摘要:為明確生防木霉菌T43不同施加次數(shù)對玉米莖腐病的防治效果及對土壤中莖腐病菌(Fusarium graminearum)數(shù)量的影響,將濃度為2.5×105 CFU/mL的禾谷鐮孢菌孢子懸浮液施加到滅菌土壤中,1周后種植玉米種子,同時,分別向各盆栽土壤施加濃度為2.5×105 CFU/mL的木霉菌T43孢子懸浮液1~2次,2次施加時間的間隔為1周。每隔1周進行病情統(tǒng)計,計算盆栽玉米植株的病情指數(shù)和玉米莖腐病的防效,并采用稀釋涂布法對土壤中木霉菌T43和玉米莖腐病菌的數(shù)量變化進行比較與分析。結果表明,第9周時木霉菌T43處理2次的盆栽玉米莖腐病的病情指數(shù)為19.44,對莖腐病的防效達到72.00%;在0~9周內(nèi),玉米生防木霉菌T43的數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中,單獨施加莖腐病菌的對照組數(shù)量在第7周達到峰值,為1.83×108 CFU/g;木霉菌T43施加2次后,土壤中的木霉菌數(shù)量也在第7周達到峰值,為1.50×108 CFU/g。與對照組相比,木霉菌T43處理2次的防治效果最好,第7周時玉米莖腐病菌的數(shù)量僅有4.33×107 CFU/g,相較于病原菌對照減少了76.34%。綜上,木霉菌T43可有效地防治盆栽玉米莖腐病的發(fā)生,且能夠抑制盆栽土壤中莖腐病菌的繁殖。
關鍵詞:生防木霉菌;玉米;莖腐??;病菌數(shù)量;生防效果
中圖分類號:S182;S435.131.4+9" 文獻標志碼:A
文章編號:1002-1302(2025)03-0128-05
邱新月,魏甜甜,許" 蓉,等. 生防木霉菌T43對玉米莖腐病及土壤中莖腐病菌數(shù)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2025,53(3):128-133.
doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2025.03.017
收稿日期:2024-03-07
基金項目:山西省基礎研究計劃(編號:202203021211270);山西省重點研發(fā)計劃(編號:201903D211001-1)。
作者簡介:邱新月(1996—),女,河北滄州人,碩士研究生,從事植物病害與生物防治研究。E-mail:2624380002@qq.com。
通信作者:姚艷平,博士,副教授,從事植物病害與生物防治研究。E-mail:ypyao2002@163.com。
玉米莖腐病是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的土傳病害,能夠導致玉米出現(xiàn)倒伏、枯死、果穗下垂,甚至是植株死亡[1],一般使玉米減產(chǎn)10%~25%,嚴重時可達70%以上,已成為玉米生產(chǎn)上亟需解決的問題[2]。目前,玉米莖腐病的防治主要依靠抗病品種和化學防治,但由于玉米品種的多樣性及差異性,導致針對性的品種抗病很難實現(xiàn);而化學農(nóng)藥的長期施用易導致病原菌抗藥性的產(chǎn)生,以及農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和土壤微生物種群減少等一系列問題[3]。因此尋求一種安全高效、對環(huán)境友好的防治策略是目前玉米莖腐病防控中的首要任務。
木霉菌(Trichoderma spp.)具有良好的環(huán)境適應能力,能夠在自然界中廣泛存活,生長速度快和多重生防機制使其在植物病害防治中具有良好的優(yōu)勢[4-5]。木霉菌可通過競爭、抗生作用、寄生作用來抑制病原菌的生長,可防治由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、多種鐮孢菌(Fusarium spp.)等病原菌引起的植物病害[6]。佟昀錚發(fā)現(xiàn),哈茨木霉(T. harzianum)CCTH-2具有較強的重寄生作用,可纏繞病原菌菌絲,抑菌效果達到了82.83%[7]。耿肖兵研究發(fā)現(xiàn),生防菌木霉菌48SJ7-1對玉米莖腐病防效達到了68.47%[8]。除此之外,木霉菌還可以改善土壤微生態(tài),促進植物生長。曹健研究表明,淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)B10-1和綠色木霉(T. viride)B1-1可提高真菌的豐富度和多樣性,降低土壤中細菌菌群結構的多樣性和豐富度,降低尖鐮孢菌(F. oxysporum)的含量[9]。Samolski等發(fā)現(xiàn),哈茨木霉可提高黃瓜植株根毛的數(shù)量和長度,增加根系表面積[10]。同時其他研究也表明,木霉菌在水稻根系定殖后可有效增長水稻根系、增強玉米植株根毛發(fā)育、增加根系生物量、使玉米根系生長增強等[11-13]。
本試驗以生防木霉菌T43為對象,研究木霉菌T43對玉米莖腐病的防治效果,并分析木霉菌T43對土壤中玉米莖腐病菌(F. graminearum)數(shù)量變化的影響,探討生防木霉菌T43的生防機制,為玉米莖腐病的生物防治提供理論依據(jù)。
1" 材料與方法
1.1" 試驗材料
1.1.1" 供試材料
供試菌株:玉米莖腐病菌為禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum,縮寫為FG);生防菌為綠色木霉(Trichoderma viride)T43,均由山西農(nóng)業(yè)大學植物病理重點實驗室提供。
供試玉米品種:玉米莖腐病感病品種,太育919。
1.1.2" 供試培養(yǎng)基
玉米培養(yǎng)基:參照周闖的方法[14]加以改進,將玉米浸泡在自來水中3 d,稱取 100 g 放入菌袋,并加入10 mL的1.5%葡萄糖溶液,于高壓滅菌鍋中121 ℃ 滅菌20 min。
綠豆培養(yǎng)基MB和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA參照劉焱琨的方法[15]進行制備。
1.2" 試驗方法
1.2.1" 玉米莖腐病菌FG孢子懸浮液的配制
將純化后的FG接入MB培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后,采用血球計數(shù)板在顯微鏡下測定孢子濃度,配制成 2.5×105 CFU/mL的孢子懸浮液。
1.2.2" 綠色木霉T43孢子懸浮液配制
采用宿暢等的方法,并加以改進[16]。將活化后的綠色木霉T43接種于玉米培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d。用少量蒸餾水將培養(yǎng)基中的木霉T43分生孢子沖洗下來,單層紗布過濾后,采用血球計數(shù)板在顯微鏡下測定孢子濃度,將孢子濃度調(diào)整為2.5×105 CFU/mL。
1.2.3" 盆栽試驗
試驗于2021年8月中旬至10月上旬在山西農(nóng)業(yè)大學植物保護學院農(nóng)作站完成。
1.2.3.1" 土壤滅菌
8月中旬開始準備工作,首先采集多年玉米連作的田間土壤,將土壤于烘箱中進行150 ℃、3 h干熱滅菌,加入無菌水使土壤充分吸收后放置2 d[17]。
1.2.3.2 ""種子消毒
挑選大小均勻飽滿的成熟玉米種子,清水沖洗后用10% NaClO溶液消毒 5 min,采用無菌水清洗3遍后再浸泡20 min[18]。
1.2.3.3" 盆栽處理
利用無菌噴壺將60 mL玉米莖腐病菌FG孢子懸浮液均勻施加在盆栽土壤中。7 d后,每盆種植5粒消毒后的玉米種子。同時向各處理花盆中分別施加60 mL木霉菌T43的孢子懸浮液1次(T1)、2次(T2),施加間隔時間為7 d。以單獨施加木霉菌孢子懸浮液為木霉菌處理的對照(CK1、CK2),間隔時間為7 d;以單獨施加FG孢子懸浮液為玉米莖腐病菌FG處理的對照(CK3),以無菌水處理作為空白對照(CK0)。
1.2.3.4" 病情調(diào)查與統(tǒng)計
施加病原菌后的第2周時開始進行玉米植株取樣。將玉米根系完整的取出,進行玉米莖腐病的病情統(tǒng)計,計算病害防效。病情分級標準參考程星凱的方法[19]。
1.2.3.5" 數(shù)量檢測
盆栽土壤施加玉米莖腐病菌FG后,每隔1周采集玉米植株根系土壤2 g,每盆取3次,混勻風干過篩(20目)[20]。從中稱取1 g土樣放入裝有玻璃珠的錐形瓶中,再加入10 mL無菌生理鹽水在搖床中培養(yǎng)30 min,之后進行10倍梯度稀釋,取10-5、10-6、10-7進行涂布,28 ℃暗培養(yǎng) 3~5 d,進行木霉菌T43和玉米莖腐病菌FG的數(shù)量統(tǒng)計[21]。
土壤真菌數(shù)量根據(jù)以下公式計算[22]:
土壤真菌數(shù)量(CFU/g)=單菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)土壤重量。
根據(jù)以下公式計算病原菌的抑制率[23]:
抑制率=T0-T1T0×100%。
式中:T0為處理前的菌落數(shù)量;T1為處理后的菌落數(shù)量。
1.2.4" 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2016進行統(tǒng)計,利用Origin 2019b 32Bit進行作圖。
2" 結果與分析
2.1" 木霉菌T43對玉米莖腐病的防治效果
由圖1-a可知,土壤中單獨施加玉米莖腐病菌FG(CK3)后,前3周玉米莖腐病未發(fā)生,其病情指數(shù)為0;第4周時玉米植株開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀,病情指數(shù)為13.89,隨著時間的延續(xù)莖腐病病情逐漸嚴重,第9周時玉米植株的病情指數(shù)高達69.44。施加1次木霉菌T43(T1)進行防治后,玉米植株同樣在第4周開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀但病情指數(shù)僅為8.33,之后隨著時間的延長,在第9周時發(fā)病最為嚴重,病情指數(shù)為41.67。施加2次(T2)木霉菌T43的玉米植株在第5周開始發(fā)病,第9周時發(fā)病情況最為嚴重,病情指數(shù)為19.44。
由圖1-b可知,前3周所有處理中玉米植株不發(fā)病;第4周木霉菌T43處理1次對玉米莖腐病的防治效果為40.00%,第7周時防效最高,達68.75%,后又逐漸下降,第9周時降至40.00%。木霉菌T43處理2次對玉米莖腐病的防治效果最好,其防效呈現(xiàn)先下降后上升最后下降的趨勢,第5周時該處理玉米植株開始發(fā)病,防效為85.71%,之后在第6周時防效到達第2次高峰,達90.91%,之后逐漸下降,第9周時防效為72.00%,但仍高于其他處理。說明木霉菌處理次數(shù)不同,對玉米莖腐病的防效不同,但均表現(xiàn)出較好的病害防治作用。
2.2" 盆栽土壤中玉米莖腐病菌FG的數(shù)量變化
由圖2可知,土壤中施加玉米莖腐病菌FG后,其數(shù)量變化呈現(xiàn)先上升后下降再次上升至最高點后迅速下降的趨勢。病原菌FG數(shù)量從第1周開始逐漸上升,至第3周到達第1個高峰,數(shù)量達 4.33×107 CFU/g,之后逐漸下降;從第4周開始,玉米莖腐病菌FG數(shù)量又再次上升,并于第7周時至最高峰,數(shù)量達1.83×108 CFU/g,然后又迅速下降。雖然在測定時間段內(nèi)病原菌的數(shù)量變化有所浮動,但玉米莖腐病菌FG的數(shù)量總體表現(xiàn)為上升趨勢,說明土壤中施加玉米莖腐病菌FG后,其可在土壤中長期存活并逐漸繁殖。
2.3" 盆栽土壤中綠色木霉T43的數(shù)量變化
由圖3可知,不同施加次數(shù)的木霉菌數(shù)量在土壤中均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。CK1與CK2處理在第7周到達菌落數(shù)量高峰,分別為 9.33×107 CFU/g 和1.50×108 CFU/g,隨后1周CK1和CK2的木霉數(shù)量均開始逐漸下降,且CK2處理后的木霉數(shù)量仍高于CK1。木霉菌T43在土壤中的數(shù)量變化說明木霉菌可在土壤中長期存活并大量繁殖,且繁殖規(guī)律與木霉菌的施加次數(shù)和施加量
密切相關。
2.4" 木霉菌T43對土壤中玉米莖腐病菌FG數(shù)量的影響
盆栽土壤中先后施加玉米莖腐病菌FG和木霉菌T43后,由圖4可知,與僅施加玉米莖腐病菌FG的CK3相比,木霉菌處理后土壤中的玉米莖腐病菌FG數(shù)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,其中T2的處理效果最優(yōu),與CK3具有明顯差異。在第7周時,處理T2中的玉米莖腐病菌FG數(shù)量最少,僅為 4.33×107 CFU/g,相較于CK3降低了76.34%;處理T1中的玉米莖腐病菌FG數(shù)量也僅為 9.67×107 CFU/g,相較于CK3降低了47.16%。試驗處理的前3周,因土壤中木霉菌T43數(shù)量有限,對玉米莖腐病菌FG的抑制效果并不明顯,但從第4周開始不同施加次數(shù)的木霉菌處理的效果開始出現(xiàn)差異,施加2次木霉菌T43孢子懸浮液的T2處理的抑制效果最優(yōu)。原因可能是木霉菌經(jīng)過前3周的繁殖種群數(shù)量達到一定程度并順利完成了在土壤中的定殖,所以后期對玉米莖腐病菌FG的抑制效果越來越明顯。
2.5" 玉米莖腐病菌FG對木霉菌T43數(shù)量的影響
由圖5可知,無論土壤中是否存在病原菌FG,木霉菌T43的數(shù)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;但土壤中存在病原菌FG時,木霉菌T43的數(shù)量遠遠低于只施加木霉菌T43的對照CK1和CK2。尤其在第7周時差異最為明顯,此時對照CK1的木霉菌T43數(shù)量為9.33×107 CFU/g,而T1則為7.67×107 CFU/g,木霉菌數(shù)量減少了17.79%;對照CK2中木霉菌T43數(shù)量為1.57×108 CFU/g,而T2則為 1.17×108 CFU/g,相較于CK2木霉菌數(shù)量降低了25.48%。由此可知,土壤中的病原菌FG與木霉菌T43會存在空間競爭和營養(yǎng)競爭等關系,進而影響到木霉菌T43在土壤中的繁殖數(shù)量和定殖,導致出現(xiàn)土壤中木霉菌數(shù)量降低的現(xiàn)象。
3" 討論
本研究探究了生防木霉菌T43對玉米莖腐病的防治效果及其對土壤中莖腐病菌數(shù)量的影響,研究結果表明,土壤中施加2次木霉菌T43后,木霉菌數(shù)量在第7周可達到數(shù)量高峰,為1.50×108 CFU/g,對土壤中玉米莖腐病菌FG數(shù)量的抑制率達76.34%;在第6周對玉米莖腐病的防效達第2次高峰,為90.91%,之后逐漸下降,第9周時防效為72.00%,說明木霉菌可在土壤中存活并繁殖,雖然后期數(shù)量下降但并不會影響其對玉米莖腐病的防治作用,木霉菌T43可有效抑制土壤中玉米莖腐病菌FG的數(shù)量,有效地防治玉米莖腐病的發(fā)生,土壤中木霉菌T43的數(shù)量和抑菌效果均與木霉菌T43的接種量和施加次數(shù)密切相關。
玉米莖腐病菌FG作為土傳病害的一種,其在土壤中的數(shù)量關系到玉米莖腐病的發(fā)生情況,所以對土壤中玉米莖腐病菌FG的數(shù)量研究具有十分重要的意義[24]。本研究發(fā)現(xiàn),單獨施加玉米莖腐病菌FG時,玉米莖腐病菌FG的數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降再上升至最高點后迅速下降的趨勢,出現(xiàn)此變化的原因可能是由于玉米莖腐病菌FG施加入土壤后,其在土壤中緩慢適應環(huán)境條件,并逐漸開始大量繁殖,因此玉米莖腐病菌FG的數(shù)量逐漸上升;之后可能是由于玉米莖腐病菌FG開始侵染玉米根系,誘導玉米根系產(chǎn)生一些活性抗性物質(zhì),如玉米根系分泌的苯并噻唑類化合物對孢子釋放、游動、休止孢萌發(fā)和菌絲的生長都有抑制作用[25],所以導致土壤中玉米莖腐病菌FG數(shù)量逐漸下降;又或玉米植株同時通過抗性調(diào)控途徑中的某些基因正調(diào)控玉米莖腐病的抗性[26],使玉米植株自身抗病性增強,因而影響到玉米莖腐病菌FG的繁殖速度和總體數(shù)量;但由于玉米自身抗病機制的作用比較有限,無法從根本上控制玉米莖腐病菌FG的繁殖,導致后期玉米莖腐病菌FG的數(shù)量重新開始上升。
木霉菌是土壤中最常見的真菌之一,也是一種優(yōu)良的生防微生物,對多種真菌性土傳病害具有明顯的生防效果,其生防潛力與其定殖能力息息相關[27-28]。本試驗通過稀釋涂布平板法分析了土壤中木霉菌T43的數(shù)量變化,發(fā)現(xiàn)木霉菌T43呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,這與隋麗娜等關于木霉菌數(shù)量變化的研究結果[5,29]相似,說明木霉菌T43可以在土壤中長期存活與定殖。施加2次木霉菌T43后,對玉米莖腐病菌FG起到抑制作用,第7周時玉米莖腐病菌FG數(shù)量降低了76.34%,第9周時對玉米莖腐病防效達72.00%。本研究與隋麗娜等的研究結果[5,30]類似,均體現(xiàn)了木霉菌對玉米莖腐病良好的防治效果。
關于土壤中玉米莖腐病菌FG定量研究的方法較多,有稀釋涂布平板法、實時熒光定量PCR技術和環(huán)介導等溫擴增技術等[31-33]。實時熒光定量PCR技術具有特異性強、敏感性高、重復性好等優(yōu)點[34]。但該技術要求相關的酶必須能夠耐受高溫,且引物具有高度專一性,否則容易產(chǎn)生引物二聚體,對試驗結果造成影響[35]。環(huán)介導等溫擴增技術引物設計要求限制了靶位點的選擇,限制了程序的分辨率或特異性,其次,該技術最終產(chǎn)物是一個大片段,無法進行克隆或通過PCR技術進行其他生物學試驗[36]。而稀釋涂布平板法具有成本低、能檢測出活菌數(shù)的優(yōu)勢,更能真實地反映土壤樣品的狀況;而且試驗方法操作簡便、具有較強的重復性,無論土壤樣品中菌數(shù)高或低都適用[37-38],因此,本研究采用稀釋涂布平板法初步測定土壤中菌落數(shù)量,用以初步分析綠色木霉T43及玉米莖腐病菌FG在盆栽土壤中的數(shù)量變化。
4 "結論
本試驗研究了生防木霉菌T43對玉米莖腐病的防治效果及其對土壤中莖腐病菌數(shù)量的影響,研究結果表明,土壤中施加2次木霉菌T43后,木霉菌數(shù)量在第7周可達數(shù)量高峰,為1.50×108 CFU/g,對土壤中玉米莖腐病菌FG數(shù)量的抑制率達76.34%;在第6周對玉米莖腐病的防治效果達第2次高峰,為90.91%,之后逐漸下降,第9周時防效為72.00%。說明木霉菌可在土壤中存活并繁殖,可有效抑制土壤中玉米莖腐病菌FG的數(shù)量,且木霉菌T43可有效防治玉米莖腐病的發(fā)生,同時土壤中木霉菌T43的數(shù)量和防治效果均與木霉菌T43的接種量和施加次數(shù)密切相關。
因此,木霉菌T43具有良好的生防開發(fā)前景,未來應對該菌株防治玉米莖腐病的生防機制進行深入的研究與探討,為木霉菌T43充分發(fā)揮其生防功能提供科學依據(jù),為我國玉米產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)綠色發(fā)展奠定理論基礎。
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