摘 要：狄克氏菌（Dickeya fangzhongdai）是引起蘭科植物毀滅性病害軟腐?。╯oft rot disease）的主要病原菌之一。病原菌致病基因在病原菌與植物互作中發(fā)揮至關重要的作用。軟腐病菌D. fangzhongdai Onc5 從福建南茜文心蘭（Oncidium，Gower Ramsey）軟腐病患病植株中分離而來。本研究旨在明確D. fangzhongdai Onc5 vfmE 基因的分子生物學特征，并分析其在侵染寄主過程中的作用，為揭示vfmE 基因在D. fangzhongdai Onc5 侵染寄主過程中的致病機制提供理論依據(jù)。本研究以D．fangzhongdai Onc5 基因組DNA 為模版，通過RT-PCR 擴增，成功獲得vfmE 基因，并進行生物信息學分析；利用RT-qPCR 分析vfmE 基因在D. fangzhongdai Onc5 侵染文心蘭過程中的表達情況。結果表明：D. fangzhongdai Onc5 vfmE 基因的ORF 為564 bp，編碼187 個氨基酸；vfmE 蛋白質的分子質量為21.93 kDa，理論等電點（pI）為9.01，含1 個AraC 超家族結構域；vfmE 蛋白質為結構不穩(wěn)定的親水性蛋白，無信號肽，不存在跨膜結構域；其蛋白質二級結構主要為α-螺旋（58.29%）和無規(guī)則卷曲（40.64%）；同源性分析表明，其氨基酸序列與Dickeya屬其他菌種的vfmE 序列具有很高的相似性（gt;86%）；RT-qPCR 分析表明：vfmE 基因在D．fangzhongdai Onc5 侵染文心蘭葉片和假鱗莖后均持續(xù)高表達，在12 h 的表達量最高（Plt;0.01），表明vfmE 蛋白在D. fangzhongdai Onc5 侵染文心蘭的過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究結果為進一步研究vfmE 基因功能和Dickeya 屬病原菌致病機制提供提論基礎，同時也有利于發(fā)展植物軟腐病新的防治靶標。

關鍵詞：狄克氏菌；vfmE 基因；克??；生物信息學分析；表達分析

中圖分類號：S432.1 文獻標志碼：A

文心蘭（Oncidium）屬于蘭科文心蘭屬植物，其植株輕巧，花形優(yōu)美，花色艷麗，具有較高的觀賞價值和商業(yè)價值，是世界上最重要的切花和盆花之一。近年來，中國尤其是臺灣省文心蘭種植面積和產(chǎn)量也在逐年上升，但文心蘭切花高峰期正值高溫高濕季節(jié)，易受到病原菌的侵害引起軟腐病。軟腐病是文心蘭栽培生產(chǎn)最致命的病害之一，感病后植株迅速水漬化，常引起整株植株腐爛致死，進而影響文心蘭全產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展[1]。

軟腐病菌Dickeya fangzhongdai Onc5 從福建南茜文心蘭（Oncidium，Gower Ramsey）軟腐病患病植株中分離而來，其基因組已測序完成。體外侵染實驗證實該菌株還可侵染蝴蝶蘭、金線蓮及鐵皮石斛等其他蘭科植物[2]。Dickeya 屬病原菌主要通過合成和分泌大量植物細胞壁降解酶（plant cell wall degration enzymes， PCWDEs）侵染宿主植物，使其展現(xiàn)“軟腐”癥狀[3]。Dickeya屬病原菌寄主范圍較廣，可引起多種作物和花卉的細菌性軟腐病，造成巨大的經(jīng)濟損失。花卉宿主包括菊花、蝴蝶蘭、百合、杜鵑、海棠和向日葵等，其他宿主主要涉及土豆、水稻、香蕉、番茄、玉米、菠蘿、大米、胡蘿卜、梨樹和煙草等[4]，尤其近年來由D. zeae 引起的水稻細菌性基腐病和香蕉軟腐病[5]，以及由D. solani 引起的馬鈴薯軟腐病均造成重大的農(nóng)業(yè)損失[6]，因此，關于Dickeya 屬病原菌致病機理的研究是當前的研究熱點。

群體感應（quorum sensing， QS）是一種細菌細胞之間的通信機制，通過釋放與細胞密度相關的QS 信號分子來調(diào)節(jié)特定基因的表達，調(diào)節(jié)細菌的群體行為，涉及細菌毒力和感染寄主[7]。2013年，NASSER 等[8]在D.dadantii 3937 菌株中發(fā)現(xiàn)一種新的群體感應系統(tǒng)——vfm 基因簇，該基因簇僅在Dickeya 屬中被發(fā)現(xiàn)且高度保守，該QS 系統(tǒng)含有vfmAZBCD ， vfmKLMNOPQRSTUVW ，vfmFGHIJ 三個操縱子和關鍵調(diào)控基因vfmE。操縱子vfmAZBCD和vfmKLMNOPQRSTUVW主要參與信號分子VFM 的合成，隨后通過ABC 轉運蛋白vfmFG 輸出胞外。胞外信號VFM 隨著細胞數(shù)量的增加逐漸積累，當VFM 達到一定的閾值，引發(fā)雙組分系統(tǒng)vfmH/vfmI 間的磷酸化，被激活的vfmH 誘導vfmE 表達，vfmE 可進一步激活下游PCWDEs 相關基因的表達，影響D. dadantii3937 對寄主的侵染。此外， vfmE 也可激活vfmKLMNOPQRSTUVW、vfmFGHIJ 和vfmAZBCD，由此，在分子水平上增加了VFM 信號合成相關基因的轉錄樣本，實現(xiàn)了VFM 信號的快速積累（圖1）。與野生型菌株相比，D. dadantii 3937ΔvfmE 突變體對非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha）的致病性明顯減弱。2019 年，LV 等[9]在D.zeae EC1 菌株中也發(fā)現(xiàn)了D. dadantii 3937 同源vfm 基因簇，該項研究表明：ΔvfmE 突變體中zeamines（D. zeae EC1 分泌的一種抗生素類植物毒素）生物合成相關基因（zmsK、zmsA、zmsC和zmsD）以及PCWDEs 合成相關基因的表達量均顯著降低。此外，該菌株vfm 群體感應系統(tǒng)還能夠影響T1SS（type Ⅰ secretion systems）、T2SS、T3SS 和T4SS 分泌系統(tǒng)基因的表達以及病原菌的運動性（motility）。BANERJEE 等[10]研究表明，D. dadantii 的毒力與第二信使環(huán)二鳥甘酸（ cyclic-di-GMP， c-di-GMP）有關，當環(huán)境中c-di-GMP 濃度較低時，vfmE 可作為效應蛋白與c-di-GMP 結合激活果膠酶（pectate lyase， Pel）合成基因pel 的表達。目前，vfmE 基因僅在D.dadantii 3937 和D. zeae EC1 菌株中報道，且都與病原菌致病系統(tǒng)——新型群體感應系統(tǒng)的調(diào)控相關?，F(xiàn)有研究表明，因菌種間的差異，新型群體感應系統(tǒng)vfm 基因簇對致病因子的調(diào)控有所不同，或許與vfmE 基因功能的差異有關。

在前期的研究中， 本課題組在D. fangzhongdaiOnc5 菌株基因組中發(fā)現(xiàn)了D. dadantii3937 同源vfm 基因簇，大小約為25 kb，其中包括vfmE。此外，課題組還對vfm 基因簇中的關鍵調(diào)控基因vfmH 和vfmI 進行了克隆、原核表達和蛋白純化?；诖?，本研究以D. fangzhongdaiOnc5 菌株為研究對象，從其基因組中克隆vfmE基因，并對其生物信息學特征及表達特征進行分析，以期為后續(xù)揭示vfmE 基因對Dickeya 屬病原菌致病性的調(diào)控機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及菌株活化

軟腐病菌D.fangzhongdai Onc5 菌株保存于忻州師范學院生化實驗室，將其置于30%的甘油中，于–80 ℃冰箱保存。pUCm-T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。菌株活化：將1% D. fangzhongdai Onc5 加入20 mL 的胰蛋白胨大豆液體（tryptose soya broth， TSB）培養(yǎng)基中，于30 ℃，150 r/min 的條件下培養(yǎng)12 h。

1.1.2 主要試劑

細菌基因組DNA 提取試劑盒、細菌總RNA 快速抽提試劑盒（bacteria total RNAisolation kit）、cDNA 合成試劑盒（MightyscriptFirst Strand cDNA Synthesis Master Mix ）、2×SanTaq PCR Master Mix （with Blue Dye）、SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒、X-Gal 溶液、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）溶液均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。TransStart? TopGreen qPCR SuperMix（+Dye I）購自北京全式金生物技術有限公司。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptose soya agar， TSA）、TSB 培養(yǎng)基與LB 培養(yǎng)基（luria-bertani medium）由本實驗室自配。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找D. fangzhongdai Onc5 菌株全基因組序列（PRJNA750274），獲取目的基因vfmE 開放閱讀框ORF 序列。使用Primer 5. 0 軟件設計引物，本研究所用引物序列見表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR 擴增目的基因序列

利用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取D. fangzhongdai Onc5菌株DNA，以此為模板進行vfmE 基因擴增。PCR擴增體系：PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各20 pmol，DNA 模板5 ng，ddH2O 補足至25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火54 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物與pUCm-T在16 ℃過夜連接，將其轉化至大腸桿菌DH5α 中，涂布于含氨芐霉素（ampicillin， Amp）的LB 培養(yǎng)基，采用Amp 抗性篩選與α-互補現(xiàn)象篩選陽性克隆轉化子，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析

通過EXPASY在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測和分析目的基因的分子質量、理論等電點、氨基酸等理化性質；利用ProtScale（ https：//web.expasy.org/protscale/）在線工具分析蛋白質的親/疏水性；通過Conserved Domain Search 軟件預測vfmE 蛋白保守結構域；使用NCBI 在線軟件（ https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對功能和DNAMAN 軟件[11]對vfmE 蛋白的氨基酸序列進行同源性分析；通過SignaIP-5.0（https：//www.novopro.cn/tools/signalp）在線工具進行信號肽預測；利用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線工具進行跨膜結構預測[12]；利用PSORTb version 3.0.3（https：//www.psort.org/psortb/）在線工具進行蛋白亞細胞定位；利用SOPMA（https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線工具對蛋白二級結構進行分析[13]；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線工具進行蛋白質三級結構預測[14]；利用蛋白質互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫（ https：//stringdb.org/）進行vfmE 基因編碼蛋白的互作預測[15]。

1.2.4 RT-qPCR 分析

以recA 為內(nèi)參基因，以E-F和E-R 為引物（表1），檢測vfmE 在D. fangzhongdaiOnc5 菌株侵染文心蘭葉片過程中的相對表達量。取樣方法參考蘇初連等[16]的方法作適當調(diào)整，具體如下：選取健康文心蘭的葉片與長勢一致的假鱗莖，將清洗干凈的葉片和假鱗莖浸泡于1%NaCIO 溶液中15 min，隨后用無菌水清洗3 遍，置于無菌培養(yǎng)皿中。用無菌穿刺注射接種生長期文心蘭葉片和假鱗莖，每個接種點5 μL D. fangzhongdaiOnc5 菌液（濃度為1×107 個/mL）。選擇0 h 以及發(fā)病期時間點取樣（3、6、9、12、18、24 h），剪取接種點周邊1 cm×1 cm 的葉片（包括接種點在內(nèi)），每個時間點選取12 個接種點，每4 個接種點為一個樣本，共計3 個樣本，液氮速凍后置于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用細菌總RNA 抽提試劑盒提取D. fangzhongdaiOnc5 菌株總RNA，參照cDNA 合成試劑盒自帶試劑說明書的使用方法，對cDNA 的第一鏈進行生物合成。實時熒光定量PCR 反應體系為20 μL：TransStart? Top Green qPCR SuperMix（+Dye I） 10 μL、cDNA 1 μL、F-Primer 0.4 μL、R-Primer 0.4 μL 和Nuclease-free water 8.2 μL。反應條件為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，42 個循環(huán)；在72 ℃ 時收集熒光信號。采用2-ΔΔCt 法計算目的基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件處理試驗數(shù)據(jù)，采用Duncan 法進行樣本間差異顯著性分析，Plt;0.01表示差異顯著。每組實驗均重復3 次。使用OriginPro 8 軟件制圖表。

2 結果與分析

2.1 vfmE 基因的克隆與序列分析

如圖2 所示，在預期位置處出現(xiàn)單一條帶，且條帶清晰明亮。將該產(chǎn)物連接到pUCm-T 載體上克隆測序，經(jīng)序列比對分析，成功克隆D.fangzhongdai Onc5 vfmE 基因。對vfmE 基因序列分析后發(fā)現(xiàn)，該序列長564 bp，共編碼187 個氨基酸。通過Conserved Domain Search 對該基因的氨基酸序列進行分析，顯示其具有1 個保守結構域，該結構域位于氨基酸序列的172～426 位置，為AraC-superfamily 結構域（圖3），結果表明vfmE基因屬于AraC 轉錄激活蛋白家族成員。

與GenBank 中注冊的Dickeya 屬病原菌vfmE基因序列進行比對，結果表明，D. fangzhongdaiOnc5 vfmE 與D. dadantii 3937、D. dianthicola16JP03、D. poaceiphila NCPPB 569、D. solaniCFBP5647、D. zeae EC2、D. chrysanthemi Ech1591和D. fangzhongdai DSM 101947 菌株的同源性分別為95.74%、94.86%、91.13%、96.93%、86.88%、89.18%和98.82%。

2.2 vfmE 蛋白理化性質分析

蛋白質的理化性質是蛋白質研究的基礎。用ExPASY 的在線軟件ProtParam 預測蛋白質分子式為： C976H1528N278O280S9 ， 蛋白質分子量為21.93 kDa，理論等電點（pI）為9.01，屬于堿性蛋白質（gt;7）；不穩(wěn)定指數(shù)為59.65，屬于不穩(wěn)定蛋白（gt;40）。脂溶性指數(shù)為91.28，親水性平均系數(shù)為-0.397。氨基酸疏水性是氨基酸的一種基本性質，疏水性氨基酸位于蛋白質內(nèi)部，由于其疏水性的相互作用，故在保持蛋白質三級結構上起作用。vfmE 蛋白的氨基酸最大疏水位置為第47 位異亮氨酸，最大值為2.044，第150 位谷氨酸出現(xiàn)最小值–3.511（圖4），推測vfmE 蛋白為結構不穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.3 信號肽、跨膜區(qū)預測及亞細胞定位

TMMHM 預測結果表明，vfmE 蛋白不存在跨膜結構域，不是跨膜蛋白（圖5A）。SignaIP-5.0預測結果顯示，vfmE 蛋白不存在信號肽，不是分泌蛋白（圖5B）。D. fangzhongdai Onc5 vfmE 蛋白亞細胞定位預測結果表明，vfmE 蛋白主要分布于細胞質，周質中也有少量分布。

2.4 vfmE 蛋白高級結構預測與蛋白質互作網(wǎng)絡分析

二級結構預測結果顯示，vfmE 蛋白含有3 種二級結構，其中α-螺旋區(qū)域有109 個氨基酸，占58.29%，延伸鏈區(qū)域有2 個氨基酸，占1.07%，無規(guī)則卷曲有76 個氨基酸，占40.64%。從蛋白質整體結構來看，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是vfmE蛋白的主要結構元件，分散于整條多肽鏈（圖6A）。本研究也對D. fangzhongdai Onc5 vfmE 蛋白三級結構進行預測（圖6B），三級結構以C6CFY9.1.A （D. zeae Ech1591 菌株中AraC 家族轉錄因子）為模版進行同源建模，同源建模中要求序列相似度大于30%[14]，本研究中序列相似度為96.26%，說明結果可靠。得到的三級結構模型由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，與二級結構預測結果相同。為了揭示vfmE 基因編碼蛋白之間的關系，采用蛋白質互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫（PPIs）進行預測分析（圖6C）。結果顯示有10 個蛋白質與vfmE 蛋白互作，即AraC 家族轉錄調(diào)控蛋白（ADM96899.1）、L-鼠李糖操縱子轉錄激活蛋白（ADM99315.1）、L-鼠李糖結合蛋白（rhaR 和rhaS）、2 個含AraC 結構域的Rob 蛋白（Rightorigin-binding protein ）、2 個轉錄調(diào)控蛋白（ADN00015.1 和ADN00336.1）、與誘導劑l-阿拉伯糖互作的蛋白（araC）和DNA 結合轉錄調(diào)控因子（yqhC）。

2.5 vfmE 基因在D. fangzhongdai Onc5 中的表達分析

vfmE 在整個侵染過程中均持續(xù)高效表達，在接種的各個時間點的表達量均高于對照組。由圖7 可知，vfmE 在D. fangzhongdai Onc5 侵染文心蘭葉片和假鱗莖的過程中，其表達情況基本一致。在接種3 h 后表達量明顯上調(diào)；12 h 表達量達到最高；接種18 h 時后，表達量明顯下調(diào)且趨于穩(wěn)定?？梢姡瑅fmE 基因在侵染的不同階段均發(fā)揮著重要的作用。

3 討論

現(xiàn)有研究表明vfmE 基因與Dickeya 屬病原菌的新型群體感應系統(tǒng)的調(diào)控有關[8， 10]，但是關于vfmE 基因分子特征的研究未見報道。本研究從文心蘭D. fangzhongdai Onc5 中克隆出vfmE 基因，利用生物信息學軟件對其理化性質、功能等情況進行預測分析。結果表明，文心蘭vfmE 基因全長564 bp，共編碼187 個氨基酸，且在氨基酸水平上與Dickeya 屬其他病原菌的同源性較高，均在86%以上，說明vfmE 基因在Dickeya 屬病原菌中高度保守。在親疏水性上，vfmE 蛋白是一種親水性蛋白，且該蛋白不具有信號肽序列，為不穩(wěn)定蛋白；在結構上，vfmE 蛋白不具備跨膜區(qū)域的結構，不屬于跨膜蛋白，主要定位在細胞質，說明vfmE 蛋白主要在胞內(nèi)發(fā)揮作用。

vfmE 蛋白具有1 個保守結構域，該結構域位于氨基酸序列的172～426 位置，屬于AraC（aminoacid response and amino sugar catabolism）超家族成員。AraC 蛋白超家族廣泛存在于細菌中，參與碳代謝、應激反應，到細菌毒力和致病性的多種生命活動的的調(diào)節(jié)[17-18]。汪瑤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）J-35 株AraC家族成員aetY 基因敲除后，細菌生物被膜形成能力和對斑馬魚的致病力均下降。ZHANG 等[20]將AraC 家族成員orf02889 基因敲除后，嗜水氣單胞菌LP-2 菌株表型改變，主要表現(xiàn)為生物膜形成能力和鐵載體產(chǎn)量上升，但對斑馬魚的致病力減弱。SAHEBI 等[21] 研究表明Erwinia amylovoraEaUMG3 菌株中yqhC 基因（AraC 家族成員）能夠影響毒力因子的產(chǎn)生，如鐵載體和胞外多糖amylovoran 的產(chǎn)生，且E. amylovora EaUMG3 突變體Δ yqhC 的運動性及對梨的致病性均降低。以上研究表明，AraC 家族成員可能直接調(diào)控某些病原菌與毒力因子、生物被膜形成、運動性相關的基因的表達。本研究通過RT-qPCR 技術檢測了D. fangzhongdai Onc5 在侵染文心蘭過程中vfmE基因的差異表達。結果顯示，vfmE 基因在侵染文心蘭葉片和假鱗莖的各個階段均有表達，其中在12 h 的表達量最高，說明vfmE 基因在侵染的不同階段均發(fā)揮著重要的作用，參與了對D. fangzhongdaiOnc5 的致病調(diào)控。

本研究克隆了D. fangzhongdai Onc5 中新型群體感應系統(tǒng)vfm 中的關鍵調(diào)控基因vfmE，并進行生物信息學分析及其在侵染文心蘭葉片過程中的差異表達進行檢測，有助于進一步揭示vfmE 基因的功能及其對Dickeya 屬病原菌致病性的調(diào)控機制。

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基金項目 山西省科技廳基礎研究計劃項目（No. 20210302124516，No. 20210302124502）；山西省高?？萍紕?chuàng)新計劃項目（No.2021L462）。