摘要：蘭州鲇（Silurus lanzhouensis）是黃河中上游特有土著魚類，其自然種群數(shù)量稀少，已被列入《中國物種紅色名錄》。為了解蘭州鲇皮膚和脾2個重要免疫器官在免疫過程中發(fā)揮的不同功能，本研究以野生蘭州鲇作為研究對象，對其皮膚和脾進行轉錄組測序分析。結果表明，蘭州鲇的皮膚和脾中共有6 627個差異表達基因（DEG）。KEGG富集分析結果表明，共有59個DEG富集到Toll樣受體信號通路、RIG-I樣受體信號通路等11個免疫相關通路中。這表明蘭州鲇的皮膚與脾的免疫功能有較大差異。通過DEG分析，還發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素3（galectin-3）及脂多糖誘導的腫瘤壞死因子（LITAF）2個先天免疫相關基因發(fā)生了顯著的差異性表達。組織表達模式分析結果表明，galectin-3是蘭州鲇皮膚高表達基因，而LITAF基因在6個組織中均有表達，顯示出galectin-3主要在蘭州鲇皮膚屏障的先天免疫中發(fā)揮著重要的免疫防御作用，而LITAF則廣泛參與蘭州鲇機體的免疫防御。通過多序列比對及蛋白質結構預測可知，Galectin-3與LITAF的氨基酸序列在硬骨魚中是保守的。

關鍵詞：蘭州鲇；皮膚；脾；轉錄組；galectin-3；LITAF；蛋白質結構及功能預測

中圖分類號：S917" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）03-0023-12

朱子琳，李鋒剛，張亞萌，等. 蘭州鲇皮膚與脾轉錄組比較及Galectin-3與LITAF基因分子特征分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2025，53（3）：23-34.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2025.03.004

收稿日期：2024-02-29

基金項目：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部財政專項（編號：HHDC-2022-0302）。

作者簡介：朱子琳（2000—），女，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事魚類種質資源研究與應用。E-mail：zhuzil01@163.com。

通信作者：周繼術，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料科學研究，E-mail：zhoujishu@163.com；楊元昊，碩士，正高級工程師，主要從事瀕危魚類保護與水產(chǎn)品質量安全，E-mail：yuanhao_y@126.com。

皮膚被認為是魚類的黏膜組織［1］，是硬骨魚類重要的外周免疫器官［2-3］，也是魚類抵御不良外界環(huán)境的第一道防線［4］。脾是硬骨魚類的淋巴結樣器官［5］，具有造血和免疫雙重功能［6］，其主要通過免疫淋巴細胞、補體和免疫球蛋白等發(fā)揮免疫功能［7］，在清除入侵病原體和啟動特異性免疫反應中起不可替代的作用［5］。半乳糖凝集素是一類進化保守的蛋白質，在脊椎動物中廣泛存在［8］，目前也在多種無鱗硬骨魚皮膚黏液中分離獲得［9-11］。Galectin-3是半乳糖凝集素的一種，可以作為細胞的模式識別受體（PRR）［12］，參與針對入侵病原體的免疫反應，還可以激活或調節(jié)先天免疫細胞［13］，參與中性粒細胞向炎癥部位的遷移及病原體的清除過程［14-15］。脂多糖誘導的腫瘤壞死因子-α（LITAF），在脊椎動物和無脊椎動物組織廣泛存在［16-18］，在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的作用［19］。研究認為，LITAF可通過MyD88信號通路參與促炎反應，作為炎癥細胞因子TNF-α的轉錄激活劑［20］，上調TNF-α的表達從而可刺激免疫細胞表達IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子，進一步發(fā)揮促炎反應，誘導細胞凋亡或壞死［21-22］。

蘭州鲇（Silurus lanzhouensis）別稱黃河鲇，屬鲇形目（Siluriformes）鲇科（Siluridea）鲇屬（Silurus）［23］。目前，蘭州鲇自然種群主要分布于黃河的甘肅、寧夏、內蒙古和陜西等中上游河段［24-25］，在黃河生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要的生態(tài)地位，被譽為“黃河生物名片”［26］。近年來，受棲息地破壞、環(huán)境污染和過度捕撈等因素的影響［27］，蘭州鲇種群數(shù)量急劇減少，已被《中國物種紅色名錄》列為瀕危（EN）物種［28］。

前期研究表明，蘭州鲇種群數(shù)量銳減可能與其免疫功能有關，其中的血清白球比低和免疫與應激反應相關的基因家族產(chǎn)生收縮可能反映了蘭州鲇較低的免疫應答能力，然而相關機制尚未完全明了［27-29］。為此，本研究采用Illumina聚合酶合成測序方法對蘭州鲇皮膚和脾進行轉錄組測序，通過差異表達基因鑒定及功能富集分析，比較該免疫器官的免疫功能差異，同時，對蘭州鲇差異表達基因galectin-3與LITAF的組織表達模式進行分析，并對該基因所編碼的蛋白質的結構和功能進行預測，以期為深入研究蘭州鲇皮膚和脾的免疫機制提供基礎數(shù)據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 樣品采集

蘭州鲇3尾，均捕自黃河中部的陜西合陽段（110°18′～110°24′E，35°6′～35°12′N），平均體重（603.33±94.24） g/尾，捕撈活動符合《中國野生水生動物保護法》的規(guī)定，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學批準，用于科學研究。

使用1 g/L的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）將蘭州鲇麻醉后稱重，于冰盤上解剖，分別取其皮膚和脾組織各2～3 g，于液氮中快速凍存?zhèn)溆?，另剖取魚體皮膚、脾、肝、腎、心、鰓組織各2～3 g，快速凍存于液氮中，再將各組織轉入-80 ℃凍箱保存?zhèn)溆?。采樣和?shù)據(jù)檢測工作于2023年7—9月在陜西省水產(chǎn)研究所及西北農(nóng)林科技大學動物科技學院水產(chǎn)科學系實驗室完成。

1.2" Illumina HiSeq 2500高通量測序

使用Trizol試劑［天根生化科技（北京）有限公司］提取樣品的總RNA并用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE）檢測其濃度和純度，再用RNA Nano 6000（Agilent Bioanalyzer 2100，Agilent Technologies，CA，USA）評估其完整性，最后構建測序文庫。測序工作由北京百邁客生物科技有限公司在Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺中完成。

1.3" 轉錄組從頭組裝

編寫Perl腳本以刪除轉錄組中堿基質量lt;20的低質量序列，再采用Trinity軟件對高質量的數(shù)據(jù)（reads）進行組裝［30］，除K-mer值外，采用默認設置，構建唯一的一致性序列。

1.4" 基因功能注釋與分類

使用BLAST軟件［31］，將Unigene序列與NR［32］、Swiss-Prot［33］、GO［34］、COG［35］、KOG［36］、KEGG［37］等數(shù)據(jù)庫進行比對，使用HMMER軟件［38］，將預測完Unigene的氨基酸序列與Pfam數(shù)據(jù)庫［39］進行比對，獲得Unigene的注釋信息。

1.5" 差異表達基因鑒定

采用FPKM值作為reads值的標準化數(shù)值輸出矩陣［40］，從而計算出蘭州鲇皮膚與脾的差異表達基因（DEG）中每個基因的表達水平。采用DESeq對蘭州鲇皮膚與脾DEG進行差異表達分析［41］。用Benjamini-Hochberg方法對原有假設檢驗得到的顯著性P值（P-value）進行校正，校正后的P值即FDR，最終取FDRlt;0.05且FPKM≥2的基因作為差異表達基因。

1.6" 蘭州鲇免疫功能基因的篩選及galectin-3與LITAF的表達模式分析

通過對蘭州鲇轉錄組數(shù)據(jù)的分析，從DEG中篩選出galectin-3與LITAF等2個免疫相關基因，隨后進行該基因的表達模式分析。首先提取皮膚、脾、肝、腎、心和鰓6個組織的總RNA，再用逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將其分別反轉錄為cDNA。以β-actin為內參，再利用CFX96 real-time PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，德國）進行實時熒光定量PCR檢測。該檢測的總反應體系為10.0 μL，其中cDNA模板1.0 μL，qPCR熒光染料（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）5.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。該檢測的反應條件為：95 ℃ 2 min，40個循環(huán)（95 ℃ 5 s），60 ℃ 30 s，最后在60～95 ℃范圍內進行熔解曲線分析，并進行引物擴增效率分析。每個基因重復3次，采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量［42］。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件對檢測的數(shù)據(jù)結果進行單因素方差分析并作圖，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。引物（表1）采用Primer Premier 5軟件設計。

1.7" 蛋白質結構和功能預測

用公共數(shù)據(jù)庫與在線軟件（表2）分析Galectin-3和LITAF的理化性質、系統(tǒng)發(fā)育樹、亞細胞結構定位、蛋白質信號肽、蛋白質結構域、蛋白質結構特征及互作蛋白。

2" 結果與分析

2.1" 測序結果與數(shù)據(jù)組裝

由表3可知，通過對蘭州鲇皮膚與脾的轉錄組測序，分別共獲得7.49 Gb與8.25 Gb的質控數(shù)據(jù)，其GC含量為48.38%～50.48%，其Q30堿基百分比均≥91.97%，顯示出試驗結果可靠性較高。由圖1可知，組裝后共得到219 912個Unigene，平均長度564 bp，而該Unigene的N50長度為746 bp，表明轉錄組的組裝完整性較高，組裝效果較好。將每個樣本的質控數(shù)據(jù)與Trinity軟件組裝獲得的Unigene庫進行序列比對，用于后續(xù)的分析。

2.2" 蘭州鲇皮膚與脾Unigene功能注釋

由表4可知，本研究中注釋到的總基因數(shù)有 37 905個，注釋率為17.24%。在NR數(shù)據(jù)庫中注釋成功的Unigene的數(shù)量最多，占14.73%，在Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG、GO及COG數(shù)據(jù)庫中注釋成功的Unigene比例分別為11.46%、9.49%、7.87%、7.26%、6.99%及5.19%。

用NR數(shù)據(jù)庫進行蘭州鲇皮膚與脾Unigene的序列相似性分析，由圖2-A可知，共有32 367個Unigene與已知序列相似，其中相似序列占比最高的前5個物種分別是墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus）、斑馬魚（Danio rerio）、麥奇鉤吻鮭（Oncorhynchus mykiss）、斑點叉尾（Ictalurus punctatus）和白斑狗魚（Esox lucius），占比分別為41.34%、18.57%、6.49%、3.70%和2.45%。

由圖2-B可知，蘭州鲇皮膚與脾共有15 382個Unigene注釋到GO數(shù)據(jù)庫的78 788個條目中，這些條目又被分配到59個節(jié)點中，該節(jié)點分別歸屬于生物過程、細胞組分和分子功能三大類別。其中，有223個條目注釋到免疫系統(tǒng)過程節(jié)點中，參與免疫應答反應，該條目的占比為1.45%。

由圖2-C可知，對Unigene進行COG數(shù)據(jù)庫注釋，共有15 017個Unigene注釋到COG數(shù)據(jù)庫的25個類別中，其中有144個注釋到免疫防御類別中，與機體的免疫防御密切相關。

2.3" 差異表達基因與KEGG信號通路富集分析

由圖3可知，蘭州鲇皮膚與脾組織的DEG有 6 627 個，其中，上調表達基因3 748個，下調表達基因2 879個。由圖4-A可知，皮膚與脾DEG主要富集于KEGG代謝通路的細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝、有機系統(tǒng)六大類一級功能，其中，主要富集于三級代謝通路的分別為肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、黏著、緊密連接、內吞作用及細胞因子-細胞因子受體相互作用。

對免疫系統(tǒng)進一步分類，由圖4-B可知，DEG顯著富集到Toll樣受體信號通路、RIG-I樣受體信號通路、IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡、NOD樣受體信號通路和白細胞跨內皮遷移等11個免疫相關信號通路中。

2.4" 蘭州鲇galectin-3和LITAF組織表達模式分析

組織表達模式分析，由圖5可知，galectin-3在皮膚中的相對表達量極顯著升高（Plt;0.01），LITAF在肝臟和皮膚中的相對表達量顯著高于脾、腎、心臟和鰓組織（Plt;0.05），在脾、腎、心臟和鰓等組織間無顯著差異（P≥0.05）。

2.5" Galectin-3和LITAF蛋白結構與功能預測

2.5.1" Galectin-3和LITAF蛋白理化性質分析

由表5可知，Galectin-3分子式為 C1 153H1 740N312O325S6，氨基酸數(shù)目為228個，相對分子量25.36 ku，脂肪系數(shù)為68.46，理論等電點為6.08，不穩(wěn)定系數(shù)為42.12，是一種不穩(wěn)定的酸性蛋白質。LITAF分子式為C723H1 126N188O203S14，氨基酸數(shù)目為144個，相對分子量16.15 ku，脂肪系數(shù)為75.62，理論等電點為8.68，不穩(wěn)定系數(shù)為46.00，是一種不穩(wěn)定的堿性蛋白質。Galectin-3與LITAF蛋白的平均疏水指數(shù)分別為-0.514、-0.063，表明兩者均為親水性蛋白質。

2.5.2" Galectin-3與LITAF的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖6可知，與哺乳類、爬行類、兩棲類、硬骨魚類等物種構建的Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹表明，蘭州鲇Galectin-3與瓦氏黃顙魚（Tachysurus vachellii）、多鱗白甲魚（Onychostoma macrolepis）和露

斯塔野鯪（Labeo rohita）聚為一個類群，比對到的人類（Homo sapiens）、鱉（Pelodiscus sinensis）、胎生蜥蜴（Zootoca vivipara）等其他物種的Galectin-3蛋白序列則形成另外的分支。同樣，蘭州鲇的LITAF首先與南方大口鲇（Silurus meridionalis）聚類，其次是黑鯽（Carassius carassius），比對到的家牛（Bos taurus）、大棕蝠（Eptesicus fuscus）、長爪沙鼠（Meriones unguiculatus）等其他物種的LITAF蛋白序列則形成另外的分支，表明蘭州鲇的Galectin-3和LITAF在硬骨魚中具有進化保守性。

2.5.3" Galectin-3與LITAF的亞細胞定位、蛋白信號肽及結構域預測

亞細胞定位分析，由圖7可知，Galectin-3蛋白在細胞內外無跨膜區(qū)域，不屬于跨膜蛋白（圖7-A）； 而LITAF蛋白存在跨膜結構域，可能屬于跨膜蛋白（圖7-B中紫色區(qū)域）。蛋白信號肽預測結果顯示，Galectin-3與LITAF蛋白所有氨基酸的Sec/SPI和CS概率為0，OTHER概率為1，表明Galectin-3和LITAF蛋白不具有信號肽，可能為非分泌蛋白（圖7-C、圖7-D）。結構域功能預測結果顯示，Galectin-3含有碳水化合物識別域（CRD），而LITAF蛋白具有典型的末端C-XX-C鋅指結構保守區(qū)域（圖7-E、圖7-F）。

2.5.4" Galectin-3與LITAF蛋白二級、三級結構預測與互作蛋白網(wǎng)絡分析

由圖8可知，Galectin-3蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲分別占8.77%、21.93%、7.02%和62.28%（圖8-A），LITAF蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲分別占18.06%、20.83%、2.78%和58.33%（圖8-B），顯示出無規(guī)則卷曲是Galectin-3蛋白和LITAF蛋白主要的二級結構。

對Galectin-3與LITAF蛋白的三維結構進行建模，由圖8-C、圖8-D可知，Galectin-3與LITAF蛋白三級結構的主要形式均為無規(guī)則卷曲，本結果與二級結構預測結果一致，表明模擬構建的 Galectin-3 和LITAF蛋白三維結構合理。

互作蛋白網(wǎng)絡分析結果顯示，Galectin-3蛋白（lgals3）與SLC40A1、GEMIN4、LAMP1、CD44和PTPRC蛋白相互作用（圖8-E）；LITAF蛋白（LOC108278842）與LIN9、LIN52、LIN54、RBBP4、CENPT、DUT等9個蛋白相互作用（圖8-F）。蛋白與蛋白之間相互作用的平均可信度均gt;70%。

3" 討論

蘭州鲇轉錄組測序結果的質量分析與Unigene功能注釋結果顯示，蘭州鲇在公共基因數(shù)據(jù)庫中無參考基因組，顯示出本研究結果的創(chuàng)新性，然而也增加了對蘭州鲇Unigene編碼功能預測的難度。本研究使用BLASTX算法并結合公共數(shù)據(jù)庫對組裝后的Unigene序列進行注釋，最終得到注釋基因數(shù)為 37 905 個，注釋率為17.24%，還有82.76%的序列未被注釋。與NR蛋白數(shù)據(jù)庫同源性比對結果顯示，蘭州鲇皮膚與脾基因中有14.73%的 Unigene與已知基因同源，遠低于黃尾鲴（Xenocypris davidi）的49.59%和克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）的28.35%［43-44］。在注釋成功的基因中，有41.34%的基因與墨西哥脂鯉的基因序列相似性最高，其次

是與斑馬魚的基因序列，占比為18.57%。這種較低的注釋率及其與鯉科魚類而非鲇科魚類的基因同源性最高的結果，可能與蘭州鲇及其相近物種（如鲇科魚類）的基因注釋信息在公共基因數(shù)據(jù)庫中收錄較少有關，進一步說明蘭州鲇基因數(shù)據(jù)庫亟需豐富。此外，由于未被成功注釋的序列中可能包含非編碼RNA或無功能結構域序列［45］，它們作為潛在功能序列，也有可能參與到蘭州鲇的生物學過程中，將隨著蘭州鲇等鲇科魚類轉錄組數(shù)據(jù)的豐富而得以進一步研究。

本研究篩選出了galectin-3等差異表達的基因。據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-3是作為PRR參與機體對各類病原體防御的先天免疫反應蛋白，該蛋白通過與大腸桿菌脂多糖（LPS）的結合而寡聚化，從而增強機體對中性粒細胞的促炎活性［46］。有研究表明，該蛋白還參與巨噬細胞對β-1，2-寡甘露聚糖（存在于念珠菌屬中）的識別，幫助巨噬細胞有效區(qū)分致病性（念珠菌屬）和非致病性（酵母菌屬）酵母，從而更高效吞噬致病念珠菌［47］。Zhou等在對斑點叉尾研究中發(fā)現(xiàn)galectin-3在皮膚組織中的高表達，并認為其在斑點叉尾黏膜免疫中起著至關重要的作用［48］。在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）中，檢測到galectin-3在皮膚等組織中高表達，且嗜水氣單胞菌感染后在免疫相關組織中上調表達，表明galectin-3可能在細菌攻擊后的免疫反應中發(fā)揮作用［49］。本試驗結果顯示，galectin-3在蘭州鲇皮膚組織中高表達，這與上述研究結果一致，表明galectin-3在蘭州鲇皮膚免疫中發(fā)揮著特定的免疫防御作用。

為了確立galectin-3基因在各物種之間的親緣關系，本研究將蘭州鲇Galectin-3蛋白序列與其他物種進行比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白的氨基酸序列在硬骨魚類的進化過程中是保守的，表明硬骨魚中的Galectin-3蛋白擁有共同的祖先，且具有相同或類似的生物學功能。結構域功能預測結果顯示，蘭州鲇Galectin-3具有典型的碳水化合物識別域（CRD），表明其可與β-半乳糖苷結合，在細胞內糖蛋白、細胞表面分子和細胞外基質中均發(fā)揮著重要作用［50］。蛋白質互作分析結果顯示，有CD44等5種蛋白與Galectin-3 進行相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中的 Galectin-3 能夠上調CD44這種細胞黏附分子的表達，促進腫瘤細胞的黏附作用［51］，最終促進腫瘤細胞的侵襲與轉移［52-53］，進一步研究蘭州鲇機體內類似的免疫蛋白，對蘭州鲇免疫器官與免疫功能的研究具有重要意義。

本研究也篩選出了LITAF等差異表達的基因。研究發(fā)現(xiàn)，LITAF在不同動物間的表達模式各有不同。在人體中，該基因主要在脾、淋巴結和外周血白細胞中高表達［54］，在斑馬魚中該基因在其鰓中高表達［16］。研究還發(fā)現(xiàn)，該基因的同系物RbLITAF1基因在條石鯛（Oplegnathus fasciatus）脾和心組織中高表達，而同系物RbLITAF2在條石鯛的鰓、腸和胃中高表達［18］。本研究結果顯示，LITAF在蘭州鲇的6個組織中均有表達，且在肝臟和皮膚中高表達（圖5）。肝臟作為魚體的重要器官，參與解毒、營養(yǎng)代謝、生物合成、消化、免疫、凝血等重要過程［55-56］，而皮膚是蘭州鲇等無鱗魚類抵御病原菌等不良刺激的第一道防線［2，57］，因此，LITAF基因在蘭州鲇肝臟與皮膚中的高表達顯示出該基因高度參與了該組織器官的免疫防御。

LITAF蛋白的序列相似性分析結果表明，該蛋白序列在硬骨魚中是保守的。該蛋白結構域功能預測結果顯示，蘭州鲇LITAF蛋白具有典型的末端C-XX-C鋅指結構保守區(qū)域，這與該蛋白在石斑魚（Epinephelus coioides）及太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）中的預測結果［58-59］相一致。蛋白質互作分析結果顯示，蘭州鲇LITAF可與著絲粒蛋白T（CENPT）等9種蛋白質形成復雜的相互作用，CENPT是一種參與細胞有絲分裂的著絲粒相關蛋白，在有絲分裂過程中形成動粒，調控細胞分裂［60-61］。有研究表明，當機體受到LPS刺激后脾組織中LITAF表達水平快速上調［58，62］，從而參與機體的促炎反應。由此可見，LITAF作為調控脂多糖誘導產(chǎn)生TNF-α的關鍵因子，在調控炎癥與細胞凋亡等方面發(fā)揮著復雜且重要的作用。

4" 結論

本研究通過對蘭州鲇皮膚和脾組織的轉錄組學分析，獲得了大量皮膚和脾轉錄本差異表達基因。對galectin-3與LITAF的組織表達模式分析發(fā)現(xiàn)，galectin-3主要在皮膚組織中表達，LITAF在各個組織均有表達且主要在皮膚和肝臟中高表達，證明二者在蘭州鲇中可能行使其相應的免疫功能。蛋白質結構與功能預測結果顯示，Galectin-3與LITAF的氨基酸序列在硬骨魚中均是保守的。本研究結果可以為完善蘭州鲇轉錄組文庫、發(fā)掘蘭州鲇免疫功能基因及其免疫研究提供基礎數(shù)據(jù)。

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