摘要：蘭州鲇（Silurus lanzhouensis）是黃河中上游特有土著魚(yú)類(lèi)，其自然種群數(shù)量稀少，已被列入《中國(guó)物種紅色名錄》。為了解蘭州鲇皮膚和脾2個(gè)重要免疫器官在免疫過(guò)程中發(fā)揮的不同功能，本研究以野生蘭州鲇作為研究對(duì)象，對(duì)其皮膚和脾進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果表明，蘭州鲇的皮膚和脾中共有6 627個(gè)差異表達(dá)基因（DEG）。KEGG富集分析結(jié)果表明，共有59個(gè)DEG富集到Toll樣受體信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路等11個(gè)免疫相關(guān)通路中。這表明蘭州鲇的皮膚與脾的免疫功能有較大差異。通過(guò)DEG分析，還發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素3（galectin-3）及脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子（LITAF）2個(gè)先天免疫相關(guān)基因發(fā)生了顯著的差異性表達(dá)。組織表達(dá)模式分析結(jié)果表明，galectin-3是蘭州鲇皮膚高表達(dá)基因，而LITAF基因在6個(gè)組織中均有表達(dá)，顯示出galectin-3主要在蘭州鲇皮膚屏障的先天免疫中發(fā)揮著重要的免疫防御作用，而LITAF則廣泛參與蘭州鲇機(jī)體的免疫防御。通過(guò)多序列比對(duì)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，Galectin-3與LITAF的氨基酸序列在硬骨魚(yú)中是保守的。

關(guān)鍵詞：蘭州鲇；皮膚；脾；轉(zhuǎn)錄組；galectin-3；LITAF；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：S917" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）03-0023-12

朱子琳，李鋒剛，張亞萌，等. 蘭州鲇皮膚與脾轉(zhuǎn)錄組比較及Galectin-3與LITAF基因分子特征分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2025，53（3）：23-34.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2025.03.004

收稿日期：2024-02-29

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部財(cái)政專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：HHDC-2022-0302）。

作者簡(jiǎn)介：朱子琳（2000—），女，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源研究與應(yīng)用。E-mail：zhuzil01@163.com。

通信作者：周繼術(shù)，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究，E-mail：zhoujishu@163.com；楊元昊，碩士，正高級(jí)工程師，主要從事瀕危魚(yú)類(lèi)保護(hù)與水產(chǎn)品質(zhì)量安全，E-mail：yuanhao_y@126.com。

皮膚被認(rèn)為是魚(yú)類(lèi)的黏膜組織［1］，是硬骨魚(yú)類(lèi)重要的外周免疫器官［2-3］，也是魚(yú)類(lèi)抵御不良外界環(huán)境的第一道防線(xiàn)［4］。脾是硬骨魚(yú)類(lèi)的淋巴結(jié)樣器官［5］，具有造血和免疫雙重功能［6］，其主要通過(guò)免疫淋巴細(xì)胞、補(bǔ)體和免疫球蛋白等發(fā)揮免疫功能［7］，在清除入侵病原體和啟動(dòng)特異性免疫反應(yīng)中起不可替代的作用［5］。半乳糖凝集素是一類(lèi)進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)，在脊椎動(dòng)物中廣泛存在［8］，目前也在多種無(wú)鱗硬骨魚(yú)皮膚黏液中分離獲得［9-11］。Galectin-3是半乳糖凝集素的一種，可以作為細(xì)胞的模式識(shí)別受體（PRR）［12］，參與針對(duì)入侵病原體的免疫反應(yīng)，還可以激活或調(diào)節(jié)先天免疫細(xì)胞［13］，參與中性粒細(xì)胞向炎癥部位的遷移及病原體的清除過(guò)程［14-15］。脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子-α（LITAF），在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物組織廣泛存在［16-18］，在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的作用［19］。研究認(rèn)為，LITAF可通過(guò)MyD88信號(hào)通路參與促炎反應(yīng)，作為炎癥細(xì)胞因子TNF-α的轉(zhuǎn)錄激活劑［20］，上調(diào)TNF-α的表達(dá)從而可刺激免疫細(xì)胞表達(dá)IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子，進(jìn)一步發(fā)揮促炎反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死［21-22］。

蘭州鲇（Silurus lanzhouensis）別稱(chēng)黃河鲇，屬鲇形目（Siluriformes）鲇科（Siluridea）鲇屬（Silurus）［23］。目前，蘭州鲇自然種群主要分布于黃河的甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古和陜西等中上游河段［24-25］，在黃河生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要的生態(tài)地位，被譽(yù)為“黃河生物名片”［26］。近年來(lái)，受棲息地破壞、環(huán)境污染和過(guò)度捕撈等因素的影響［27］，蘭州鲇種群數(shù)量急劇減少，已被《中國(guó)物種紅色名錄》列為瀕危（EN）物種［28］。

前期研究表明，蘭州鲇種群數(shù)量銳減可能與其免疫功能有關(guān)，其中的血清白球比低和免疫與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因家族產(chǎn)生收縮可能反映了蘭州鲇較低的免疫應(yīng)答能力，然而相關(guān)機(jī)制尚未完全明了［27-29］。為此，本研究采用Illumina聚合酶合成測(cè)序方法對(duì)蘭州鲇皮膚和脾進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)差異表達(dá)基因鑒定及功能富集分析，比較該免疫器官的免疫功能差異，同時(shí)，對(duì)蘭州鲇差異表達(dá)基因galectin-3與LITAF的組織表達(dá)模式進(jìn)行分析，并對(duì)該基因所編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為深入研究蘭州鲇皮膚和脾的免疫機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 樣品采集

蘭州鲇3尾，均捕自黃河中部的陜西合陽(yáng)段（110°18′～110°24′E，35°6′～35°12′N(xiāo)），平均體重（603.33±94.24） g/尾，捕撈活動(dòng)符合《中國(guó)野生水生動(dòng)物保護(hù)法》的規(guī)定，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)批準(zhǔn)，用于科學(xué)研究。

使用1 g/L的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）將蘭州鲇麻醉后稱(chēng)重，于冰盤(pán)上解剖，分別取其皮膚和脾組織各2～3 g，于液氮中快速凍存?zhèn)溆?，另剖取魚(yú)體皮膚、脾、肝、腎、心、鰓組織各2～3 g，快速凍存于液氮中，再將各組織轉(zhuǎn)入-80 ℃凍箱保存?zhèn)溆谩２蓸雍蛿?shù)據(jù)檢測(cè)工作于2023年7—9月在陜西省水產(chǎn)研究所及西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2" Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序

使用Trizol試劑［天根生化科技（北京）有限公司］提取樣品的總RNA并用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE）檢測(cè)其濃度和純度，再用RNA Nano 6000（Agilent Bioanalyzer 2100，Agilent Technologies，CA，USA）評(píng)估其完整性，最后構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序工作由北京百邁客生物科技有限公司在Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)中完成。

1.3" 轉(zhuǎn)錄組從頭組裝

編寫(xiě)Perl腳本以刪除轉(zhuǎn)錄組中堿基質(zhì)量lt;20的低質(zhì)量序列，再采用Trinity軟件對(duì)高質(zhì)量的數(shù)據(jù)（reads）進(jìn)行組裝［30］，除K-mer值外，采用默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建唯一的一致性序列。

1.4" 基因功能注釋與分類(lèi)

使用BLAST軟件［31］，將Unigene序列與NR［32］、Swiss-Prot［33］、GO［34］、COG［35］、KOG［36］、KEGG［37］等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，使用HMMER軟件［38］，將預(yù)測(cè)完Unigene的氨基酸序列與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)［39］進(jìn)行比對(duì)，獲得Unigene的注釋信息。

1.5" 差異表達(dá)基因鑒定

采用FPKM值作為reads值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值輸出矩陣［40］，從而計(jì)算出蘭州鲇皮膚與脾的差異表達(dá)基因（DEG）中每個(gè)基因的表達(dá)水平。采用DESeq對(duì)蘭州鲇皮膚與脾DEG進(jìn)行差異表達(dá)分析［41］。用Benjamini-Hochberg方法對(duì)原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的顯著性P值（P-value）進(jìn)行校正，校正后的P值即FDR，最終取FDRlt;0.05且FPKM≥2的基因作為差異表達(dá)基因。

1.6" 蘭州鲇免疫功能基因的篩選及galectin-3與LITAF的表達(dá)模式分析

通過(guò)對(duì)蘭州鲇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，從DEG中篩選出galectin-3與LITAF等2個(gè)免疫相關(guān)基因，隨后進(jìn)行該基因的表達(dá)模式分析。首先提取皮膚、脾、肝、腎、心和鰓6個(gè)組織的總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將其分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參，再利用CFX96 real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，德國(guó)）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。該檢測(cè)的總反應(yīng)體系為10.0 μL，其中cDNA模板1.0 μL，qPCR熒光染料（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）5.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。該檢測(cè)的反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)（95 ℃ 5 s），60 ℃ 30 s，最后在60～95 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，并進(jìn)行引物擴(kuò)增效率分析。每個(gè)基因重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量［42］。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件對(duì)檢測(cè)的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析并作圖，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。引物（表1）采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)。

1.7" 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

用公共數(shù)據(jù)庫(kù)與在線(xiàn)軟件（表2）分析Galectin-3和LITAF的理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位、蛋白質(zhì)信號(hào)肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征及互作蛋白。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)組裝

由表3可知，通過(guò)對(duì)蘭州鲇皮膚與脾的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別共獲得7.49 Gb與8.25 Gb的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，其GC含量為48.38%～50.48%，其Q30堿基百分比均≥91.97%，顯示出試驗(yàn)結(jié)果可靠性較高。由圖1可知，組裝后共得到219 912個(gè)Unigene，平均長(zhǎng)度564 bp，而該Unigene的N50長(zhǎng)度為746 bp，表明轉(zhuǎn)錄組的組裝完整性較高，組裝效果較好。將每個(gè)樣本的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)與Trinity軟件組裝獲得的Unigene庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，用于后續(xù)的分析。

2.2" 蘭州鲇皮膚與脾Unigene功能注釋

由表4可知，本研究中注釋到的總基因數(shù)有 37 905個(gè)，注釋率為17.24%。在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋成功的Unigene的數(shù)量最多，占14.73%，在Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG、GO及COG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋成功的Unigene比例分別為11.46%、9.49%、7.87%、7.26%、6.99%及5.19%。

用NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蘭州鲇皮膚與脾Unigene的序列相似性分析，由圖2-A可知，共有32 367個(gè)Unigene與已知序列相似，其中相似序列占比最高的前5個(gè)物種分別是墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus）、斑馬魚(yú)（Danio rerio）、麥奇鉤吻鮭（Oncorhynchus mykiss）、斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus）和白斑狗魚(yú)（Esox lucius），占比分別為41.34%、18.57%、6.49%、3.70%和2.45%。

由圖2-B可知，蘭州鲇皮膚與脾共有15 382個(gè)Unigene注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的78 788個(gè)條目中，這些條目又被分配到59個(gè)節(jié)點(diǎn)中，該節(jié)點(diǎn)分別歸屬于生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類(lèi)別。其中，有223個(gè)條目注釋到免疫系統(tǒng)過(guò)程節(jié)點(diǎn)中，參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，該條目的占比為1.45%。

由圖2-C可知，對(duì)Unigene進(jìn)行COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)灿?5 017個(gè)Unigene注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)的25個(gè)類(lèi)別中，其中有144個(gè)注釋到免疫防御類(lèi)別中，與機(jī)體的免疫防御密切相關(guān)。

2.3" 差異表達(dá)基因與KEGG信號(hào)通路富集分析

由圖3可知，蘭州鲇皮膚與脾組織的DEG有 6 627 個(gè)，其中，上調(diào)表達(dá)基因3 748個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因2 879個(gè)。由圖4-A可知，皮膚與脾DEG主要富集于KEGG代謝通路的細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類(lèi)疾病、代謝、有機(jī)系統(tǒng)六大類(lèi)一級(jí)功能，其中，主要富集于三級(jí)代謝通路的分別為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、黏著、緊密連接、內(nèi)吞作用及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用。

對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)一步分類(lèi)，由圖4-B可知，DEG顯著富集到Toll樣受體信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路、IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、NOD樣受體信號(hào)通路和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等11個(gè)免疫相關(guān)信號(hào)通路中。

2.4" 蘭州鲇galectin-3和LITAF組織表達(dá)模式分析

組織表達(dá)模式分析，由圖5可知，galectin-3在皮膚中的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01），LITAF在肝臟和皮膚中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于脾、腎、心臟和鰓組織（Plt;0.05），在脾、腎、心臟和鰓等組織間無(wú)顯著差異（P≥0.05）。

2.5" Galectin-3和LITAF蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

2.5.1" Galectin-3和LITAF蛋白理化性質(zhì)分析

由表5可知，Galectin-3分子式為 C1 153H1 740N312O325S6，氨基酸數(shù)目為228個(gè)，相對(duì)分子量25.36 ku，脂肪系數(shù)為68.46，理論等電點(diǎn)為6.08，不穩(wěn)定系數(shù)為42.12，是一種不穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)。LITAF分子式為C723H1 126N188O203S14，氨基酸數(shù)目為144個(gè)，相對(duì)分子量16.15 ku，脂肪系數(shù)為75.62，理論等電點(diǎn)為8.68，不穩(wěn)定系數(shù)為46.00，是一種不穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)。Galectin-3與LITAF蛋白的平均疏水指數(shù)分別為-0.514、-0.063，表明兩者均為親水性蛋白質(zhì)。

2.5.2" Galectin-3與LITAF的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖6可知，與哺乳類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、硬骨魚(yú)類(lèi)等物種構(gòu)建的Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，蘭州鲇Galectin-3與瓦氏黃顙魚(yú)（Tachysurus vachellii）、多鱗白甲魚(yú)（Onychostoma macrolepis）和露

斯塔野鯪（Labeo rohita）聚為一個(gè)類(lèi)群，比對(duì)到的人類(lèi)（Homo sapiens）、鱉（Pelodiscus sinensis）、胎生蜥蜴（Zootoca vivipara）等其他物種的Galectin-3蛋白序列則形成另外的分支。同樣，蘭州鲇的LITAF首先與南方大口鲇（Silurus meridionalis）聚類(lèi)，其次是黑鯽（Carassius carassius），比對(duì)到的家牛（Bos taurus）、大棕蝠（Eptesicus fuscus）、長(zhǎng)爪沙鼠（Meriones unguiculatus）等其他物種的LITAF蛋白序列則形成另外的分支，表明蘭州鲇的Galectin-3和LITAF在硬骨魚(yú)中具有進(jìn)化保守性。

2.5.3" Galectin-3與LITAF的亞細(xì)胞定位、蛋白信號(hào)肽及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

亞細(xì)胞定位分析，由圖7可知，Galectin-3蛋白在細(xì)胞內(nèi)外無(wú)跨膜區(qū)域，不屬于跨膜蛋白（圖7-A）； 而LITAF蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)域，可能屬于跨膜蛋白（圖7-B中紫色區(qū)域）。蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Galectin-3與LITAF蛋白所有氨基酸的Sec/SPI和CS概率為0，OTHER概率為1，表明Galectin-3和LITAF蛋白不具有信號(hào)肽，可能為非分泌蛋白（圖7-C、圖7-D）。結(jié)構(gòu)域功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Galectin-3含有碳水化合物識(shí)別域（CRD），而LITAF蛋白具有典型的末端C-XX-C鋅指結(jié)構(gòu)保守區(qū)域（圖7-E、圖7-F）。

2.5.4" Galectin-3與LITAF蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與互作蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

由圖8可知，Galectin-3蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲分別占8.77%、21.93%、7.02%和62.28%（圖8-A），LITAF蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲分別占18.06%、20.83%、2.78%和58.33%（圖8-B），顯示出無(wú)規(guī)則卷曲是Galectin-3蛋白和LITAF蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

對(duì)Galectin-3與LITAF蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，由圖8-C、圖8-D可知，Galectin-3與LITAF蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式均為無(wú)規(guī)則卷曲，本結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，表明模擬構(gòu)建的 Galectin-3 和LITAF蛋白三維結(jié)構(gòu)合理。

互作蛋白網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，Galectin-3蛋白（lgals3）與SLC40A1、GEMIN4、LAMP1、CD44和PTPRC蛋白相互作用（圖8-E）；LITAF蛋白（LOC108278842）與LIN9、LIN52、LIN54、RBBP4、CENPT、DUT等9個(gè)蛋白相互作用（圖8-F）。蛋白與蛋白之間相互作用的平均可信度均gt;70%。

3" 討論

蘭州鲇轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量分析與Unigene功能注釋結(jié)果顯示，蘭州鲇在公共基因數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)參考基因組，顯示出本研究結(jié)果的創(chuàng)新性，然而也增加了對(duì)蘭州鲇Unigene編碼功能預(yù)測(cè)的難度。本研究使用BLASTX算法并結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)組裝后的Unigene序列進(jìn)行注釋?zhuān)罱K得到注釋基因數(shù)為 37 905 個(gè)，注釋率為17.24%，還有82.76%的序列未被注釋。與NR蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)結(jié)果顯示，蘭州鲇皮膚與脾基因中有14.73%的 Unigene與已知基因同源，遠(yuǎn)低于黃尾鲴（Xenocypris davidi）的49.59%和克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）的28.35%［43-44］。在注釋成功的基因中，有41.34%的基因與墨西哥脂鯉的基因序列相似性最高，其次

是與斑馬魚(yú)的基因序列，占比為18.57%。這種較低的注釋率及其與鯉科魚(yú)類(lèi)而非鲇科魚(yú)類(lèi)的基因同源性最高的結(jié)果，可能與蘭州鲇及其相近物種（如鲇科魚(yú)類(lèi)）的基因注釋信息在公共基因數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄較少有關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明蘭州鲇基因數(shù)據(jù)庫(kù)亟需豐富。此外，由于未被成功注釋的序列中可能包含非編碼RNA或無(wú)功能結(jié)構(gòu)域序列［45］，它們作為潛在功能序列，也有可能參與到蘭州鲇的生物學(xué)過(guò)程中，將隨著蘭州鲇等鲇科魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的豐富而得以進(jìn)一步研究。

本研究篩選出了galectin-3等差異表達(dá)的基因。據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-3是作為PRR參與機(jī)體對(duì)各類(lèi)病原體防御的先天免疫反應(yīng)蛋白，該蛋白通過(guò)與大腸桿菌脂多糖（LPS）的結(jié)合而寡聚化，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)中性粒細(xì)胞的促炎活性［46］。有研究表明，該蛋白還參與巨噬細(xì)胞對(duì)β-1，2-寡甘露聚糖（存在于念珠菌屬中）的識(shí)別，幫助巨噬細(xì)胞有效區(qū)分致病性（念珠菌屬）和非致病性（酵母菌屬）酵母，從而更高效吞噬致病念珠菌［47］。Zhou等在對(duì)斑點(diǎn)叉尾研究中發(fā)現(xiàn)galectin-3在皮膚組織中的高表達(dá)，并認(rèn)為其在斑點(diǎn)叉尾黏膜免疫中起著至關(guān)重要的作用［48］。在尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）中，檢測(cè)到galectin-3在皮膚等組織中高表達(dá)，且嗜水氣單胞菌感染后在免疫相關(guān)組織中上調(diào)表達(dá)，表明galectin-3可能在細(xì)菌攻擊后的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用［49］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，galectin-3在蘭州鲇皮膚組織中高表達(dá)，這與上述研究結(jié)果一致，表明galectin-3在蘭州鲇皮膚免疫中發(fā)揮著特定的免疫防御作用。

為了確立galectin-3基因在各物種之間的親緣關(guān)系，本研究將蘭州鲇Galectin-3蛋白序列與其他物種進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白的氨基酸序列在硬骨魚(yú)類(lèi)的進(jìn)化過(guò)程中是保守的，表明硬骨魚(yú)中的Galectin-3蛋白擁有共同的祖先，且具有相同或類(lèi)似的生物學(xué)功能。結(jié)構(gòu)域功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，蘭州鲇Galectin-3具有典型的碳水化合物識(shí)別域（CRD），表明其可與β-半乳糖苷結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)糖蛋白、細(xì)胞表面分子和細(xì)胞外基質(zhì)中均發(fā)揮著重要作用［50］。蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果顯示，有CD44等5種蛋白與Galectin-3 進(jìn)行相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中的 Galectin-3 能夠上調(diào)CD44這種細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附作用［51］，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移［52-53］，進(jìn)一步研究蘭州鲇機(jī)體內(nèi)類(lèi)似的免疫蛋白，對(duì)蘭州鲇免疫器官與免疫功能的研究具有重要意義。

本研究也篩選出了LITAF等差異表達(dá)的基因。研究發(fā)現(xiàn)，LITAF在不同動(dòng)物間的表達(dá)模式各有不同。在人體中，該基因主要在脾、淋巴結(jié)和外周血白細(xì)胞中高表達(dá)［54］，在斑馬魚(yú)中該基因在其鰓中高表達(dá)［16］。研究還發(fā)現(xiàn)，該基因的同系物RbLITAF1基因在條石鯛（Oplegnathus fasciatus）脾和心組織中高表達(dá)，而同系物RbLITAF2在條石鯛的鰓、腸和胃中高表達(dá)［18］。本研究結(jié)果顯示，LITAF在蘭州鲇的6個(gè)組織中均有表達(dá)，且在肝臟和皮膚中高表達(dá)（圖5）。肝臟作為魚(yú)體的重要器官，參與解毒、營(yíng)養(yǎng)代謝、生物合成、消化、免疫、凝血等重要過(guò)程［55-56］，而皮膚是蘭州鲇等無(wú)鱗魚(yú)類(lèi)抵御病原菌等不良刺激的第一道防線(xiàn)［2，57］，因此，LITAF基因在蘭州鲇肝臟與皮膚中的高表達(dá)顯示出該基因高度參與了該組織器官的免疫防御。

LITAF蛋白的序列相似性分析結(jié)果表明，該蛋白序列在硬骨魚(yú)中是保守的。該蛋白結(jié)構(gòu)域功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，蘭州鲇LITAF蛋白具有典型的末端C-XX-C鋅指結(jié)構(gòu)保守區(qū)域，這與該蛋白在石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）及太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）中的預(yù)測(cè)結(jié)果［58-59］相一致。蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果顯示，蘭州鲇LITAF可與著絲粒蛋白T（CENPT）等9種蛋白質(zhì)形成復(fù)雜的相互作用，CENPT是一種參與細(xì)胞有絲分裂的著絲粒相關(guān)蛋白，在有絲分裂過(guò)程中形成動(dòng)粒，調(diào)控細(xì)胞分裂［60-61］。有研究表明，當(dāng)機(jī)體受到LPS刺激后脾組織中LITAF表達(dá)水平快速上調(diào)［58，62］，從而參與機(jī)體的促炎反應(yīng)。由此可見(jiàn)，LITAF作為調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α的關(guān)鍵因子，在調(diào)控炎癥與細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著復(fù)雜且重要的作用。

4" 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)蘭州鲇皮膚和脾組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，獲得了大量皮膚和脾轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)基因。對(duì)galectin-3與LITAF的組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，galectin-3主要在皮膚組織中表達(dá)，LITAF在各個(gè)組織均有表達(dá)且主要在皮膚和肝臟中高表達(dá)，證明二者在蘭州鲇中可能行使其相應(yīng)的免疫功能。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Galectin-3與LITAF的氨基酸序列在硬骨魚(yú)中均是保守的。本研究結(jié)果可以為完善蘭州鲇轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)、發(fā)掘蘭州鲇免疫功能基因及其免疫研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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