摘要：以龍豐蘋果根際土壤為試材，采用高通量測序方法，分析3、5、8、12 年的蘋果根際土壤微生物多樣性、養(yǎng)分特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系，以期明確不同種植年限對蘋果根際土壤微生物群落特征的影響。結(jié)果表明，隨著種植年限的延長，蘋果根際土壤pH值及有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全氮含量逐漸降低，全磷、速效磷、速效鉀含量逐漸升高；種植8年后，根際土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性均降低，而真菌豐富度增加，多樣性降低；非度量多維尺度分析（NMDS）和聚類分析表明，種植12年和空地土壤的微生物群落與3、5、8 年存在顯著差異，細(xì)菌3、5 年聚類，真菌3、5、8年聚類；不同種植年限根際土壤微生物屬水平上物種的相對豐度存在顯著差異，長期連續(xù)種植后，部分有益菌和病原菌的相對豐度均降低；相關(guān)性分析表明，細(xì)菌的豐富度和多樣性與pH值及有機(jī)質(zhì)、全磷、速效磷、速效鉀等養(yǎng)分含量顯著相關(guān)，但真菌的豐富度和多樣性與養(yǎng)分含量并無顯著相關(guān)性，細(xì)菌和真菌多數(shù)屬水平物種均與pH值及有機(jī)質(zhì)、全磷、速效磷、速效鉀、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等養(yǎng)分含量存在顯著相關(guān)性。綜上，種植龍豐蘋果樹改變了土壤的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，且隨種植年限延長土壤微生物群落逐漸產(chǎn)生差異，根際土壤微生物受有機(jī)質(zhì)、全磷、速效磷、速效鉀、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等養(yǎng)分含量和pH值的影響。

關(guān)鍵詞：寒地；蘋果樹；根際土壤微生物；養(yǎng)分含量；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號：S661.106" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）03-0229-10

楊" 悅，顧廣軍，胡穎慧，等. 不同種植年限寒地蘋果根際土壤微生物多樣性及養(yǎng)分關(guān)聯(lián)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2025，53（3）：229-239.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2025.03.031

收稿日期：2024-01-12

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（編號：2022YFD1600503）；黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（編號：CZKYF2022-1-B030）；牡丹江市級科技指導(dǎo)性計劃（編號：HT2022FG021）；黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用研發(fā)項(xiàng)目（編號：2021YYYF012）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號：CARS-27）。

作者簡介：楊" 悅（1987—），女，黑龍江綏化人，碩士，助理研究員，主要從事果樹栽培與育種研究。E-mail：yangyue8764@163.com。

通信作者：顧廣軍，碩士，副研究員，主要從事蘋果、梨的栽培與育種研究。E-mail：ggj-163@163.com。

我國是世界上蘋果生產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的國家，蘋果種植面積和產(chǎn)量均居世界首位［1］。東北寒地蘋果產(chǎn)區(qū)主要種植小蘋果，龍豐蘋果是黑龍江省的主要栽培品種，栽培面積逐年增加。但是隨著種植年限的延長，土壤養(yǎng)分流失，土壤肥力下降，病蟲害風(fēng)險增加，加之果農(nóng)不合理施肥，致使蘋果園土壤質(zhì)量下降問題日趨嚴(yán)重，樹勢減弱，果樹產(chǎn)量、果品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益等受到影響。土壤質(zhì)量下降已成為當(dāng)?shù)靥O果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的嚴(yán)重障礙。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的主要組成部分。在土壤營養(yǎng)和能量的循環(huán)、交換過程中起著重要作用，對土壤肥力的維持和改善造成一定影響。土壤微生物數(shù)量及其群落結(jié)構(gòu)與功能特征直接影響土壤的生物化學(xué)活性及土壤養(yǎng)分的組成與轉(zhuǎn)化，并與植物的營養(yǎng)生長等關(guān)系極為密切。植物與根際微生物能夠相互作用，根際微生物的生長繁殖以及分布均需要植物根際分泌物提供營養(yǎng)物質(zhì)［2］；而植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)等又受到根際微生物群落變化的影響［3-4］。根際微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)在一定程度上會使土壤中的病原微生物增加，從而導(dǎo)致植物發(fā)病率增加、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變差等現(xiàn)象出現(xiàn)。

戰(zhàn)鵬對延安蘋果樹根際土壤微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)果樹產(chǎn)量和養(yǎng)分含量與土壤微生物多樣性、類群均有顯著相關(guān)性，均可作為評價果園土壤肥力的指標(biāo)［5］。陳金星對不同種植年限的蘋果園根際土壤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨種植年限延長，根際有機(jī)質(zhì)、全氮含量及pH值逐漸降低，而全鉀、全磷、堿解氮、速效磷含量則呈上升趨勢［6］。黃晶淼等采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法研究不同樹齡富士和紅星蘋果根際土壤發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌和真菌數(shù)量隨種植年限的增加而增加，而放線菌數(shù)量則降低［7］。李鵬等對不同樹齡富士蘋果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)樹齡在16～25 年期間品質(zhì)相對穩(wěn)定，25 年后明顯降低［8］。

目前的研究表明果園土壤中的微生物、酶和養(yǎng)分特征等與種植年限存在相關(guān)性，但相關(guān)研究中對于蘋果土壤微生物多樣性與種植年限之間的研究并不多，且多數(shù)都是針對大蘋果，對寒地小蘋果的研究較少，特別是黑龍江省未見相關(guān)報道。有研究表明，氣溫升高間接使得土壤溫度升高，土壤溫度變化能夠影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和微生物群落結(jié)構(gòu)［9-10］。張苗苗研究發(fā)現(xiàn)，增溫能顯著增加農(nóng)田土壤有機(jī)碳（SOC）和全氮（TN）含量，降低土壤pH值［11］；李娜等研究靈武長棗根區(qū)土壤發(fā)現(xiàn)，大氣溫度升高2 ℃土壤微生物數(shù)量、群落多樣性、活性及碳源利用率均有增加［12］；祁金洋對蓖麻根際土壤進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，增溫處理增加了變形菌門和酸桿菌門的相對豐度，降低了放線菌門、綠彎菌門和擬桿菌門的相對豐度，同時改變了Nocardioides等8個屬的相對豐度［13］。黑龍江省位于我國的東北部，是寒地小蘋果的重要產(chǎn)地之一，與大蘋果產(chǎn)區(qū)的氣候溫度差異較大。因此，研究不同種植年限黑龍江省寒地小蘋果的根際土壤微生物多樣性與環(huán)境因子相關(guān)性，可為提高蘋果樹產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)，以及制訂科學(xué)合理的施肥措施解決土壤質(zhì)量問題具有重要的參考意義。本研究以黑龍江省寧安市大唐村不同種植年限的龍豐蘋果根際土壤為試驗(yàn)材料，采用高通量測序技術(shù)，研究不同種植年限蘋果樹根際土壤微生物和環(huán)境因子的變化規(guī)律，剖析根際土壤微生物與種植年限、環(huán)境因子之間的關(guān)系，以期為了解蘋果園土壤環(huán)境、利用合理措施改善土壤質(zhì)量、促進(jìn)果樹產(chǎn)量及品質(zhì)的提升奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)地概況

蘋果樹土壤樣品采集區(qū)域位于黑龍江省寧安市大唐村（44°29′N，129°55′E，海拔348 m）。該地屬典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫4.5 ℃，年降水量500～600 mm，年均日照時數(shù)2 680 h，年均無霜期120 d。

1.2" 試驗(yàn)材料

供試土壤樣品采集于寧安市大唐村的蘋果園，種植年限分別為3、5、8、12年，分別用A、B、C、D表示，蘋果園周邊未種過蘋果的土壤作為空地土壤，用E表示。果園土壤類型為暗棕壤，主栽品種為黑龍江省國審品種龍豐，果園常規(guī)管理。

1.3" 土壤樣品采集

在栽培管理措施和立地條件基本一致的蘋果園中，選取種植年限分別為3、5、8、12年的龍豐蘋果根際土壤為研究對象，在2022年8月取樣。每個年限設(shè)置3個重復(fù)，采用5點(diǎn)采樣法，每株蘋果樹選取在樹干到樹冠投影之間距離50%的位置，從東、西、南、北4個方向采集20～40 cm深度的根際土壤，等量混合除去雜質(zhì)，裝入無菌塑料自封袋中，送至筆者所在實(shí)驗(yàn)室分別用于土壤微生物和養(yǎng)分的測定。其中，土壤微生物樣品放置于有干冰的冷藏箱中，保存于-80 ℃冰箱中待測。

1.4" 測定項(xiàng)目及方法

1.4.1" 土壤養(yǎng)分含量測定

具體測定方法參考《土壤農(nóng)化分析》［14］。有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化-容量法測定；土壤pH值采用pH計法測定；全磷含量采用鉬藍(lán)比色法測定；速效磷含量采用鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用火焰光度計法測定；全氮含量采用凱氏定氮法測定；硝態(tài)氮含量采用雙波長紫外分光光度法測定；銨態(tài)氮含量采用靛酚藍(lán)比色法測定。

1.4.2" 高通量測序技術(shù)測定土壤微生物多樣性

基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；以通用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對真菌ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物。提取、擴(kuò)增以及測序均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5" α多樣性分析

α多樣性指數(shù)參照公式進(jìn)行計算。Shannon指數(shù)計算公式如下：

HShannon=-∑Sobsi=1niNlnniN。

式中：Sobs表示實(shí)際觀測到的OTU數(shù)目；ni表示第i個OTU所含的序列數(shù)；N表示所有的序列數(shù)。

Simpson指數(shù)計算公式如下：

DSimpson=∑Sobsi=1ni（ni-1）N（N-1）。

1.6 "數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2021和SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理；使用QIIME和R語言進(jìn)行NMDS和聚類分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 不同種植年限蘋果樹根際土壤養(yǎng)分的變化

對不同種植年限蘋果園根際土壤養(yǎng)分含量進(jìn)行分析。由表1可知，有機(jī)質(zhì)含量除A處理外其他均低于E處理（空地）土壤，總體呈降低趨勢；pH值在空地土壤中顯著高于其他處理，呈降低趨勢，土壤pH值在D處理最低；與空地土壤相比較，全磷、速效磷、速效鉀含量總體呈上升趨勢；硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量在空地土壤中均最低，種植園中呈降低趨勢；全氮含量在各年限間變化不明顯，但有降低趨勢。

2.2" 不同種植年限蘋果樹根際土壤多樣性的變化

2.2.1" 稀釋曲線

為了解樣本測序結(jié)果中的物種組成信息，對所有序列在97%的相似水平下進(jìn)行OTU聚類，然后對OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋，每個分類單元即為1個OTU。由圖1可以看出，OTU數(shù)目隨著測序條數(shù)的增加而增加，曲線呈現(xiàn)逐漸上升后逐漸趨于平坦的趨勢，但尚未達(dá)到平臺期，表明各樣本細(xì)菌、真菌測序量充分，測序數(shù)量合理，結(jié)果可信，能夠反映樣本物種組成特征，但仍有少量新物種未被覆蓋。

2.2.2" α多樣性分析

土壤微生物α多樣性結(jié)果（表2）顯示，細(xì)菌覆蓋率在94.0%以上，真菌覆蓋率在99.0%以上，說明各年限的細(xì)菌和真菌物種信息基本得到了充分的體現(xiàn)。從Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)看，細(xì)菌的物種豐富度趨勢表現(xiàn)為Bgt;Agt;Egt;Cgt;D；Shannon和Simpson指數(shù)顯示，隨著種植年限的延長，細(xì)菌的物種多樣性呈現(xiàn)降低的趨勢，細(xì)菌群落物種豐富度和多樣性均表現(xiàn)為E與A、B差異不顯著，D顯著下降，表明種植蘋果8 年后根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度均降低。真菌的Chao1和ACE指數(shù)顯示，E處理的真菌物種豐富度與A、B處理差異不顯著，但有降低趨勢，C顯著降低，D又顯著升高，表現(xiàn)為Egt;Agt;Dgt;Bgt;C；Shannon和Simpson指數(shù)顯示，隨著種植年限的延長，真菌物種多樣性表現(xiàn)為先增加后降低?？梢?，種植8 年處理是細(xì)菌和真菌變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，種植年限小于8年時，隨著種植年限的延長，細(xì)菌豐富度逐漸增加，多樣性逐漸降低，然而真菌豐富度逐漸降低，多樣性逐漸增加；當(dāng)種植年限超過8 年后，隨著種植年限的延長，細(xì)菌的豐富度和多樣性降低，而真菌的豐富度增加，多樣性降低，這可能與種植年限達(dá)到8 年后蘋果根際土壤生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生變化有關(guān)。

2.2.3" 不同種植年限蘋果樹根際土壤NMDS分析

為進(jìn)一步比對樣本組之間的差異，通過非度量多維尺度分析（NMDS）對不同種植年限蘋果園根際土壤樣品進(jìn)行差異性分析。圖2中點(diǎn)分別表示各樣品，不同顏色代表不同分組，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離表示差異程度。當(dāng)應(yīng)力值（Stress）＜0.2時，表明NMDS分析具有一定的可靠性，當(dāng)應(yīng)力值（Stress）＜0.05時，則具有很好的代表性。在坐標(biāo)圖上距離越近的樣品，相似性越高。

細(xì)菌NMDS分析結(jié)果（圖2-a）顯示，C、D、E之間有明顯的分離（ANOSIM，R=0.853 3，P=0.001），A和B樣品聚在一起，具有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。真菌NMDS分析結(jié)果（圖2-b）顯示，相同種植年限土壤真菌群落聚在一起（ANOSIM，R=0.685 9，P=0.001），A、B和C樣品之間距離更近，真菌群落結(jié)構(gòu)更相似，E與D群落明顯分離?？梢姡N植蘋果樹改變了土壤的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，并且隨著種植年限的延長土壤微生物群落也逐漸產(chǎn)生差異。

2.2.4" 不同種植年限蘋果樹根際土壤樣本層級聚類分析

不同種植年限蘋果樹根際土壤樣本層級聚類分析結(jié)果（圖3）顯示，細(xì)菌將樣本聚為4個顯著不同的類群，A和B聚為一類，C、D和E分別聚集，而真菌的A、B、C在譜系中更為接近，表現(xiàn)為聚在一起，D和E分別聚集，這與NMDS分析結(jié)果一致。

2.2.5" 微生物群落在屬水平上的分布情況

為更直接地表明不同樣本組間細(xì)菌、 真菌類群的分布情況，根據(jù)所有樣品在屬水平的物種注釋及相對豐度信息，選取豐度排名前30的屬，繪制成Heatmap圖（圖4-a、圖4-b）。另外，為進(jìn)一步探究樣本間菌屬差異及變化，對細(xì)菌和真菌物種差異進(jìn)行分析（圖4-a、圖4-b），結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌群落的組分隨蘋果種植年限的變化發(fā)生明顯改變。

在細(xì)菌屬水平上，共檢測到33個屬的平均相對豐度高于1%，細(xì)菌序列分析中發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中沒有具體分類學(xué)信息的norank序列和尚未分類的unclassified序列占比較高，累計在29.9%～42.9%之間，說明土壤樣品中仍有許多無法分類的菌群，可能是一些新發(fā)現(xiàn)的土壤微生物類群，仍需要進(jìn)一步研究。由圖4-a可知，相對豐度大于5%的優(yōu)勢菌屬分別為E組Candidatus_Udaeobacter（7.0%）、norank_f_norank_o_Vicinamibacterales（5.5%）、norank_f_norank_o_norank_c_KD4-96（5.3%），A、B組norank_f_norank_o_Gaiellales（5.8%、6.6%），C、D組Candidatus_Udaeobacter（7.6%、22.0%）、norank_f_norank_o_Gaiellales（7.4%、6.0%）。已知分類的細(xì)菌屬主要有Candidatus_Udaeobacter、RB41、Gaiella、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、Candidatus_Solibacter、分支桿菌屬（Mycobacterium）、類諾卡氏屬（Nocardioides）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Bryobacter等。其中，E組土壤樣品中相對豐度低于A、B、C和D組的有RB41、Gaiella、慢生根瘤菌屬，顯著高于的有芽孢桿菌屬。D組中7個屬（假諾卡氏菌屬、Candidatus_Solibacter、類諾卡氏屬、芽單胞菌屬、Bryobacter、節(jié)桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬）的相對豐度顯著低于其他組，Candidatus_Udaeobacter顯著高于其他組。C組中Gaiella的相對豐度顯著高于其他組。A和B組相對豐度顯著高于其他組的有假諾卡氏菌屬、節(jié)桿菌屬、芽單胞菌屬、Bryobacter，A和B組之間均沒有顯著差異。在蘋果種植園中，隨種植年限的增加，Candidatus_Udaeobacter的相對豐度呈逐漸增加的趨勢，假諾卡氏菌屬、節(jié)桿菌屬、Candidatus_Solibacter、類諾卡氏屬、芽單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、Bryobacter逐漸降低，RB41、Gaiella、慢生根瘤菌屬先增加再降低，分支桿菌屬先降低再增加。

在真菌屬水平上，共檢測到54個屬的平均相對豐度高于1%，其中未分類的菌屬相對豐度在30.8%～67.3%之間，說明土壤樣品中仍有許多無法分類的菌群，仍需要進(jìn)一步研究。由圖4-b可知，前30位的屬占總數(shù)的66.1%～75.1%，相對豐度大于5%的優(yōu)勢菌屬分別為E組的山野殼菌（Paraphaeosphaeria）（26.4%）、赤霉菌屬（Gibberella）（8.2%）、新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）（6.1%），A組毛殼菌屬（Chaetomium）（20.5%）、鐮刀菌屬（Fusarium）（15.8%）、被孢霉屬（Mortierella）（9.5%）、擬康寧木霉（Trichoderma）（5.7%），B組鐮刀菌屬（15.6%）、亞隔孢殼屬（Didymella）（6.0%）、赤霉菌屬（5.5%）、被孢霉屬（5.3%），C組Tausonia（13.2%）、被孢霉屬（9.2%）、鐮刀菌屬（7.5%）、球酵母菌（Solicoccozyma）（7.3%）、雙子擔(dān)子菌屬（Geminibasidium）（6.7%），D組Tausonia（11.0%）、青霉屬（Penicillium）（9.3%）、粉枝孢屬（Oidiodendron）（9.3%）。對差異顯著的前15個屬進(jìn)行分析（圖 4-b）發(fā)現(xiàn)，E組樣品中的毛殼菌屬、球酵母菌、青霉屬、Mrakia、紫霉屬（Purpureocillium）均低于其他組，F(xiàn)usicolla高于其他組。青霉屬、黃絲曲霉屬（Talaromyces）、Mrakia、紫霉屬在D組中的相對豐度均高于其他組，亞隔孢殼屬、 裂殼屬（Schizothecium）低于其他組。在C組中相對豐度顯著高于其他組的有Tausonia、球酵母菌、Setophoma。B組中裂殼屬、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）的相對豐度均高于A、C、D、E組，毛殼菌屬在A組中顯著高于其他組，鐮刀菌屬在A和B組顯著高于其他組，被孢霉屬在D組最低。在蘋果種植園中，隨種植年限延長，鐮刀菌屬和毛殼菌屬的相對豐度逐漸降低，Mrakia、紫霉屬逐漸增加，Tausonia、球酵母菌、亞隔孢殼屬、Fusicolla、裂殼屬、莖點(diǎn)霉屬、Setophoma先升高再降低。

2.3" 根際土壤微生物與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析

選取已知分類的細(xì)菌屬和豐度排前15名的真菌屬與環(huán)境因子之間進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，得出不同環(huán)境因子對細(xì)菌和真菌屬水平群落組成的影響（圖5）。

細(xì)菌屬表現(xiàn)為Candidatus_Udaeobacter與 NO-3-N、NH+4-N、SOM含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；芽孢桿菌屬、Candidatus_Solibacter、類諾卡氏屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬與TP、AP、AK含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；芽單胞菌屬、節(jié)桿菌屬與 NO-3-N、SOM含量呈顯著正相關(guān)；芽孢桿菌屬、Candidatus_Solibacter、類諾卡氏屬、鞘氨醇單胞菌屬、Bryobacter與SOM含量、pH值呈顯著或極顯著正相關(guān)，Bryobacter與AK含量呈顯著負(fù)相關(guān)；慢生根瘤菌屬、RB41、Gaiella與NO-3-N、NH+4-N含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；假諾卡氏菌屬與NO-3-N、NH+4-N、SOM含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與TP、AK含量呈顯著負(fù)相關(guān)；分支桿菌屬與AK含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（圖5）。

真菌屬表現(xiàn)為黃絲曲霉屬、粉枝孢屬、unclassified_o_Glomerellales與環(huán)境因子無顯著相關(guān)性；短梗蠕孢屬（Trichocladium）、鐮刀菌屬、被孢霉屬、毛殼菌屬、球酵母菌與NO-3-N、NH+4-N含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；青霉屬、Mrakia與TP、AP、AK含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，青霉屬與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)，Mrakia與pH值、SOM含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；Tausonia與AP、AK含量呈極顯著正相關(guān)，與pH值、SOM含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；雙子擔(dān)子菌屬（Geminibasidium）與TP含量呈極顯著正相關(guān)；亞隔孢殼屬與AP、AK含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與pH值、SOM含量呈極顯著正相關(guān)；赤霉菌屬與TP、NH+4-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與pH值呈顯著正相關(guān)；山野殼菌與NO-3-N、NH+4-N含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（圖5）。

將細(xì)菌和真菌α多樣性指數(shù)與環(huán)境因子進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果（表3）表明，細(xì)菌的豐富度和多樣性與有機(jī)質(zhì)含量、pH值、全磷含量、速效磷含量、速效鉀含量有顯著相關(guān)性，真菌的豐富度和多樣性與各環(huán)境因子無顯著相關(guān)性。

3" 討論與結(jié)論

3.1" 不同種植年限蘋果樹根際土壤養(yǎng)分的變化

研究發(fā)現(xiàn)多年種植龍豐蘋果根際土壤pH值及有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全氮含量降低，全磷、速效磷、速效鉀含量升高。陳金星對蘋果園土壤特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨種植年限延長，土壤全氮、有機(jī)質(zhì)含量及pH值逐漸降低，全鉀、全磷、堿解氮、速效磷含量有增加的趨勢［6］，與本研究結(jié)果基本一致。李序進(jìn)研究天水花牛蘋果園土壤變化特征發(fā)現(xiàn)，土壤pH值呈增加的趨勢，但差異不顯著，土壤全氮、速效鉀、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量呈降低趨勢，土壤全磷、速效磷含量呈增加趨勢［15］。本研究結(jié)果與其不完全一致，pH值變化不同可能與土壤類型、氣候環(huán)境等多種因素存在差異有關(guān)，土壤速效鉀含量變化差異，可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)毓麍@施用鉀肥量較大。

本研究有機(jī)質(zhì)和氮元素含量降低，可能與果園對有機(jī)質(zhì)和氮的需求量較大且有機(jī)肥和氮肥的投入不足有關(guān)。磷和鉀含量升高，與果農(nóng)長時間過量使用含磷鉀的化肥有關(guān)。土壤pH值降低是因?yàn)楦捣置诘乃犷愇镔|(zhì)積累以及果園長期施用化肥，且氮肥春季集中大量施用，幾乎不施用農(nóng)家肥和微生物肥所致。相關(guān)性分析結(jié)果表明，細(xì)菌豐富度和多樣性與SOM含量、pH值、TP含量、AP含量、AK含量有顯著性相關(guān)，但真菌的豐富度和多樣性與養(yǎng)分含量并沒有顯著相關(guān)性。另外，細(xì)菌和真菌屬水平物種均受到養(yǎng)分含量的影響，但不同的細(xì)菌和真菌屬受影響程度不同，多數(shù)屬均與SOM含量、pH值、TP含量、AP含量、AK含量、NO-3-N含量、NH+4-N含量存在顯著相關(guān)性。這可能與土壤環(huán)境中其他因素的影響有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步的研究探討。因此推測，土壤養(yǎng)分含量變化是細(xì)菌和真菌群落變化的重要原因之一，也是導(dǎo)致細(xì)菌豐富度和多樣性變化的重要原因。

3.2" 不同種植年限蘋果樹根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

α多樣性結(jié)果表明，種植龍豐蘋果8 年后細(xì)菌群落多樣性和豐富度均降低，可能由于果園長期使用化肥和農(nóng)藥，土壤中某些細(xì)菌受到抑制，其他種類細(xì)菌受到刺激大量生長繁殖所致［16］。真菌的多樣性結(jié)果表明，長期種植龍豐蘋果，土壤中的真菌豐富度增加，多樣性降低，可能因?yàn)殚L時間種植一種作物致使土壤中的有害真菌數(shù)量增加，但種類減少。

本研究NMDS和聚類分析結(jié)果顯示，D、E組中的群落與A、B和C組中的群落存在顯著差異，細(xì)菌的A和B組聚類，真菌的A、B和C組群落距離更近，表明種植蘋果樹改變了土壤的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，并且隨著種植年限延長土壤微生物群落也逐漸產(chǎn)生差異。這與葉雯等的研究結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)，不同種植年限香榧根際土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)存在較大改變［17］。

在本研究中，不同種植年限顯著影響細(xì)菌和真菌群落，對于細(xì)菌，在蘋果種植園中，假諾卡氏菌屬、節(jié)桿菌屬、Candidatus_Solibacter、類諾卡氏屬、芽單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、Bryobacter均隨種植年限增加而逐漸降低。假諾卡氏菌屬隸屬于放線菌門，目前研究表明，該屬主要與纖維素降解、抗生素合成等有關(guān)，是一類稀有放線菌，參與植物生理活動的某些酶類和維生素的產(chǎn)生過程［18］。節(jié)桿菌屬具有聚磷性、降解重金屬、降解有機(jī)農(nóng)藥、固氮和降解苯胺等功效［19］。類諾卡氏屬也是放線菌的一類，該屬分布廣，種類多，可用于降解原油、污水治理等，有報道表明，類諾卡氏屬菌株C190廣泛存在于土壤中，能分解代謝一系列甲硫代三嗪除草劑，用于生物防護(hù)，目前尚未報道該屬有致病菌株，是一類較安全的有益微生物［20-21］。鞘氨醇單胞菌耐受貧營養(yǎng)，能將土壤中的有毒物質(zhì)降解后被植物吸收利用，也能夠調(diào)控植物抗病性和生物信息交流等，起到保護(hù)植物生長的作用［22-23］。芽單胞菌屬具有解磷作用，其相對豐度降低可能與土壤中磷含量升高有關(guān)，該屬具有降低土壤中的重金屬和抗生素污染的功能，可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性［24-26］。慢生根瘤菌屬是根瘤菌的一種，具有固氮作用，植物通過與根瘤菌的共生固氮獲得氮素［27］。本研究中慢生根瘤菌在空地土壤中相對豐度最小，且隨蘋果種植年限的延長相對豐度呈先增加再降低的趨勢，說明長時間種植蘋果會使蘋果根系固氮能力降低。以上菌屬均為有益菌，在本研究中12 年的相對豐度均低于3、5、8 年，因此，在蘋果長期連續(xù)種植后，根際有益細(xì)菌的減少可能導(dǎo)致土壤環(huán)境變化。

在真菌屬水平上，毛殼菌能降解纖維素和有機(jī)質(zhì)，也能夠抑制多種病原菌的生長，是一種具有生物防治效果的有益真菌，連續(xù)種植龍豐蘋果后毛殼菌相對豐度逐漸降低［28-29］。鐮刀菌屬是引起植物病害的重要植物病原菌之一，廣泛存在于土壤中，可造成植物萎焉、根腐等病害，其相對豐度也隨種植年限的增加而降低［16］。據(jù)報道，葡萄連作后，鐮刀菌屬的相對豐度隨著連作時間的延長而降低，而毛殼菌等有益菌相對豐度也降低［29］，與本研究結(jié)果相一致。有研究表明，植物可以通過募集保護(hù)性微生物來抑制植物病原體。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)種植大豆13 年后，慢生根瘤菌、芽單胞菌和被孢霉菌等有益菌的相對豐度增加，而病原真菌鐮刀菌的相對豐度與連作3年或5年相比長期連作后有所下降［30］，這與本研究的結(jié)果不完全一致。芽孢桿菌屬是一種被廣泛研究的屬，Karthika等從番茄根際土壤中分離出1株蠟樣芽孢桿菌（KTMA4），該菌株對病原菌尖孢鐮刀菌具有有效的抑制作用，而且還產(chǎn)生了吲哚-3-乙酸等促生長因子，以促進(jìn)離體植物生長［31］。本研究結(jié)果中短期種植的有益菌（慢生根瘤菌屬、芽單胞菌屬、被孢霉菌屬等）和病原菌（鐮刀菌屬等）的相對豐度均較長期種植高，推測可能是短期種植情況下，植物聚集的某些有益菌與病原菌之間進(jìn)行競爭所致，而這些有益菌對病原菌的抑制作用可能是導(dǎo)致長期種植病原菌豐度降低的原因之一。

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