摘要：目的觀察五倍子酸（GA）聯(lián)合索拉非尼（Sora）對(duì)HepG2細(xì)胞的化療增敏作用，并探討其作用機(jī)制。方法將肝癌HepG2細(xì)胞分為對(duì)照組、GA組、Sora組和GA+Sora組。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力，CompuSyn軟件分析聯(lián)合用藥指數(shù)（CI值）；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；細(xì)胞劃痕和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力；Western Blot法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2、MMP-9和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。肝癌HepG2細(xì)胞接種于裸鼠背部右下方，植瘤6 d后分為4組：對(duì)照組（Control）、GA組、Sora組和GA+Sora組，每周測(cè)量1次腫瘤大小和質(zhì)量，藥物干預(yù)21 d，處死裸鼠，取腫瘤稱重。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果GA和Sora作用HepG2細(xì)胞48 h的IC50值分別為（123.47±5.16）μmol/L和（9.87±0.98）μmol/L，Sora與70μmol/L GA（IC30）聯(lián)用后，IC50降至（2.06±0.35）μmol/L，不同濃度Sora與70μmol/L GA聯(lián)合用藥CI值均lt;1；各組細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為234.0±20.4、147.0±12.1、129.3±13.3、73.0±7.6，GA+Sora組細(xì)胞克隆數(shù)明顯低于對(duì)照組、GA組和Sora組（P值均lt;0.05）；處理48 h后，各組細(xì)胞凋亡率分別為（1.98±0.29）%、（15.17±1.56）%、（18.65±1.48）%和（34.60±5.36）%，GA+Sora組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組、GA組和Sora組（P值均lt;0.05）；處理24 h后，各組細(xì)胞遷移率分別為（55.59±5.08）%、（29.34±4.36）%、（21.80±5.16）%和（6.47±2.75）%，GA+Sora組細(xì)胞遷移率明顯低于對(duì)照組、GA組和Sora組（P值均lt;0.05）；處理48 h后，各組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為223.7±13.0、168.3±10.9、155.3±29.1和62.7±19.7，GA+Sora組穿膜細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組、GA組和Sora組（P值均lt;0.05）；與對(duì)照組比較，GA組、Sora組和GA+Sora組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P值均lt;0.05），Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P值均lt;0.05）。GA組、Sora組和GA+Sora腫瘤體積和瘤重均比對(duì)照組減?。≒值均lt;0.05）；與Sora組比較，GA+Sora組裸鼠腫瘤的體積和質(zhì)量均明顯減少（P值均lt;0.05）。結(jié)論GA對(duì)Sora化療有增敏作用，其機(jī)制可能與GA和Sora聯(lián)用后促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞遷移、侵襲有關(guān)。

關(guān)鍵詞：癌，肝細(xì)胞；索拉非尼；五倍子酸

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生與健康技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（2020J082）

Effect of gallic acid in increasing the chemosensitivity of hepatocellular carcinoma HepG2 cells to sorafenib

LIU Baikun，WANG Zhiru，ZHAO Wenjing

Central Laboratory of Hepatobiliary Hospital of Jilin，Changchun 130062，China

Corresponding author：ZHAO Wenjing，xingyuewj@163.com（ORCID：0000-0002-0841-9632）

Abstract：Objective To investigate the chemosensitization effect of gallic acid（GA）combined with sorafenib（Sora）on hepatocellular carcinoma HepG2 cells and related mechanisms.Methods HepG2 cells were randomly divided into control group，GA group，Sora group，and GA+Sora group.CCK8 assay was used to measure cell viability；CompuSyn software was used to analyze combination index（CI）；colony formation assay was used to evaluate the colony formation ability of cells；flow cytometry was used to measure cell apoptosis；wound healing assay and Transwell chamber assay were used to observe the migration and invasion abilities of cells；Western Blot was used to measure the expression matrix metalloproteinase 2（MMP-2），matrix metalloproteinase 9（MMP-9），and apoptosis-related proteins.HepG2 cells were subcutaneously inoculated into the lower right back of mice，and 6 days later，the mice were divided into control group，GA group，Sora group，and GA+Sora group.Tumor size and body weight were measured once a week，and drug intervention was performed for 21 days.Then the nude mice were sacrificed，and tumor weight was measured.A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups.Results The mean IC50 values of GA and Sora for the treatment of HepG2 cells for 48 hours were 123.47±5.16μmol/L and 9.87±0.98μmol/L，respectively，and when Sora was combined with 70μmol/L GA（IC30），IC50 decreased to 2.06±0.35μmol/L；the CI value waslt;1 for Sora at different concentrations combined with 70μmol/L GA.The number of cell colonies was 234.0±20.4，147.0±12.1，129.3±13.3，and 73.0±7.6，respectively，in the four groups，and the GA+Sora group had a significantly lower number of cell colonies than the control group，the GA group，and the Sora group（all Plt;0.05）.After 48 hours of treatment，the cell apoptosis rate was 1.98%±0.29%，15.17%±1.56%，18.65%±1.48%，and 34.60%±5.36%，respectively，in the four groups，and the GA+Sora group had a significantly higher cell apoptosis rate than the control group，the GA group，and the Sora group（all Plt;0.05）.After 24 hours of treatment，the cell migration rate was 55.59%±5.08%，29.34%±4.36%，21.80%±5.16%，and 6.47%±2.75%，respectively，in the four groups，and the GA+Sora group had a significantly lower cell migration rate than the control group，the GA group，and the Sora group（all Plt;0.05）.After 48 hours of treatment，the number of transmembrane cells was 223.7±13.0，168.3±10.9，155.3±29.1，and 62.7±19.7，respectively，in the four groups，and the GA+Sora group had asignificantly lower number of transmembrane cells than the control group，the GA group，and the Sora group（all Plt;0.05）.Compared with the control group，the GA group，the Sora group，and the GA+Sora group had significant reductions in the protein expression levels of MMP-2，MMP-9，and Bcl-2（all Plt;0.05）and significant increases in the protein expression levels of Bax and cleaved caspase-3（all Plt;0.05）.Compared with the control group，the GA，Sora，and GA+Sora groups had significant reductions in tumor volume and weight（all Plt;0.05），and compared with the Sora group，the GA+Sora group had significant reductions in tumor volume and weight in nude mice（both Plt;0.05）.Conclusion GA can increase the sensitivity of HepG2 cells to Sora chemotherapy，possibly by promoting cell apoptosis and inhibiting cell migration and invasion after combination with Sora.

Key words：Carcinoma，Hepatocellular；Sorafenib；Gallic Acid

Research funding：Health Science and Health Technology Innovation Project of Jilin Province（2020J082）

原發(fā)性肝癌是源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，75%～85%以上的原發(fā)性肝癌的病理類型為肝細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱肝癌）［1-2］。2023年我國(guó)肝癌新發(fā)病例38.9萬(wàn)，位列惡性腫瘤第四位，年死亡病例33.6萬(wàn)，位居惡性腫瘤第二位［3］。根治性手術(shù)切除是肝癌治療的主要手段，由于肝癌發(fā)病隱匿，70%的患者在確診時(shí)已是中晚期，喪失根治性手術(shù)切除機(jī)會(huì)［4］。對(duì)于腫瘤體積較大、肝內(nèi)多發(fā)、已發(fā)生血管、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期肝癌患者，分子靶向藥物治療是標(biāo)準(zhǔn)治療策略［5］。索拉非尼（Sorafenib，Sora）是治療晚期肝癌的一線分子靶向藥物［6］，研究表明Sora可有效延長(zhǎng)肝癌患者的總體生存時(shí)間，改善生存質(zhì)量［7］，但耐藥的發(fā)生限制了Sora的臨床療效。從藥用植物中尋找具有抗腫瘤活性的化合物，將其與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，是抗腫瘤治療研究的熱點(diǎn)［8］。五倍子酸（gallic acid，GA）是一種存在于山茱萸、五倍子、牡丹皮、掌葉大黃等植物中的天然多酚酸，許多研究表明GA對(duì)多種癌細(xì)胞具有抗癌活性，包括直腸癌［9］、肺癌［10］、乳腺癌［11］、子宮內(nèi)膜癌［12］等。本課題組前期研究顯示，GA能顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯［13］。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察GA與Sora聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，體內(nèi)構(gòu)建裸鼠肝癌模型，探究GA和Sora聯(lián)合使用是否具有協(xié)同增效作用，為提高Sora治療肝癌的效果提供參考。

1材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Sora、GA購(gòu)于美國(guó)MCE公司，高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤2原癌基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）抗體、兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）抗體、小鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）抗體、兔抗人MMP-9抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，CCK8試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板、基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，酶標(biāo)儀和SDS-PAGE蛋白電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，放于恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）中常規(guī)傳代培養(yǎng)，維持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力5×103個(gè)/孔HepG2細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h更換100μL含有不同藥物的培養(yǎng)基。GA組以0、25、50、100、150、200、300μmol/L的濃度梯度干預(yù)，Sora組以0、1、2、5、10、20、40μmol/L的濃度梯度干預(yù)，聯(lián)合應(yīng)用組以70μmol/L GA（IC30）［14］+Sora（1、2、5、10、20、40μmol/L）聯(lián)合使用，設(shè)置等量不含藥物和細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，藥物干預(yù)48 h后酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度值（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。CompuSyn軟件計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力1×103個(gè)/孔HepG2細(xì)胞接種于6孔板，分為4組：對(duì)照組（Control）、GA組（70μmol/L GA）、Sora組（2μmol/L Sora）、GA+Sora組（70μmol/L GA+2μmol/L Sora）。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，4%多聚甲醛溶液固定，PBS緩沖液洗滌3次，結(jié)晶紫染色，鏡下計(jì)數(shù)gt;10個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞分組方法同1.2.3節(jié)。2×105個(gè)/孔HepG2細(xì)胞接種于6孔板，不同藥物干預(yù)48 h后收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒染色說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力細(xì)胞分組方法同1.2.3節(jié)。1×106個(gè)/孔HepG2細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后200μL無(wú)菌槍頭垂直6孔板底部劃痕并加藥處理，加藥0 h和24 h后倒置顯微鏡下觀察、拍照。Image J軟件對(duì)劃痕距離進(jìn)行分析，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕間距－24 h劃痕間距）/0 h劃痕間距×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力細(xì)胞分組方法同1.2.3節(jié)。取不同藥物干預(yù)48 h的HepG2細(xì)胞接種于上室，下室加入含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600μL，24 h取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色液染色5 min，棉簽擦去上室細(xì)胞，待小室干燥后鏡下觀察，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 Western Blot法檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平細(xì)胞分組方法同1.2.3節(jié)。藥物干預(yù)48h后收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞沉淀數(shù)量分別加入一定體積的RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒法檢測(cè)蛋白濃度。取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA封閉4h，按照抗體說(shuō)明書(shū)配置一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜3次加入1∶1 000稀釋二抗，室溫孵育2 h，洗膜3次化學(xué)發(fā)光試劑顯影并拍照。Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8裸鼠異種移植瘤模型SPF級(jí)雄性裸鼠30只（6周齡，體質(zhì)量18～22 g）購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（吉）2020-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（吉）2021-0020。收集HepG2細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液制備成細(xì)胞懸液，皮下注射0.2 mL（含5×106 HepG2細(xì)胞）細(xì)胞懸液到裸鼠背部右下方。植瘤6 d后按照腫瘤大小順序蛇形均衡分為4組：對(duì)照組（Control）、GA組、Sora組和GA+Sora組，每組7只。GA和Sora的體內(nèi)給藥劑量和方式參考文獻(xiàn)［15］和［16］，按照GA組（80 mg/kg GA）、Sora組（20 mg/kg Sora）、GA+Sora組（80 mg/kg GA+20 mg/kg Sora）的濃度給藥。按照上述藥物濃度隔天給藥1次（灌胃體積按照0.1 mL/10 g標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算），對(duì)照組給予生理鹽水。監(jiān)測(cè)裸鼠活動(dòng)及一般狀態(tài)，每周測(cè)量1次腫瘤大小和質(zhì)量，根據(jù)公式腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2，估算腫瘤體積。藥物干預(yù)21 d，處死裸鼠，取腫瘤稱重。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法Graphpad Prism 7.0軟件計(jì)算藥物30%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制濃度（30%inhibition concentration，IC30）和半數(shù)抑制濃度（50%inhibition concentration，IC50）。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 GA與Sora聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用不同濃度GA、Sora，以及兩藥聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均有抑制作用，且具有濃度依賴性。GA和Sora作用HepG2細(xì)胞48 h的IC50值分別為（123.47±5.16）μmol/L和（9.87±0.98）μmol/L，Sora與70μmol/L GA（IC30）聯(lián)用后，IC50降至（2.06±0.35）μmol/L。利用CompuSyn軟件計(jì)算CI值，不同濃度Sora與70μmol/L GA聯(lián)合用藥CI值均lt;1，說(shuō)明GA與Sora聯(lián)合使用具有協(xié)同作用（表1）。根據(jù)藥物聯(lián)用選擇原則［17］（CIgt;1拮抗，CI=1疊加，0.6lt;CIlt;1協(xié)同，CIlt;0.6強(qiáng)協(xié)同）確定70μmol/L GA與2μmol/L Sora為后續(xù)實(shí)驗(yàn)聯(lián)合用藥組藥物濃度，作用時(shí)間48 h。

2.2 GA與Sora聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響加藥處理后各組細(xì)胞培養(yǎng)14 d，GA+Sora組細(xì)胞克隆數(shù)（73.0±7.6）明顯低于對(duì)照組（234.0±20.4）、GA組（147.0±12.1）和Sora組（129.3±13.3）（P值均lt;0.05）（圖1）。

2.3 GA與Sora聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Annexin V-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，對(duì)照組、GA組、Sora組和GA+Sora組細(xì)胞凋亡率分別為（1.98±0.29）%、（15.17±1.56）%、（18.65±1.48）%和（34.60±5.36）%。與對(duì)照組比較，GA組、Sora組、GA+Sora組細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P值均lt;0.05）；與GA組、Sora組比較，GA+Sora組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P值均lt;0.05）。

2.4 GA和Sora聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響加藥處理24 h后，對(duì)照組、GA組、Sora組和GA+Sora組細(xì)胞遷移率分別為（55.59±5.08）%、（29.34±4.36）%、（21.80±5.16）%和（6.47±2.75）%。與對(duì)照組比較，GA組、Sora組和GA+Sora組細(xì)胞遷移率均降低（P值均lt;0.05）；GA組與Sora組細(xì)胞遷移率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；與GA組、Sora組比較，GA+Sora組細(xì)胞遷移率降低（P值均lt;0.05）（圖3）。

2.5 GA與Sora聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)24 h后，對(duì)照組、GA組、Sora組和GA+Sora組HepG2細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為223.7±13.0、168.3±10.9、155.3±29.1和62.7±19.7，與對(duì)照組比較，GA組、Sora組和GA+Sora組穿膜細(xì)胞數(shù)均降低（P值均lt;0.05）；與GA組、Sora組比較，GA+Sora組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低（P值均lt;0.05）（圖4）。

2.6 GA與Sora聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞MMP-2、MMP-9和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，GA組、Sora組和GA+Sora組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平均降低（P值均lt;0.05），凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)均增加（P值均lt;0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P值均lt;0.05）；與GA組和Sora組比較，GA+Sora組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平均明顯降低（P值均lt;0.05），凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)均增加（P值均lt;0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P值均lt;0.05）（圖5，表2）。

2.7 GA與Sora聯(lián)用對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響4組裸鼠在喂養(yǎng)過(guò)程中，精神、飲食及排便均比較正常，體質(zhì)量在喂養(yǎng)過(guò)程中增加，其中GA組和GA+Sora組體質(zhì)量增加較多，其次為Sora組，Sora組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與對(duì)照組比較，GA組、Sora組及GA+Sora組均顯著抑制裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤大?。≒值均lt;0.05）；與Sora組比較，GA+Sora組裸鼠腫瘤的體積和質(zhì)量明顯減少（P值均lt;0.05）（圖6）。

3討論

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤［18］。Sora是治療晚期肝癌的一線靶向藥物，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖及阻斷腫瘤血管生成的雙重抗腫瘤作用［19］。多項(xiàng)國(guó)際性臨床試驗(yàn)結(jié)果表明Sora可延長(zhǎng)晚期肝癌患者生存期、提高生存質(zhì)量，但耐藥性和毒副作用限制了其臨床應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，許多從中草藥提取的小分子與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)表現(xiàn)出了增強(qiáng)的臨床療效［20-21］。GA具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗糖尿病等多種藥理活性。張仲衛(wèi)等［22］研究結(jié)果表明，GA聯(lián)合順鉑在體內(nèi)外均具有協(xié)同抗食管癌的作用。楊勤龍［23］使用含有GA成分的中藥大黃墊蟲(chóng)丸治療食管癌患者，患者病情逐漸好轉(zhuǎn)。本研究前期結(jié)果顯示，GA對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲均具有顯著的抑制作用，并通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［13］。這些結(jié)果提示，GA可與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤治療。本實(shí)驗(yàn)首先觀察GA聯(lián)合Sora抑制HepG2細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用，結(jié)果顯示，GA與Sora對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖均具有抑制作用，兩藥聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用更明顯。Sora作用HepG2細(xì)胞48 h的IC50值為（9.87±0.98）μmol/L，與70μmol/L GA（IC30）聯(lián)合用藥后，IC50降至（2.06±0.35）μmol/L，且不同濃度Sora與70μmol/L GA聯(lián)合用藥CI值均lt;1。為進(jìn)一步證實(shí)GA與Sora聯(lián)合體內(nèi)協(xié)同抗肝癌作用，本研究在裸鼠肝癌移植瘤模型中測(cè)定了GA單藥組（80 mg/kg）、Sora單藥（20 mg/kg）組及GA（80 mg/kg）和Sora（20 mg/kg）聯(lián)用組的腫瘤生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組、GA或Sora單藥組相比，聯(lián)用組則腫瘤體積明顯減少，GA與Sora聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤效果最佳。體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示GA聯(lián)合Sora有協(xié)同抗肝癌作用，可降低Sora劑量，減少不良反應(yīng)，這對(duì)于臨床用藥有重要的指導(dǎo)意義。

Sora是一種多靶點(diǎn)抗腫瘤藥，其藥理機(jī)制之一是通過(guò)抑制Raf/Mek/Erk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究從細(xì)胞凋亡角度觀察GA化療增敏作用及可能機(jī)制，結(jié)果顯示，GA與Sora聯(lián)用可顯著增加HepG2細(xì)胞凋亡比例。Bcl-2蛋白家族是線粒體途徑凋亡的主要調(diào)控因子，家族中的Bcl-2是一個(gè)主要的抑凋亡蛋白，通過(guò)阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放發(fā)揮抗凋亡作用，Bax是主要的促凋亡蛋白，通過(guò)增加線粒體膜通透性，釋放細(xì)胞色素C而引起凋亡發(fā)生［24］。Bax蛋白的高表達(dá)、Bcl-2蛋白的低表達(dá)作用于線粒體，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放，細(xì)胞色素C、Smac等凋亡相關(guān)因子釋放入胞漿，進(jìn)而激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡［25］。本研究發(fā)現(xiàn)GA對(duì)Sora化療增敏的作用機(jī)制與升高促凋亡蛋白Bax表達(dá)、降低抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，增加凋亡蛋白Caspase-3的活化有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因，肝癌的高死亡率與肝癌細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移和高侵襲力密切相關(guān)［26］。本研究劃痕抑制和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GA和Sora單藥對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用較弱，聯(lián)用后可顯著降低HepG2細(xì)胞凋亡遷移和侵襲能力。細(xì)胞外基質(zhì)降解和穿透基底膜是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，MMP能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和彈性蛋白等成分，從而促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)鄰近和遠(yuǎn)端組織的遷移和侵襲［26］。研究顯示MMP-2和MMP-9與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)［27］。Western Blot分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組MMP-2和MMP-9表達(dá)水平顯著降低，GA與Sora聯(lián)用可通過(guò)降低MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GA與Sora在體內(nèi)、體外抗肝癌作用上均發(fā)揮協(xié)同作用，這種協(xié)同作用可能與促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制遷移和侵襲有關(guān)。這些結(jié)果提示將GA與Sora聯(lián)合使用可能是一個(gè)有前景的肝癌臨床治療策略。課題組后續(xù)將從細(xì)胞遷移、侵襲信號(hào)通路及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等角度進(jìn)一步深入探索GA對(duì)Sora化療增敏的作用機(jī)制，以期為臨床提高肝癌治療效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2024年1月6日經(jīng)由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2024年研審第17號(hào)。符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉百坤負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；王志茹參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；趙文靜負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-07-09；錄用日期：2024-09-18

本文編輯：王亞南