native tree species and photosynthesis[J]. Journal ofNorthwest Forestry University， 2019， 34（4）： 57-63. （in Chinese）

[20] 韋鵬飛， 嚴(yán)理， 秦武明， 陸海會(huì)， 鐘源. 不同透光度下云南擬單性木蘭生長(zhǎng)及生理特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017，45（17）： 147-151.

WEI P F， YAN L， QIN W M， LU H H， ZHONG Y. Growthand physiological characteristics of Parakmeria yunnanensisunder different transmittance[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，2017， 45（17）： 147-151. （in Chinese）

[21] 楊東， 段留生， 謝華安， 黃庭旭. 不同生育期弱光對(duì)超級(jí)稻Ⅱ優(yōu)航2 號(hào)產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013，28（2）： 107-112.

YANG D， DUAN L S， XIE H A， HUANG T X. Effect oflight deficiency during different growth stages on grain yieldand quality of super-hybrid rice，Ⅱ youhang 2[J]. FujianJournal of Agricultural Sciences， 2013， 28（2）： 107-112. （inChinese）

[22] 馬錦林. 油茶耐弱光生理特性研究[D]. 長(zhǎng)沙： 中南林業(yè)科技大學(xué)， 2012.

MA J L. Research on physiological properties of low-lighttolerancein oil-tea Camellia plantation[D]. Changsha： CentralSouth University of Forestry and Technology， 2012.

[23] SHI Y Y， ZHANG S W， GUI Q L， QING H W， LI M， YI CX， GUO H Q， CHEN H B， XU J Z， DING F. The SOC1 geneplays an important role in regulating litchi flowering time[J].Genomics， 2024， 116（2）： 110804.

[24] KOU K， YANG H， LI H Y， FANG C， CHEN L Y， YUE L，NAN H Y， KONG L P， LI X M， WANG F， WANG J H， DUH P， YANG Z Y， BI Y D， LAI Y C， DONG L D， CHEN Q，SU T， WANG L S， LI S C， KONG F J. A functionally divergentSOC1 homolog improves soybean yield and latitudinaladaptation[J]. Current Biology， 2022， 32（8）： 1728-1742.

[25] MOON J， SUH S S， LEE H， CHOI K R， LEE I. The SOC1MADS-box gene integrates vernalization and gibberellinsignals for flowering in Arabidopsis[J]. The Plant Journal，2003， 35（5）： 613-623.

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 32072515）；廣州市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 202206010023）。