摘要：探討了不同保護液配方對重組蛋白穩(wěn)定性的影響，并將其應用于化學發(fā)光檢測系統(tǒng)。通過正交實驗篩選出最佳保護液配方，包括甘油、蔗糖、BSA和吐溫20等成分。結果表明，優(yōu)化后的保護液能顯著提高重組熒光素酶的熱穩(wěn)定性和長期儲存穩(wěn)定性。將該保護液應用于化學發(fā)光免疫分析檢測人血清中甲胎蛋白（AFP），檢測靈敏度提高了2倍，線性范圍擴大到0.1～1 000.0 ng/mL。為提高重組蛋白穩(wěn)定性和改善化學發(fā)光檢測性能提供了新的思路。

關鍵詞：重組蛋白；保護液；穩(wěn)定性；化學發(fā)光；免疫分析

重組蛋白在生物醫(yī)藥、診斷試劑等領域有著廣泛應用，但其穩(wěn)定性一直是制約應用的關鍵因素之一。提高重組蛋白的穩(wěn)定性對于延長其保質期、保持活性至關重要。保護液作為一種常用的穩(wěn)定劑，其配方設計直接影響蛋白的穩(wěn)定性。本研究以重組熒光素酶為模型蛋白，系統(tǒng)研究了保護液成分對其穩(wěn)定性的影響，并將優(yōu)化后的保護液應用于化學發(fā)光免疫分析，以期為相關領域提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究所用的主要材料和試劑包括：重組熒光素酶（由本實驗室構建的大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得）、甘油、蔗糖、牛血清白蛋白、吐溫20、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、D熒光素（化學發(fā)光底物）、人甲胎蛋白（AFP）標準品、抗AFP單克隆抗體和多克隆抗體、羧基修飾磁性納米顆粒（直徑1 μm）、1乙基3（3二甲基氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰亞胺。磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）和三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（pH 8.0，由實驗室自制）。所有化學試劑均為分析純或更高純度，實驗用水為超純水系統(tǒng)制備的去離子水。

1.2儀器與設備

研究使用的主要儀器設備包括：高速離心機、紫外可見分光光度計、蛋白電泳系統(tǒng)、蛋白純化系統(tǒng)、多功能酶標儀、恒溫混勻儀、pH計、電子天平、微量離心機、旋轉蒸發(fā)儀、振蕩器、冷凍離心機、超速離心機、倒置熒光顯微鏡和納米粒度分析儀。這些儀器設備覆蓋了蛋白質表達、純化、分析和應用的全過程，確保了實驗操作的精確性和數(shù)據(jù)的可靠性。所有儀器在使用前均按照標準操作程序進行校準和質量控制，以保證實驗結果的準確性和可重復性。

1.3重組熒光素酶的表達與純化

重組熒光素酶的表達采用大腸桿菌BL21（DE3）株系，將含有目的基因的pET28a質粒轉化入菌株中［1］，挑選單菌落接種于50 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日將培養(yǎng)物按1∶100比例接種至1 L LB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至OD 600達0.6～0.8。加入IPTG至終濃度0.5 mmol誘導表達，18 ℃培養(yǎng)16 h。離心收集菌體，超聲破碎后12 000 g離心20 min分離上清液。上清液經過NiNTA親和層析柱純化，用含20 mmol咪唑的洗脫緩沖液洗滌，隨后用含250 mmol咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。收集的蛋白溶液用10 kDa截留分子量的超濾管濃縮并更換緩沖液為PBS（pH 7.4）。純化后的蛋白經SDSPAGE和Western blot鑒定，使用BCA法測定蛋白濃度。最后，將純化的重組熒光素酶分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4保護液配方優(yōu)化

采用正交實驗設計法優(yōu)化保護液配方。選取4個主要因素：甘油、蔗糖、BSA和吐溫20，每個因素設置3個水平。設計L9（3^4）正交表，共進行9組實驗。以PBS（pH 7.4）為基礎緩沖液，按照正交表配制不同組合的保護液。將純化的重組熒光素酶稀釋至0.1 mg/mL，與等體積的各組保護液混合。將混合液分裝后在37 ℃、4 ℃和-20 ℃條件下儲存，分別在0、1、7、14、30天測定酶活性。酶活性測定采用化學發(fā)光法，使用D熒光素作為底物，在多功能酶標儀上測量發(fā)光值。以酶活性保留率作為評價指標，通過方差分析確定各因素對酶活性的影響程度。根據(jù)分析結果，選擇最優(yōu)配方進行驗證實驗，并與商業(yè)保護液進行對比。最終確定的最佳保護液配方為：15%（v/v）甘油、10%（w/v）蔗糖、0.1%（w/v）BSA和0.05%（v/v）吐溫20。

1.5重組熒光素酶穩(wěn)定性評價

重組熒光素酶的穩(wěn)定性評價，主要從熱穩(wěn)定性和長期儲存穩(wěn)定性2個方面進行評估。熱穩(wěn)定性測試中，將酶液（0.1 mg/mL）分別在25 ℃、37 ℃和45 ℃恒溫水浴中孵育，每隔30 min取樣測定剩余酶活性，直至4 h。長期儲存穩(wěn)定性測試中，將酶液在4 ℃和-20 ℃條件下儲存，分別在0、7、14、30、60、90天取樣測定剩余酶活性。酶活性測定采用化學發(fā)光法，使用100 μmol D熒光素作為底物，在多功能酶標儀上測量30 s內的累積發(fā)光值［2］，以初始酶活性為100%，計算各時間點的酶活性保留率。通過繪制酶活性保留率隨時間變化的曲線，評估重組熒光素酶在不同條件下的穩(wěn)定性。

1.6化學發(fā)光免疫分析方法

采用雙抗體夾心法建立化學發(fā)光免疫分析方法。將抗AFP單克隆抗體偶聯(lián)到羧基修飾磁性納米顆粒上，取50 μL磁珠懸液，用MES緩沖液（pH 6.0）洗滌3次，加入10 μg抗體、50 μL EDC（10 mg/mL）和50 μL NHS（10 mg/mL），室溫反應2 h。反應后用PBS洗滌3次，用1% BSA封閉1 h。將偶聯(lián)好的磁珠與100 μL樣品（或標準品）混合，37 ℃孵育1 h。洗滌后加入100 μL生物素化抗AFP多克隆抗體（1 μg/mL），37 ℃孵育30 min。再次洗滌后加入100 μL重組熒光素酶親和素復合物（1∶2 000稀釋），室溫孵育15 min。最后洗滌，加入100 μL D熒光素（10 μmol），立即在多功能酶標儀上測量化學發(fā)光值。

2結果與討論

2.1保護液配方對重組熒光素酶熱穩(wěn)定性的影響

本研究考察了不同保護液配方對重組熒光素酶熱穩(wěn)定性的影響。在37 ℃條件下，添加15%甘油和10%蔗糖的保護液顯著提高了酶的熱穩(wěn)定性，4 h后仍保留80%以上的活性，而無保護液的對照組僅保留30%活性［3］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，0.1%牛血清白蛋白的加入可進一步提高熱穩(wěn)定性，使4 h后的活性保留率達到90%。這可能是由于甘油和蔗糖形成的氫鍵網絡穩(wěn)定了蛋白質的三級結構，而牛血清白蛋白則通過表面吸附減少了蛋白質分子間的相互作用，從而抑制了熱變性的發(fā)生。

2.2保護液配方對重組熒光素酶長期儲存穩(wěn)定性的影響長期儲存穩(wěn)定性研究結果表明，優(yōu)化后的保護液配方顯著延長了重組熒光素酶的儲存期限。在4 ℃條件下，添加保護液的酶液在90天后仍保持85%的初始活性，而無保護液的對照組活性降至40%。-20 ℃儲存條件下，保護液的效果更為顯著，90天后酶活性保留率高達95%。分析發(fā)現(xiàn)，0.05%吐溫-20的加入對長期儲存穩(wěn)定性有顯著貢獻，這可能是由于其減少酶分子在反復凍融過程中的聚集。此外，蔗糖可能通過形成玻璃態(tài)結構，進一步保護酶分子免受凍融損傷［4］。

2.3最佳保護液配方的確定

通過正交實驗設計和單因素優(yōu)化，最終確定了重組熒光素酶的最佳保護液配方：15%甘油、10%蔗糖、0.1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫20，以磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）為基礎。該配方在熱穩(wěn)定性和長期儲存穩(wěn)定性方面均表現(xiàn)出優(yōu)異的效果。進一步的驗證實驗表明，該保護液配方能夠使重組熒光素酶在37 ℃條件下4 h后保留90%以上的活性，在4 ℃儲存90天后保留85%以上的活性。與商業(yè)保護液相比，本研究優(yōu)化的配方在各項指標上均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，為重組熒光素酶的穩(wěn)定性保護提供了有效方案。

2.4優(yōu)化保護液在化學發(fā)光免疫分析中的應用

將優(yōu)化后的保護液應用于人甲胎蛋白（AFP）化學發(fā)光免疫分析中，顯著提高了檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。與未添加保護液的對照組相比，檢測靈敏度提高了2倍，最低檢測限達到0.1 ng/mL［5］。線性范圍擴大到0.1～1 000.0 ng/mL，相關系數(shù)R2為0.999 8。重復性實驗表明，批內變異系數(shù)（CV）小于5%，批間變異系數(shù)小于8%。加入保護液后，檢測試劑在4 ℃條件下可穩(wěn)定保存3個月，室溫下工作8 h活性無明顯下降。這些結果表明，優(yōu)化的保護液配方顯著改善了化學發(fā)光免疫分析的性能，為臨床診斷提供了更可靠的方法。

3結語

通過系統(tǒng)優(yōu)化保護液配方，成功提高重組熒光素酶的穩(wěn)定性，并將其應用于化學發(fā)光免疫分析中。研究結果表明，優(yōu)化后的保護液配方（15%甘油、10%蔗糖、0.1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫-20）顯著提高重組熒光素酶的熱穩(wěn)定性和長期儲存穩(wěn)定性。在37 ℃條件下4 h后仍保留90%以上的活性，在4 ℃儲存90天后保留85%以上的活性。將優(yōu)化后的保護液應用于人甲胎蛋白（AFP）化學發(fā)光免疫分析中，檢測靈敏度提高了2倍，最低檢測限達到0.1 ng/mL，線性范圍擴大到0.1～1 000.0 ng/mL。為提高重組蛋白穩(wěn)定性和改善化學發(fā)光免疫分析性能提供了新的思路和方法，具有重要的理論意義和應用價值。

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作者簡介：沈超，女，黑龍江哈爾濱人，研發(fā)工程師，碩士，研究方向：基因克隆重組蛋白的表達純化、蛋白質穩(wěn)定性及免疫診斷試劑。