摘 要：植物bHLH 轉(zhuǎn)錄因子是乙烯和茉莉酸激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，在橡膠樹膠乳產(chǎn)量形成和排膠過程中起到重要調(diào)控作用。本研究從橡膠樹熱研73397 葉片中克隆了1 個bHLH 轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為HbbHLH48（GenBank號：PQ303617），編碼區(qū)全長1128 bp，編碼375 個氨基酸。其編碼蛋白與擬南芥AtbHLH48 相似度最高屬于XVII 亞組。生物信息學(xué)分析表明，HbbHLH48 含有bHLH_SF superfamily 結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)HbbHLH48 在花、葉片和膠乳中的表達(dá)量高于根和莖中的表達(dá)量。在割膠樹中，機(jī)械傷害處理使其表達(dá)下調(diào)。茉莉酸甲酯、水楊酸和乙烯利處理后，HbbHLH48 先顯著上調(diào)表達(dá)而后下調(diào)表達(dá)，赤霉素處理的表達(dá)模式與其相反。亞細(xì)胞定位分析顯示HbbHLH48 定位在細(xì)胞核中。綜上，HbbHLH48 是植物bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，其在橡膠樹中可能參與赤霉素過程中進(jìn)而調(diào)控開花過程和膠乳合成過程，為進(jìn)一步深入研究其功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹；HbbHLH48；克?。槐磉_(dá)分析；亞細(xì)胞定位

中圖分類號：S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

天然橡膠（natural rubber）生物合成是在橡膠樹等產(chǎn)膠植物經(jīng)類異戊二烯合成路徑進(jìn)行[1-2]，其前體是由光合作用產(chǎn)物蔗糖轉(zhuǎn)化而成的異戊烯基二磷酸（IPP），經(jīng)甲羥戊酸（MVA）路徑或甲基赤蘚醇4-磷酸（MEP）路徑合成。在轉(zhuǎn)錄水平研究發(fā)現(xiàn)，天然橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因啟動子區(qū)多含有GCC-box、MYB 結(jié)合元件、傷信號WUN等多信號結(jié)合位點，其基因表達(dá)受到乙烯、茉莉酸等激素、干旱、病蟲害[3]和光照等多種信號交互調(diào)控。在橡膠樹中，已經(jīng)證明轉(zhuǎn)錄因子HbWRKY1和HbMADS4 負(fù)調(diào)控HbSRPP[4]。茉莉酸信號關(guān)鍵bHLH 轉(zhuǎn)錄因子MYC2 與SRPP1、REF3 啟動子區(qū)域結(jié)合[5]。乙烯等產(chǎn)量促進(jìn)劑上調(diào)HbSRPP基因表達(dá)但不能提高其蛋白水平[6]。HbMYC2 通過與HbFPS1 和HbSRPP1 啟動子結(jié)合調(diào)控天然橡膠生物合成[7]。在新型產(chǎn)膠植物橡膠草中也發(fā)現(xiàn)了多個SRPP 家族成員，但過表達(dá)TkSRPP3 不能顯著提高橡膠草根系天然橡膠產(chǎn)量，反之，敲除該基因則顯著降低橡膠分子量[8]。綜上，植物轉(zhuǎn)錄因子在天然橡膠生物合成中具有重要作用。

植物bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，調(diào)控植物生長發(fā)育、次生代謝和逆境響應(yīng)過程[9-10]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子因含有bHLH 結(jié)構(gòu)域而得名。bHLH 結(jié)構(gòu)域由50～60 個氨基酸組成，可分為長度為10～15 個氨基酸的堿性氨基酸區(qū)和40個氨基酸左右的α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)（HLH 區(qū)）。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子參與染色體的分離、新陳代謝調(diào)節(jié)等過程，通過二聚化與靶基因啟動子區(qū)域中順式作用元件E-box（5'-CANNTG-3'）或CACGCG 和CATGCG 特異性結(jié)合調(diào)控下游靶基因表達(dá)[11]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的133 個bHLH 基因劃分為12 個家族；隨后又有14 個新的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)一步被分為21 個家族，但是這種分類方法僅局限于高等陸生植物。隨著該家族成員在苔蘚、海藻等物種中被更多地發(fā)現(xiàn)與鑒定，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子被細(xì)分為32 個家族，每個家族具有特異性的功能。如油菜素內(nèi)酯通過調(diào)控bHLH 轉(zhuǎn)錄因子CESTA 調(diào)控赤霉素氧化酶基因GA2ox7。臘梅CpbHLH1 通過阻遏LBGs 表達(dá)抑制花青素積累[12]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子除了單獨調(diào)控下游基因表達(dá)外，還通過分子模塊和聚合體形式調(diào)控植物的次生代謝和生長發(fā)育。如bHLH-MYB 復(fù)合體在茉莉酸調(diào)控的擬南芥育性[13]和雄蕊發(fā)育[14]中發(fā)揮重要作用。3 種轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體MYB-bHLH-WDR（MNW）調(diào)控花青素合成[15]，其分為促進(jìn)[16]和抑制[17]2 種類型。這種精細(xì)調(diào)控是由于上游的信號途徑阻遏蛋白控制實現(xiàn)的[18]。如茉莉酸信號途徑的JAZ 蛋白通過阻遏MYB-bHLH 復(fù)合體抑制雄蕊發(fā)育[14]。眾多研究表明，植物中bHLH 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物次生代謝，除花青素外[19]，LibHLH7 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控百脈根中生氰糖苷的合成[20]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子SlJIG 參與萜烯合成并提高昆蟲和真菌抗性[21]。BHLH IRIDOID SYNTHESIS 3 基因調(diào)控長春花中的類萜吲哚堿的合成[22]。橡膠樹膠乳合成這一典型的次生代謝過程中亦有可能存在bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在橡膠生物合成和排膠過程中起作用。

本研究在橡膠樹熱研73397 品種葉片中克隆了1 個bHLH 轉(zhuǎn)錄因子HbbHLH48 基因，發(fā)現(xiàn)其在橡膠樹花和膠乳中高表達(dá)。分析bHLH 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)與功能將有助于研究其在天然橡膠生物合成這一典型次生代謝過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，也將為研究林木次生代謝機(jī)制創(chuàng)新提供新思路和關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州天然橡膠新種質(zhì)材料創(chuàng)新基地的熱研73379 開割樹作為材料，選取健康割膠樹的花、膠乳、葉片、莖和根組織進(jìn)行基因克隆與表達(dá)分析。機(jī)械傷害采用圖釘對割線上1 cm 處進(jìn)行傷害處理。對葉片噴施10 mmol/L 水楊酸（SA）、20 μmol/L 茉莉酸甲酯（MeJA）、0.3 μmol/乙烯利（ETH）、300 mg/L赤霉素3（GA3）進(jìn)行激素處理。對照組采用0.05%（V/V）乙醇進(jìn)行處理[23]。所有處理過的葉片、膠乳等材料按照不同時間點依次采樣，液氮冷凍后，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 HbbHLH48 基因克隆

根據(jù)橡膠樹熱研73397 基因組[24]中的HbbHLH48 序列， 利用Snapgene 軟件設(shè)計引物（表1）。以橡膠樹膠乳組織cDNA 為模板，使用Phanta Max Super- FidelityDNA Polymerase（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）高保真酶進(jìn)行基因克隆，將克隆得到的目的片段與pEASY-Blunt Zero（北京全式金生物技術(shù)有限公司）載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α 細(xì)胞中，使用Taq Master Mix 酶（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽性克隆送至擎科生物有限公司進(jìn)行測序，采用凍存甘油菌的方式將測序正確的陽性克隆于–80 ℃保存?zhèn)溆谩y序正確的序列提交至NCBIBankit（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/）數(shù)據(jù)庫獲得GenBank 編號。

1.2.2 HbbHLH48 生物信息學(xué)分析

在NCBI（ https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）數(shù)據(jù)庫中分析HbbHLH48 蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域；使用ExPASy（http：//web.expasy.org）在線軟件分析其理化特性和蛋白的三級結(jié)構(gòu)；使用Clustal W（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）與MUSCLE（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）在線軟件進(jìn)行序列比對分析；利用MEGAXI 軟件進(jìn)行多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建；使用TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）在線軟件預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。

1.2.3 HbbHLH48 基因表達(dá)分析

所有樣品材料使用天根植物多糖多分提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進(jìn)行總RNA 的提取，取1 μg總RNA 使用RevertAid RT Kit（Thermo Scientific，USA）根據(jù)試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用ChamQSYBR Color qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司） 熒光定量試劑在CFX96Touch System（Bio-Rad， USA）儀器上進(jìn)行組織特異性表達(dá)及激素處理后的表達(dá)模式分析， 以Hb18S 基因為內(nèi)參基因，引物見表1。反應(yīng)體系為：10 μL ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.4 μL 的正向引物，0.4 μL 的反向引物，1 μLcDNA 模板，8.2 μL ddH2O，共20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)；95 ℃ 15s，60 ℃ 1 min，95 ℃15 s。通過2–ΔΔCt 法計算相對表達(dá)量。

1.2.4 HbbHLH48 載體構(gòu)建

根據(jù)GFP 載體設(shè)計其與HbbHLH48 的同源重組引物（表1），以本實驗室保存的pEASY-HbbHLH48 為模板，使用重組引物進(jìn)行擴(kuò)增純化回收，同時對表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切并純化回收，將純化產(chǎn)物按照重組試劑盒進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α 細(xì)胞，在抗性平板中培養(yǎng)12 h，菌落PCR 鑒定，將測序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 細(xì)胞，構(gòu)建重組HbbHLH48-GFP 過表達(dá)載體。將得到的過表達(dá)HbbHLH48 農(nóng)桿菌菌株注射煙草表皮細(xì)胞，利用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）進(jìn)行核染色[25]，在激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國）下觀察HbbHLH48 的亞細(xì)胞定位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性差異分析選擇0.05 水平。采用Origin 2019 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbbHLH48 基因克隆

以橡膠樹熱研73379 葉片的cDNA 為模板，基因組文件中的CDS 序列設(shè)計引物，PCR 克隆得到HbbHLH48 基因（圖1A）并上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫，其GenBank 登錄號為PQ303617。HbbHLH48的CDS 長度為1128 bp，編碼375 個氨基酸，與基因組中的蛋白文件相比，氨基酸序列的相似度為99.47%（圖1B）。

2.2 HbbHLH48 生物信息學(xué)分析

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，HbbHLH48 氨基酸序列的第205～290 位氨基酸序列構(gòu)成bHLH 結(jié)構(gòu)域（圖2A）。橡膠樹bHLH 序列與其他植物的同源序列的多序列比對結(jié)果表明，bHLH 結(jié)構(gòu)域在不同植物間高度保守，僅水稻和麻風(fēng)樹的bHLH結(jié)構(gòu)域序列發(fā)生了1 個氨基酸的變異（圖2B）。HbbHLH48 理化性質(zhì)分析顯示，蛋白質(zhì)分子式為C1802H2859N527O579S11，相對分子質(zhì)量為41.52 kDa，等電點為5.86，不穩(wěn)定系數(shù)為53.36，總平均親水性為-0.639?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測和信號肽預(yù)測表明，HbbHLH48 不存在信號肽（圖3A）和無跨膜蛋白結(jié)構(gòu)（圖3B）。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，HbbHLH48位于細(xì)胞核中。HbbHLH48 三級結(jié)構(gòu)見圖3C。

不同植物中bHLH48 的同源序列系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系結(jié)果表明，橡膠樹bHLH48 與木薯的bHLH48 的序列親緣關(guān)系最近。為了進(jìn)一步解析HbbHLH48的功能，構(gòu)建了橡膠樹和擬南芥bHLH 家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，HbbHLH 可分為17 個亞家族，其中，HbbHLH48 與AtbHLH48、AtbHLH60聚為一支，屬于XVIII 亞家族（圖4）。

2.3 HbbHLH48 基因表達(dá)分析

HbbHLH48 基因的表達(dá)分析結(jié)果表明：HbbHLH48 在花中表達(dá)量最高，在葉片中的表達(dá)量次之，在莖中的表達(dá)量最低；機(jī)械傷害處理后，HbbHLH48 的表達(dá)量在0 h 時最高，機(jī)械傷害后顯著下調(diào)表達(dá)；赤霉素處理后，HbbHLH48 的表達(dá)先顯著下調(diào)后顯著上調(diào)；茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯利處理后，HbbHLH48 基因的表達(dá)趨勢相似，均是先顯著上調(diào)表達(dá)后下調(diào)表達(dá)，其表達(dá)模式與赤霉素處理后的表達(dá)模式相反（圖5）。

2.4 HbbHLH48 植物表達(dá)載體構(gòu)建和亞細(xì)胞定位

利用同源重組的方法，構(gòu)建HbbHLH48-GFP植物過表達(dá)重組載體，HbbHLH48 在GFP 標(biāo)簽的N 端（圖6A）。菌落PCR 表明HbbHLH48-GFP 植物過表達(dá)重組載體構(gòu)建成功（圖6B）。共聚焦顯微鏡下觀察可知，HbbHLH48 定位在細(xì)胞核中（圖6C），與預(yù)測的結(jié)果一致，符合轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮功能的要求。

3 討論

HbbHLH48 的保守結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)具有bHLH 家族成員的典型特性?；韭菪?環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族是一類在植物中廣泛分布且成員眾多的重要轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子以其堿性/螺旋-環(huán)-螺旋（basic/helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)域為特征，這一結(jié)構(gòu)域在植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育以及抗逆性等生物學(xué)過程中扮演著關(guān)鍵角色[26]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因編碼產(chǎn)物通常包含一個高度保守的bHLH 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由2個緊密相連的亞區(qū)組成：堿性區(qū)（b）和螺旋環(huán)螺旋區(qū)（HLH）。堿性區(qū)是DNA 結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，而HLH 區(qū)則由大約40～50 個氨基酸殘基構(gòu)成，負(fù)責(zé)介導(dǎo)同源或異源二聚化過程[11]。隨著基因測序技術(shù)和實驗技術(shù)的發(fā)展， 越來越多植物中的bHLH 家族成員被鑒定發(fā)現(xiàn)。

HbbHLH48 蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，定位于細(xì)胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核中發(fā)揮功能的特性。如bHLH 轉(zhuǎn)錄因子BEAR1 在水稻原生質(zhì)體中與細(xì)胞核標(biāo)記蛋白共定位在細(xì)胞核中發(fā)揮作用調(diào)控鹽脅迫[27]。本研究為了研究HbbHLH48的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及功能，以擬南芥bHLH 為參考，將橡膠樹bHLH 分為17 個類群。擬南芥（Arabidopsisthaliana）、白楊（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、小立碗藻（Physcomitrellapatens）和5 種藻類共638 個bHLH，系統(tǒng)發(fā)育分析將其基因劃分為32 個亞家族[28]。目前在擬南芥中鑒定出171 個bHLHs，根據(jù)提出的命名模型，將其分為17 個主要類群（I～XVII）和31 個亞家族[29]。番茄基因組中共鑒定到159 個bHLH，被劃分為21 個亞家族[30]。番茄bHLH 進(jìn)化分析表明，92%的SlbHLH 基因可能來自早期陸生植物祖先，8%的SlbHLH 基因可能來自藻類祖先[30]。玉米基因組中共鑒定出208 個bHLH 家族成員，以擬南芥為參考通過系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系將其劃分為18個亞家族[31]。在楊樹（Populus canescens）基因組中共鑒定出170 個bHLH，被劃分為22 個亞家族[32]。WANG 等[33]在橡膠樹基因組中共鑒定出180 個bHLH 基因，不均勻分布在18 條染色體上，分為23 個不同的亞家族。其中HbbHLH48 與擬南芥AtbHLH48、AtbHLH60 聚為一支，屬于XVII 類群。此外，XVII 類群還有擬南芥AtbHLH44、AtbHLH50、AtbHLH75 成員，其功能尚不清楚，而AtbHLH48 和AtbHLH60 的研究相對比較深入。研究表明，在長日照條件下，35S：HA- bHLH48 和35S：HA- bHLH60 過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株開花時間明顯提前，上調(diào)了開花基因（FT）的表達(dá)[34]。此外， bHLH48 和bHLH60 均與赤霉素受體DELLA 蛋白RGL1 互作。DNA 拉下實驗、凝膠遷移實驗（EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP）等實驗證明了bHLH48 和bHLH60 均能和PIF7的啟動子結(jié)合并促進(jìn)其表達(dá)，調(diào)控下胚軸伸長，二者功能存在冗余[35]。AabHLH48 是側(cè)金盞花（Adonis amurensis）中的一個新型bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞核中，通過結(jié)合FRUITFULL 基因的啟動子激活其表達(dá)，促進(jìn)擬南芥早開花[36]。綜上，推測HbbHLH48 與橡膠樹的RGL1 蛋白互作，參與赤霉素途徑進(jìn)而調(diào)控開花過程以及膠乳合成途徑。

HbbHLH48 基因在花中表達(dá)量最高，經(jīng)赤霉素處理后的表達(dá)水平先顯著下調(diào)后顯著上調(diào)。經(jīng)茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯利處理后，HbbHLH48的表達(dá)模式與經(jīng)赤霉素處理后的表達(dá)模式相反，先上升后下降。HbbHLH 基因的表達(dá)譜顯示出對乙烯、茉莉酸處理的不同反應(yīng)。如HbbHLH015、HbbHLH074 和HbbHLH164 在乙烯和茉莉酸處理下顯著上調(diào)[33]。茉莉酸處理下，HbbHLH163、Hbb-HLH094、HbbHLH059、HbbHLH074、HbbHLH15表達(dá)模式相似，表明這些基因可能參與了茉莉酸介導(dǎo)調(diào)控橡膠生物合成[33]。在橡膠樹中，茉莉酸和乙烯對促進(jìn)乳汁管分化和乳膠生產(chǎn)至關(guān)重要[37]。YAMAGUCHI 等[5]研究表明，Hb_MYC2-1 和Hb_MYC2-2 可能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，Hb_bHLH1 和Hb_bHLH2 可能促進(jìn)橡膠的生物合成。ZHANG 等[38]根據(jù)經(jīng)冠狀堿（COR）和割膠處理后，在形成層區(qū)和乳汁管中的表達(dá)模式，結(jié)合與其他植物中已功能鑒定的MYCs（bHLH）的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，得出HblMYC24 和HblMYC30 可能與乳管分化有關(guān)，而HblMYC6、HblMYC11、HblMYC15 以及HblMYC16、HblMYC21 可能正調(diào)控橡膠的生物合成。研究表明赤霉素可促進(jìn)bHLH48 結(jié)合開花基因（FT）啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而調(diào)控擬南芥開花過程[34]。HbbHLH48 響應(yīng)赤霉素的表達(dá)模式與茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯利的表達(dá)模式相反，推測其可能是通過調(diào)控赤霉素途徑影響開花進(jìn)而導(dǎo)致橡膠樹能量分配，最終影響天然橡膠生物合成。

本研究利用生物信息學(xué)和熒光定量PCR 技術(shù)解析了HbbHLH48 的基因結(jié)構(gòu)和在不同組織及激素處理下的表達(dá)模式。橡膠樹HbbHLH48 響應(yīng)多種激素處理，響應(yīng)赤霉素的作用機(jī)制和其他激素的響應(yīng)機(jī)制不同。此外，本研究還構(gòu)建了HbbHLH48-GFP 植物融合表達(dá)載體，利用遺傳轉(zhuǎn)化的方法證明HbbHLH48 定位在細(xì)胞核。本研究為進(jìn)一步解析HbbHLH48 參與赤霉素途徑的作用機(jī)制進(jìn)而調(diào)控開花過程以及膠乳合成途徑奠定重要基礎(chǔ)。

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基金項目 海南省自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究團(tuán)隊項目（No. 322CXTD506）； 海南省自然科學(xué)基金高層次人才項目（No. 323RC526）；熱帶作物病蟲害疫情監(jiān)測與防控項目（No. 21240116）。