摘要：生物育種是種業(yè)創(chuàng)新的核心，是種源核心技術(shù)攻關(guān)的重要手段。明晰作物生物育種核心技術(shù)，對(duì)我國(guó)戰(zhàn)略性部署育種技術(shù)研發(fā)、破解種源“卡脖子”、實(shí)現(xiàn)種業(yè)現(xiàn)代化以及建設(shè)種業(yè)強(qiáng)國(guó)具有指導(dǎo)意義?；贒erwent Innovation專利數(shù)據(jù)庫，圍繞核心技術(shù)特征構(gòu)建核心特征測(cè)度指數(shù)，結(jié)合專家智慧識(shí)別作物生物育種領(lǐng)域核心專利，通過計(jì)量分析和文本挖掘，從研發(fā)機(jī)構(gòu)、布局區(qū)域和技術(shù)分布視角分析領(lǐng)域核心專利布局概況，洞察作物生物育種核心技術(shù)研發(fā)熱點(diǎn)和重點(diǎn)演變趨勢(shì)，經(jīng)專家研判識(shí)別出五大作物生物育種核心技術(shù)主題，并結(jié)合我國(guó)作物生物育種核心技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因組編輯技術(shù)對(duì)我國(guó)未來生物育種研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：生物育種；核心專利；熵值法；核心特征測(cè)度指數(shù)；核心技術(shù)；文本挖掘

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0683

中圖分類號(hào)：S336 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2025）03003514

種子是確保國(guó)家糧食安全的基礎(chǔ)，生物育種是種業(yè)創(chuàng)新的核心。近年來我國(guó)高度重視種業(yè)安全和生物育種工作，提出要加快推進(jìn)農(nóng)業(yè)關(guān)鍵核心技術(shù)攻關(guān)、加快生物育種產(chǎn)業(yè)化步伐。2021年出臺(tái)的《種業(yè)振興行動(dòng)方案》將啟動(dòng)種源關(guān)鍵核心技術(shù)攻關(guān)列為重點(diǎn)部署工作。面向種源核心技術(shù)攻關(guān)的迫切需求，如何有效識(shí)別核心技術(shù)成為首要解決的問題。

專利作為公開獲取的技術(shù)信息源，是國(guó)家、企業(yè)、行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的核心要素之一，能夠更好地揭示領(lǐng)域核心技術(shù)[1]。核心專利承載著產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)，深入挖掘核心專利是洞察領(lǐng)域核心技術(shù)的有效途徑。因此，如何從海量專利中識(shí)別核心專利近年來得到廣泛關(guān)注，相關(guān)研究與應(yīng)用日益豐富。

目前，已有學(xué)者采取多種方法對(duì)目標(biāo)領(lǐng)域的核心專利進(jìn)行識(shí)別和分析。郭劍明等[2]構(gòu)建了基于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的核心專利識(shí)別方法；付振康等[3]基于影響專利壽命的指標(biāo)，通過深度學(xué)習(xí)模型識(shí)別數(shù)字通信技術(shù)領(lǐng)域的核心專利；陳祥等[4]通過構(gòu)建專利進(jìn)化模型和技術(shù)擴(kuò)散指數(shù)識(shí)別疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域的核心專利；王曰芬等[5]從行為效果和動(dòng)機(jī)目的視角構(gòu)建核心專利識(shí)別指標(biāo)體系，篩選人工智能領(lǐng)域核心專利；謝萍等[6]構(gòu)建了核心專利綜合價(jià)值指標(biāo)體系，以識(shí)別風(fēng)能領(lǐng)域的核心專利；羅立國(guó)等[7]通過多元回歸模型分析了多種專利屬性指標(biāo)與核心專利的相關(guān)性，識(shí)別出新能源汽車裝置領(lǐng)域的核心專利；鞏永強(qiáng)等[8]基于專利對(duì)創(chuàng)新鏈中基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用環(huán)節(jié)的作用構(gòu)建測(cè)度指標(biāo)，篩選出白血病相關(guān)藥物領(lǐng)域的核心專利。趙蓉英等[9]根據(jù)被引頻次對(duì)人工智能領(lǐng)域核心專利進(jìn)行了深入挖掘與研究；崔斌等[10]基于權(quán)利申請(qǐng)數(shù)量、發(fā)明人數(shù)量等指標(biāo)，運(yùn)用超體積函數(shù)測(cè)度識(shí)別出基因工程疫苗領(lǐng)域的核心專利；崔遵康等[11]基于Innography 專利強(qiáng)度遴選出糧食作物生物育種領(lǐng)域核心專利。以上研究為本研究中核心專利識(shí)別指標(biāo)選擇及方法構(gòu)建提供了重要參考。

在生物育種領(lǐng)域，已有學(xué)者開展了關(guān)于核心技術(shù)的探索研究，梁翰文等[12]綜述了作物育種關(guān)鍵技術(shù)發(fā)展態(tài)勢(shì)；陳贏男等[13]概述了現(xiàn)代林木育種關(guān)鍵核心技術(shù)研究現(xiàn)狀；楊艷萍等[14]通過專利共被引聚類和組合分析識(shí)別出作物育種技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)。

綜上所述，已有研究多基于專家定性分析以及專利關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)聚類分析方面，鮮有從核心專利與核心技術(shù)的關(guān)聯(lián)性出發(fā)，通過定量分析方法識(shí)別核心專利，進(jìn)而挖掘核心技術(shù)的研究。因此，本研究圍繞核心技術(shù)特征構(gòu)建核心特征測(cè)度指數(shù)，結(jié)合專家智慧識(shí)別作物生物育種領(lǐng)域核心專利，通過文本挖掘明晰該領(lǐng)域核心技術(shù)，以期為我國(guó)科學(xué)開展作物育種技術(shù)布局、優(yōu)化產(chǎn)業(yè)布局、破解國(guó)外技術(shù)封鎖、推動(dòng)我國(guó)種業(yè)現(xiàn)代化、建設(shè)種業(yè)強(qiáng)國(guó)提供數(shù)據(jù)支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)來自Derwent Innovation 全球?qū)＠麛?shù)據(jù)庫，其收錄了德溫特世界專利索引（DerwentWorld Patent Index， DWPI）和德溫特專利引文索引（Derwent Patent Citation Index， DPCI）數(shù)據(jù)庫的全部專利以及來自全球48個(gè)專利授予機(jī)構(gòu)、90多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的9 300 萬件專利信息。根據(jù)經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for EconomicCo-operation and Development， OECD）確定的生物技術(shù)專利分類號(hào)提取涉及育種領(lǐng)域的專利分類號(hào)，包括A01H1*、A01H4*、C12M*、C12N*、C12Q*，并與代表作物領(lǐng)域的分類號(hào)（A01H）相組合，按照數(shù)據(jù)庫的檢索式表達(dá)要求，確定作物生物育種技術(shù)檢索表達(dá)式。專利申請(qǐng)時(shí)間范圍為2000—2020年，檢索時(shí)間為2021年12月30日，共獲得專利108 742件。

1.2 研究方法

核心專利識(shí)別。本研究參考前人方法[15-17]從基礎(chǔ)性、影響性和競(jìng)爭(zhēng)性3個(gè)維度表征核心技術(shù)，并選擇相關(guān)測(cè)度指標(biāo)（表1）。為減少無效專利的影響，選取各項(xiàng)指標(biāo)均大于零的專利，共計(jì)16 749件；然后采集其相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，將所選指標(biāo)通過熵值法進(jìn)行賦權(quán)。

熵值法是根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)值所提供的信息大小來確定指標(biāo)權(quán)重的客觀賦權(quán)法，基于信息論原理，指標(biāo)的信息熵越小，不確定性就越小，所提供信息量越大，在綜合評(píng)價(jià)中所發(fā)揮的作用越大，權(quán)重越高。熵值法具體步驟如下。

①由n 年數(shù)據(jù)來源的m 項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)構(gòu)成數(shù)據(jù)矩陣X。

建立情報(bào)專家和育種領(lǐng)域?qū)＜覉F(tuán)隊(duì)，通過專家反復(fù)研討，選取CCIi排名前3%的專利形成初始核心專利集，經(jīng)作物育種領(lǐng)域?qū)＜覍訉渝噙x，得到116件核心專利（圖1）。

通過文獻(xiàn)計(jì)量法，利用德溫特?cái)?shù)據(jù)分析軟件（Derwent data analyzer，DDA）和 Excel 等工具，從申請(qǐng)趨勢(shì)、地域分布、申請(qǐng)人、技術(shù)分布等維度進(jìn)行計(jì)量統(tǒng)計(jì)，利用DDA 主題詞抽取和可視化功能分析作物生物育種核心專利熱點(diǎn)主題詞，通過詞頻逆文本頻率指數(shù)（term frequency-inversedocument frequency，TF-IDF）統(tǒng)計(jì)方法挖掘?qū)＠匾黝}詞。

2 結(jié)果與分析

2.1 核心專利計(jì)量分析

2.1.1 重要研發(fā)機(jī)構(gòu) 作物生物育種核心專利主要來自陶氏益農(nóng)、Broad研究所、麻省理工學(xué)院和孟山都（表2），陶氏益農(nóng)和孟山都的專利申請(qǐng)主要集中在2010年，內(nèi)容聚焦轉(zhuǎn)基因技術(shù)；Broad研究所和麻省理工學(xué)院的專利申請(qǐng)主要集中在2013年，內(nèi)容以基因組編輯技術(shù)為主。

2.1.2 主要布局區(qū)域 作物生物育種核心專利主要在美國(guó)（57件）和歐盟地區(qū)（11件），這與現(xiàn)代生物育種技術(shù)多起源于美國(guó)和歐洲地區(qū)有關(guān)，申請(qǐng)人一般會(huì)優(yōu)先考慮在本國(guó)進(jìn)行專利布局。在美國(guó)布局的核心專利重要主題詞涵蓋轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因組編輯技術(shù)；在歐盟地區(qū)布局的核心專利重要主題詞則集中在CRISPR/Cas（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated）基因編輯技術(shù)（表3）。這與2個(gè)地區(qū)對(duì)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因組編輯技術(shù)的監(jiān)管制度緊密相關(guān)。美國(guó)對(duì)于現(xiàn)代生物育種技術(shù)持相對(duì)寬松的監(jiān)管方式，在全球最早頒布并執(zhí)行轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管制度，基于“個(gè)案分析”以基因編輯作物最終產(chǎn)品作為監(jiān)管對(duì)象，綜合評(píng)估產(chǎn)品的安全性、新穎性，目前已有基因編輯產(chǎn)品獲批上市[1819]，相對(duì)明朗寬松的監(jiān)管政策促進(jìn)了相關(guān)技術(shù)的研發(fā)及專利布局。歐盟地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物持相對(duì)謹(jǐn)慎的監(jiān)管態(tài)度，嚴(yán)格限制轉(zhuǎn)基因作物在歐洲地區(qū)種植，而對(duì)于基因編輯作物則從最初將其視為轉(zhuǎn)基因作物等同監(jiān)管轉(zhuǎn)向釋放放寬基因編輯在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域監(jiān)管限制的信號(hào)[20]，促使其成為基因組編輯技術(shù)專利布局的熱點(diǎn)地區(qū)之一。

2.1.3 技術(shù)分布 作物生物育種核心專利主要分布在C12N15和A01H5這2個(gè)技術(shù)領(lǐng)域（表4），熱點(diǎn)主題詞包括CRISPR、轉(zhuǎn)基因、特異性堿基對(duì)序列、靶標(biāo)DNA、新DNA 靶向RNA、位點(diǎn)特異性修飾、多肽、定點(diǎn)等（圖2）。從時(shí)間分布來看，大致以2012年為分割點(diǎn)，2012年之前的熱點(diǎn)主題詞以轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因、害蟲、防控雜草、防控鱗翅目害蟲等轉(zhuǎn)基因技術(shù)相關(guān)詞組為主；2012年之后的熱點(diǎn)主題詞以CRISPR、靶標(biāo)DNA、特異性堿基對(duì)序列、位點(diǎn)特異性修飾、定點(diǎn)、多肽、新DNA靶向RNA、CRISPR酶系統(tǒng)等基因組編輯技術(shù)相關(guān)詞組居多（圖3）。

重要主題詞的時(shí)間分布（表5）顯示，2012年之前作物生物育種技術(shù)的研發(fā)重心集中在防控雜草與蟲害、新型抗蟲蛋白、轉(zhuǎn)基因植物；2012年首次出現(xiàn)specific base pair sequence主題詞；2013年首次出現(xiàn)CRISPR enzyme system、target DNA、newDNA-targeting RNA、performing site-specificmodification、site-directed、interspaced shortpalindromic repeats （CRISPR）-CRISPR 等主題詞，并延續(xù)出現(xiàn)在之后的年份。由此可見，2012年以前作物育種主要是以轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)為主，以提升作物的抗蟲、抗除草劑性能；2012年之后作物生物育種技術(shù)的研發(fā)重心轉(zhuǎn)向以CRISPR為代表的基因組編輯技術(shù)和靶向育種技術(shù)。從技術(shù)類別來看，作物生物育種核心專利主要涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)（75件）和基因組編輯技術(shù)（41件），同樣呈現(xiàn)出由轉(zhuǎn)基因技術(shù)向基因組編輯技術(shù)遷移的趨勢(shì)（圖4）。

2.2 作物生物育種領(lǐng)域核心技術(shù)解析

通過專家解讀，作物生物育種領(lǐng)域核心技術(shù)主題包括：①外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系改進(jìn)與優(yōu)化；②RNA干擾遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建；③CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建；④抗蟲、抗除草劑基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種鑒定；⑤綜合性狀改良基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育。其中，主題①的專利申請(qǐng)年份最早，核心特征測(cè)度指數(shù)最高，代表基礎(chǔ)核心技術(shù)；主題③的核心特征測(cè)度指數(shù)較高，且平均申請(qǐng)年份較新，代表新興核心技術(shù)；主題④的核心專利最多，研究熱度最大。從時(shí)間脈絡(luò)來看，作物生物育種核心技術(shù)大致經(jīng)歷了從外源基因轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建與優(yōu)化、功能基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育到RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建，再到CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的演進(jìn)過程。

2.2.1 外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系改進(jìn)與優(yōu)化 與常規(guī)雜交育種相比，外源基因轉(zhuǎn)入可以打破生殖隔離，在更大范圍內(nèi)利用基因資源，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)在不同物種間的傳遞，更快地獲得具有理想性狀的新品種；其次，外源基因轉(zhuǎn)入還可以更為精準(zhǔn)地在同一物種內(nèi)傳遞遺傳物質(zhì)，將多種優(yōu)良性狀快速集于一身，大幅提高育種效率。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是影響轉(zhuǎn)基因作物培育的重要環(huán)節(jié)。近年來，作物轉(zhuǎn)基因效率得到大幅提高，特別是小麥，轉(zhuǎn)化效率從不足1% 提高到近20%，并且已經(jīng)基本克服了基因型限制[21]。目前主要研究方向是利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化替代基因槍，用成熟胚或其他外植體替代幼胚培養(yǎng)，以簡(jiǎn)化操作程序和消除設(shè)備依賴性；載體改造方面實(shí)現(xiàn)單次多基因轉(zhuǎn)化和多基因同步編輯，以提高轉(zhuǎn)化效率和降低成本。

該技術(shù)主題的相關(guān)專利包括通過轉(zhuǎn)基因載體的改造提高轉(zhuǎn)化效率和更有效地改變目標(biāo)基因的表達(dá)活性。孟德爾生物公司從擬南芥蛋白質(zhì)乙烯反應(yīng)因子中鑒定得到一個(gè)新的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活域EDLL，當(dāng)EDLL結(jié)構(gòu)域通過序列特異性DNA結(jié)合蛋白或通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作鉚定到靶基因啟動(dòng)子時(shí)可顯著提高靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，可以作為高效的轉(zhuǎn)錄激活工具，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物中靶基因的活性[22]。孟山都鑒定出一套可操縱靶基因在植物中表達(dá)的調(diào)控序列，其中5’啟動(dòng)子DNA序列在單子葉和雙子葉作物中均具有可調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)活性的功能，3’非翻譯區(qū)用于基因轉(zhuǎn)錄后加工，以保證轉(zhuǎn)錄本的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[23]。

2.2.2 RNA 干擾遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是真核生物中由RNA介導(dǎo)的保守調(diào)節(jié)機(jī)制，由雙鏈RNA 誘發(fā)、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi技術(shù)可特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，已成為植物性狀改良的重要方式之一。目前，已利用RNAi技術(shù)培育出抗病蟲害、抗非生物脅迫和品質(zhì)改良的植物新品種[24]。由于RNAi技術(shù)具有抗蟲靶標(biāo)基因來源廣、基因特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效延緩害蟲抗性進(jìn)化，目前已廣泛應(yīng)用于作物病蟲害防治，在擬南芥、煙草、馬鈴薯、玉米、小麥、棉花和大豆等多種作物均實(shí)現(xiàn)了基于RNAi的抗蟲品種培育[25]。

該技術(shù)主題的相關(guān)專利主要涉及將雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引入植物的方法以及其在培育抗蟲、抗逆和綜合品質(zhì)改良植物品種中的應(yīng)用。孟山都研發(fā)出與植物中靶基因序列互補(bǔ)或相同的dsRNA，植物經(jīng)約2.5 μm的顆粒研磨后與dsRNA 接觸，以滲透壓劑方式將dsRNA引入植物，賦予植物增產(chǎn)、抗非生物脅迫、抗病等優(yōu)異性狀[26]。在抗蟲研究方面，孟山都研發(fā)出由編碼dsRNA的DNA及其相關(guān)異源啟動(dòng)子構(gòu)成的重組DNA構(gòu)建體，通過向植物中轉(zhuǎn)入該構(gòu)建體觸發(fā)產(chǎn)生抑制害蟲靶基因的dsRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)跳甲蟲物種的防治[27]。在抗非生物脅迫和品質(zhì)改良研究方面，孟山都研發(fā)出異源miRNA識(shí)別位點(diǎn)的分子構(gòu)建體和用于基因抑制的分子構(gòu)建體，以及含有該構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，可有效提高植物非生物脅迫抗性、生物應(yīng)激耐受性、病蟲害抗性、產(chǎn)量及氮利用率等農(nóng)藝性狀[28]。

2.2.3 CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建 CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)來源于細(xì)菌和古細(xì)菌的獲得性免疫，其通過設(shè)計(jì)1個(gè)特定短引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）補(bǔ)充目標(biāo)位點(diǎn)即可對(duì)DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，實(shí)現(xiàn)了基因編輯的易編輯性，開創(chuàng)了基因編輯新時(shí)代，2位創(chuàng)始人也因此獲得了2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[29]。隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)在動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用，麻省理工學(xué)院張峰團(tuán)隊(duì)首次將Cas9改造為缺口酶以促進(jìn)同源重組[30]；哈佛大學(xué)Church G團(tuán)隊(duì)完成Ⅱ型系統(tǒng)設(shè)計(jì)，引入多個(gè)gRNA實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因座的多重編輯[31]；加州大學(xué)舊金山分校開發(fā)出CRISPRi技術(shù)，將Cas9蛋白改造為失去核酸內(nèi)切酶活性的dCas9，與gRNA共表達(dá)，通過結(jié)合目標(biāo)DNA抑制其表達(dá)[32]。

CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)在植物領(lǐng)域的研究與應(yīng)用日益廣泛，多種植物CRISPR/Cas基因編輯體系成功建立，CRISPR/Cas系統(tǒng)逐步發(fā)展擴(kuò)充為CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13及CRISPR/Cas14四大編輯系統(tǒng)[33]。目前，該系統(tǒng)已被應(yīng)用于小麥、玉米、水稻、大豆、馬鈴薯、番茄、油菜和花生等農(nóng)作物的育種改良[34]，基本實(shí)現(xiàn)了靶向基因敲除與插入、DNA-free編輯、RNA編輯、單堿基編輯、基因定位、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和表觀修飾等功能，培育出具有高產(chǎn)、抗病蟲害、抗除草劑和非生物脅迫的作物新品種[35]。

該技術(shù)主題的相關(guān)專利主要涉及在不同環(huán)境下使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的方法，包括不同的sgRNA或Cas9的不同結(jié)合方式，將靶向目標(biāo)基因組序列的CRISPR與Cas9基因構(gòu)建到同一載體上，CRISPR序列在被轉(zhuǎn)錄成為RNA后，能夠與Cas9蛋白形成復(fù)合體，導(dǎo)向Cas9蛋白到基因組靶序列進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)原核或真核細(xì)胞內(nèi)基因組的精準(zhǔn)靶向編輯。Doudna等[36]研發(fā)出不限環(huán)境的靶標(biāo)DNA切割，首次將CRISPR/Cas9這一自然界存在的細(xì)菌對(duì)病毒的防疫機(jī)制進(jìn)行體外重組，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基因組的查找、切割等工具化操作，專利權(quán)限包括體外或細(xì)胞內(nèi)使用CRISPR/Cas9；Zhang[37]研發(fā)出在真核或有核細(xì)胞內(nèi)（尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物基因組）對(duì)靶標(biāo)DNA切割的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，專利權(quán)限包括在真核細(xì)胞或任何有細(xì)胞核的物種中使用CRISPR/Cas9，首次將CRISPR/Cas9在和人類關(guān)系最為密切的真核細(xì)胞中進(jìn)行應(yīng)用。

2.2.4 抗蟲、抗除草劑基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種鑒定 目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用以抗除草劑基因和抗蟲基因?yàn)橹鳎嚓P(guān)轉(zhuǎn)基因作物已得到大面積推廣應(yīng)用[38]。抗蟲基因主要集中于編碼蘇云金芽孢桿菌Bt蛋白及其重組蛋白的核酸序列，已發(fā)現(xiàn)798個(gè)Cry家族基因、177個(gè)Vip家族基因和40個(gè)Cyt家族基因。商業(yè)化應(yīng)用的抗蟲性狀轉(zhuǎn)化體以Cry類基因居多，其中cry1Ab、cry1Fa2、cry35Ab1基因應(yīng)用最為廣泛[39]。耐除草劑基因主要包括原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，PPO）、對(duì)羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）、草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（glyphosate N-acetytransferase，GLYAT）、突變的纖維素合酶（cellulose synthase，CESA）、5烯醇丙酮酰莽草酸3磷酸合酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）、麥草畏脫羧酶等除草劑靶標(biāo)酶的編碼序列[40]。

該技術(shù)主題的研發(fā)內(nèi)容主要是圍繞廣譜抗蟲基因、抗除草劑基因以及聚合抗除草劑和抗蟲基因的挖掘與鑒定。在抗蟲方面，主要通過修飾抗蟲基因或聚合不同靶標(biāo)害蟲的多個(gè)抗蟲基因以實(shí)現(xiàn)對(duì)鱗翅目、鞘翅目及雙翅目等多種害蟲的抗性，拓寬轉(zhuǎn)基因植物抗蟲譜，并延緩害蟲耐藥性。主要包括防治鱗翅目昆蟲的殺蟲蛋白CRY1Ca 和CRY1Fa[41]，在Cry1Ca蛋白基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，對(duì)產(chǎn)生Cry1F抗性的秋粘蟲和甘蔗螟具有殺滅活性的DIG-109及DIG-152蛋白[42]，控制歐洲玉米螟和秋粘蟲的Cry1Ab和Cry1Be蛋白組合[43]，防治秋粘蟲的Cry1Da和Cry1Be蛋白組合[44]，防治草地貪夜蛾的Cry1Da和Cry1Ca蛋白組合[45]以及防治玉米根蟲的Cry3殺蟲多肽[46]的編碼基因。在抗除草劑方面，通過挖掘和創(chuàng)制不同除草劑對(duì)應(yīng)的不同靶基因或同一靶基因的不同抗性突變位點(diǎn)，經(jīng)人工誘變及突變體篩選、轉(zhuǎn)基因?qū)胪庠纯剐曰虻仁侄潍@得抗除草劑育種材料。涉及的抗除草劑種類包括草甘膦[4748]、麥草畏[49-51]、乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制劑類[52]、羥基苯基丙酮酸雙加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvatedioxygenase，HPPD）類抑制劑類[53]。此外，通過多種耐除草劑基因堆疊創(chuàng)制復(fù)合型耐除草劑品種[5455]也是新趨勢(shì)之一。

為了同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗蟲、抗除草劑效果，在同一植物中聚合抗除草劑和抗蟲基因是重要方式之一。陶氏益農(nóng)在大豆轉(zhuǎn)基因事件pDAB4468.04.16.1和 pDAB9582.814.19.1中實(shí)現(xiàn)了抗除草劑和抗蟲基因的聚合，使大豆包含AAD-12、CrylF、CrylAc（synpro） 和 PAT 編碼基因，為大豆作物同時(shí)提供抗蟲性和除草劑耐受性[56]。陶氏益農(nóng)在玉米新aad-1轉(zhuǎn)化事件中插入玉米細(xì)胞基因組內(nèi)特定位點(diǎn)的多核苷酸序列，編碼耐除草劑和抑制昆蟲蛋白，并研發(fā)出用于樣品檢測(cè)的試劑盒[57]。

2.2.5 綜合性狀改良基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育 面對(duì)全球氣候變化、耕地面積減少、人口不斷增加等挑戰(zhàn)，促進(jìn)作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、提升制作物氣候適應(yīng)性，成為保障糧食安全的基本要求，作物高產(chǎn)及抗旱、抗寒、耐高溫等抗逆基因的挖掘一直是作物遺傳改良的研究熱點(diǎn)。隨著人們生活水平提高，對(duì)優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的需求日益高漲，健康品質(zhì)基因的鑒定也逐漸成為重要的研究方向之一。近年來，協(xié)同性狀矛盾基因的鑒定成為重要突破，Wei等[58]發(fā)現(xiàn)了能夠同時(shí)提水稻高光合作用效率和氮素利用效率的高產(chǎn)基因OsDREB1C，使水稻增產(chǎn)30%以上；Brown等[59]從小麥Mlo 基因編輯突變體中篩選鑒定出具有白粉病廣譜抗性且對(duì)產(chǎn)量沒有負(fù)效應(yīng)的植株，為抗病和產(chǎn)量的協(xié)同改良提供了重要育種材料。

該技術(shù)主題的相關(guān)專利包括提升植物健康品質(zhì)、產(chǎn)量和環(huán)境脅迫耐受性的DNA構(gòu)建體組配及相關(guān)轉(zhuǎn)基因植物選育方法。孟德爾生物公司研發(fā)出使植物高產(chǎn)、耐受滲透脅迫或干旱、開花延遲以及木質(zhì)素含量增加的轉(zhuǎn)錄因子序列及相關(guān)轉(zhuǎn)基因植物[60]；孟山都研發(fā)出新的重組DNA構(gòu)建體以及獲得含該構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因種子和植物的方法，使植物水分利用率、氮利用率、產(chǎn)量和耐寒性提高，種子蛋白和油脂成分得到改善[61]。聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織研發(fā)出編碼ω-3去飽和酶的DNA構(gòu)建體，并實(shí)現(xiàn)了其與植物基因組的整合，使植物產(chǎn)生更多的多不飽和脂肪酸[62]。美國(guó)無煙煙草公司研發(fā)出編碼細(xì)胞色素p450酶和尼古丁去甲基化酶的核酸序列，可以有效降低煙草中的尼古丁含量[6364]。

3 討論與展望

3.1 討論

作物生物育種核心專利主要來自陶氏益農(nóng)、Broad研究所、麻省理工學(xué)院和孟山都，美國(guó)和歐盟地區(qū)是熱點(diǎn)布局地區(qū)，技術(shù)內(nèi)容涵蓋轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因組編輯技術(shù)，熱點(diǎn)主題詞包括CRISPR、轉(zhuǎn)基因、特異性堿基對(duì)序列、靶標(biāo)DNA、新DNA 靶向RNA、位點(diǎn)特異性修飾、多肽、位點(diǎn)定向。

通過深入分析核心專利，洞察作物生物育種核心技術(shù)發(fā)展態(tài)勢(shì)如下。

第一，核心技術(shù)聚焦5大主題。①抗蟲、抗除草劑基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種鑒定；②CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建；③RNAi遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建；④綜合性狀改良基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育；⑤外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系改進(jìn)與優(yōu)化。其中，抗蟲、抗除草劑基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種鑒定是熱點(diǎn)核心技術(shù)；CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建是新興核心技術(shù)；外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系改進(jìn)與優(yōu)化屬于基礎(chǔ)核心技術(shù)。

第二，技術(shù)布局呈現(xiàn)地區(qū)差異。美國(guó)相對(duì)明朗寬松的生物育種監(jiān)管方式使其成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因組編輯技術(shù)兩大主流生物育種核心技術(shù)的熱點(diǎn)布局地區(qū)，歐盟在有望放寬基因編輯監(jiān)管限制的形勢(shì)下，成為CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的熱點(diǎn)布局地區(qū)。

第三，呈現(xiàn)由轉(zhuǎn)基因技術(shù)向基因組編輯技術(shù)變遷的趨勢(shì)。2012年之前的技術(shù)研發(fā)聚焦轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研發(fā)重心集中在防控雜草與蟲害、新型抗蟲蛋白、轉(zhuǎn)基因植物；2012年之后基因組編輯技術(shù)研究日益升溫，CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)是技術(shù)研發(fā)重心。作物生物育種核心技術(shù)呈現(xiàn)從外源基因轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建與優(yōu)化、功能基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育到RNAi 技術(shù)轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建，再到CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的演進(jìn)趨勢(shì)。

3.2 展望

我國(guó)正處于深入實(shí)施種業(yè)振興行動(dòng)的關(guān)鍵時(shí)期，明晰生物育種核心技術(shù)及國(guó)際發(fā)展動(dòng)態(tài)對(duì)于我國(guó)推進(jìn)農(nóng)業(yè)關(guān)鍵核心技術(shù)攻關(guān)、加快生物育種產(chǎn)業(yè)化具有重要指導(dǎo)意義。在轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種方面，我國(guó)獲得了耐儲(chǔ)存番茄、抗蟲棉花、抗病辣椒、抗病番木瓜、轉(zhuǎn)植酸酶玉米、抗蟲水稻、耐除草劑玉米、雙抗玉米和耐除草劑大豆生物安全生產(chǎn)證書[65]，在作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)和材料儲(chǔ)備上已為轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化做出良好準(zhǔn)備，但目前只有抗蟲棉和抗病番木瓜實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，我國(guó)技術(shù)儲(chǔ)備潛力有待進(jìn)一步釋放。亟需通過不斷完善監(jiān)管政策、積極開展轉(zhuǎn)基因技術(shù)公眾科普以及實(shí)施全流程監(jiān)管來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因育種產(chǎn)業(yè)化科學(xué)有序推進(jìn)。

基因組編輯技術(shù)作為生物育種新興核心技術(shù)，目前主要掌握在技術(shù)源頭機(jī)構(gòu)，圍繞在真核細(xì)胞中使用CRISPR/Cas9專利優(yōu)先權(quán)和權(quán)限范圍展開了激烈爭(zhēng)奪，相關(guān)專利權(quán)屬之爭(zhēng)仍未了結(jié)，跨國(guó)種企通過技術(shù)轉(zhuǎn)讓、許可與合作獲得基因組編輯技術(shù)核心專利使用權(quán)，并在此基礎(chǔ)上延伸出多項(xiàng)應(yīng)用專利，積極部署了CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的研發(fā)與布局[40]。面對(duì)如此多CRISPR/Cas相關(guān)專利，任何機(jī)構(gòu)都難以獲得所有專利的使用授權(quán)，難以完全避免CRISPR/Cas 專利風(fēng)險(xiǎn)。目前歐美國(guó)家已經(jīng)對(duì)經(jīng)典的基因組編輯工具Cas9及相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行了較為全面的專利保護(hù)，使我國(guó)該領(lǐng)域面臨“卡脖子”問題。為解決這一問題，我國(guó)科研人員正積極探索并取得一系列重要進(jìn)展。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的cas12i酶系統(tǒng)[66]和cas12j酶系統(tǒng)[67]已在我國(guó)獲得授權(quán)，并向美國(guó)、歐盟、日本、澳大利亞等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)遞交了專利申請(qǐng)，同時(shí)基于cas12i/j基因編輯器在水稻、玉米等主要農(nóng)作物中構(gòu)建了全新的基因編輯體系；新研發(fā)的cas3c蛋白目前已申請(qǐng)專利，因其更好的編輯效果，已開始應(yīng)用于多種農(nóng)業(yè)生物。未來我國(guó)科技工作者需要協(xié)同攻關(guān)，以持續(xù)的技術(shù)創(chuàng)新打通基因編輯技術(shù)上下游，不斷提升效率，降低技術(shù)成本，實(shí)現(xiàn)技術(shù)全鏈條的專利保護(hù)，以獲取技術(shù)應(yīng)用主動(dòng)權(quán)；另外，應(yīng)鼓勵(lì)研發(fā)不依賴CRISPR/Cas系統(tǒng)核心專利的新系統(tǒng)和新工具，避免基因組編輯技術(shù)核心專利“卡脖子”問題，同時(shí)建議盡快部署基因組編輯技術(shù)相關(guān)監(jiān)管法規(guī)的研究與制定，為我國(guó)基因組編輯育種產(chǎn)業(yè)化發(fā)展鋪平道路。

參考文獻(xiàn)

［1］ 王玲燕，董蘭軍，彭東，等.基于DII的十字花科作物育種專利

技術(shù)全球創(chuàng)新態(tài)勢(shì)分析[J].中國(guó)瓜菜，2022，35（9）：108-113.

WANG L Y， DONG L J， PENG D， et al .. Patent technology of

cruciferous crop breeding based on DII global innovation

situation analysis [J]. China Cucurbits Veget.， 2022， 35（9）：

108-113.

［2］ 郭劍明，王婧怡，周云峰，等.基于專利網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的核

心專利識(shí)別方法研究[J].情報(bào)雜志，2023，42（5）：162-168，191.

GUO J M， WANG J Y， ZHOU Y F， et al .. Research on the core

patents identification method based on node importance of

patents network [J]. J. Intell.， 2023， 42（5）：162-168，191.

［3］ 付振康，柳炳祥，鄢春根，等.專利壽命視角下的核心專利識(shí)

別模型構(gòu)建[J].圖書館論壇，2023， 3（1）：112-120.

FU Z K， LIU B X， YAN C G， et al .. Building core patent

identification models from the lifespan perspective of patents [J].

Library Tribune， 2023， 43（1）：112-120.

［4］ 陳祥，馮佳，穆曉敏，等.技術(shù)知識(shí)擴(kuò)散視角下核心專利識(shí)別

方法研究[J].情報(bào)理論與實(shí)踐，2022， 5（10）：132-138.

CHEN X， FENG J， MU X M， et al .. Study of identification of

core patent in the perspective of diffusion of technology

knowledge [J]. Inform. Studies Theory Appl.， 2022， 45（10）：

132-138.

［5］ 王曰芬，張露，張潔逸. 產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域核心專利識(shí)別與演化分

析—— 以人工智能領(lǐng)域?yàn)槔齕J]. 情報(bào)科學(xué)，2020，38（12）：

19-26.

WANG Y F， ZHANG L， ZHANG J Y. Identification and

evolution analysis of core patent in the industrial field： taking

the field of artificial intelligence as an example [J]. Inf. Sci.，

2020， 38（12）：19-26.

［6］ 謝萍，錢過，袁潤(rùn).基于粗糙集理論的核心專利識(shí)別研究[J].

情報(bào)雜志，2015，34（7）：34-38，46.

XIE P， QIAN G， YUAN R. Research on core patent

identification based on rough set [J]. J. Intell.， 2015， 34（7）：34-

38，46.

［7］ 羅立國(guó)，林文廣.核心專利挖掘指標(biāo)研究——以新能源汽車

裝置領(lǐng)域?yàn)槔齕J].科技管理研究，2018，38（18）：151-156.

LUO L G， LIN W G. Research on core patent mining index：

taking the field of new energy automotive device as an example [J].

Sci. Tech. Manage. Res.， 2018， 38（18）：151-156.

［8］ 鞏永強(qiáng)，王超，許海云，等.創(chuàng)新鏈視角下的核心專利識(shí)別方

法研究[J].情報(bào)理論與實(shí)踐，2022，45（5）：113-122，164.

GONG Y Q， WANG C， XU H Y， et al .. Study of identification

of core patents in the perspective of innovation chain [J]. Inf.

Studies Theory Appl.， 2022， 45（5）：113-122，164.

［9］ 趙蓉英，李新來，李丹陽. 專利引證視角下的核心專利研

究—— 以人工智能領(lǐng)域?yàn)槔齕J]. 情報(bào)理論與實(shí)踐，2019，

42（3）：78-84.

ZHAO R Y， LI X L， LI D Y. Core patents research from the

perspective of patent citation： taking the field of artificial

intelligence as an example [J]. Inf. Studies Theory Appl.， 2019，

42（3）：78-84.

［10］ 崔斌，董坤，曾榮強(qiáng)，等.基于多目標(biāo)優(yōu)化的核心專利挖掘方

法研究——以基因工程疫苗領(lǐng)域?yàn)槔齕J].世界科技研究與

發(fā)展，2019，41（6）：660-675.

CUI B， DONG K， ZENG R Q， et al .. The core patent mining

based on multi-objective optimization in the field of genetic

engineering vaccine [J]. World Sci-Tech. Ramp;D， 2019， 41（6）：

660-675.

［11］ 崔遵康，李丹陽，徐小婷，等.糧食作物生物育種技術(shù)全球創(chuàng)

新布局與競(jìng)爭(zhēng)態(tài)勢(shì)研究——基于核心專利數(shù)據(jù)挖掘的視

角[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2022，24（5）：1-14.

CUI Z K， LI D Y， XU X T， et al .. Research on the global

innovation layout and competition situation of food crop biobreeding

technology： based on the perspective of core patent

data mining [J]. J. Agric. Sci. Technol.， 2022， 24（5）：1-14.

［12］ 梁翰文，呂慧穎，葛毅強(qiáng)，等.作物育種關(guān)鍵技術(shù)發(fā)展態(tài)勢(shì)[J].

植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2018，19（3）：390-398.

LIANG H W， LYU H Y， GE Y Q， et al .. Development of key

breeding technology [J]. J. Plant Genet. Resour.， 2018， 19（3）：

390-398.

［13］ 陳贏男，韋素云，曲冠正，等.現(xiàn)代林木育種關(guān)鍵核心技術(shù)研

究現(xiàn)狀與展望[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，

46（6）：1-9.

CHEN Y N， WEI S Y， QUAN G Z， et al .. The key and core

technologies for accelerating the tree breeding process [J]. J.

Nanjing For. Univ. （Nat. Sci.）， 2022， 46（6）：1-9.

［14］ 楊艷萍，董瑜，韓濤.基于專利共被引聚類和組合分析的產(chǎn)業(yè)

關(guān)鍵技術(shù)識(shí)別方法研究——以作物育種技術(shù)為例[J].圖書

情報(bào)工作，2016，60（19）：143-148，124.

YANG Y P， DONG Y， HAN T. The method of industrial key

technology identification based on co-citation cluster and

patent portfolio analysis： a case study on crop breeding

technologies [J]. Library Inf. Serv.， 2016， 60（19）：143-148，124.

［15］ 楊武，王爽.特征分析視角下核心技術(shù)動(dòng)態(tài)趨勢(shì)識(shí)別——以

光刻技術(shù)為例[J].情報(bào)雜志，2021，40（12）：36-44.

YANG W， WANG S. Dynamic trend identification of core

technology from the perspective of characteristic analysis： a

case study of lithography [J]. J. Intell.， 2021， 40（12）：36-44.

［16］ 楊大飛，楊武，田雪姣，等.基于專利數(shù)據(jù)的核心技術(shù)識(shí)別模

型構(gòu)建及實(shí)證研究[J].情報(bào)雜志，2021，40（2）：47-54.

YANG D F， YANG W， TIAN X J， et al.. Research on construction

and empirical study of core technology identification model based

on patent data [J]. J. Intell.， 2021， 40（2）：47-54.

［17］ 楊武，楊大飛.基于專利數(shù)據(jù)的產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)識(shí)別研究——

以5G移動(dòng)通信產(chǎn)業(yè)為例[J].情報(bào)雜志，2019，38（3）：39-45，52.

YANG W， YANG D F. Research on identification of industrial

core technology based on patent data—taking the field of fifth

generation mobile communication industry as an example [J]. J.

Intell.， 2019， 38（3）：39-45，52.

［18］ 張麗雯，劉加蘭，王洪，等.基因編輯技術(shù)監(jiān)管現(xiàn)狀研究[J].生

命科學(xué)，2022，34（10）：1317-1326.

ZHANG L W， LIU J L， WANG H， et al .. Current supervision

status of gene editing technology [J]. Chin. Bull. Life Sci.，

2022， 34（10）：1317-1326.

［19］ 齊茵.中美轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管法律制度的比較差異[J].分子植

物育種，2022，20（6）：1850-1855.

QI Y. Comparative differences in the legal system of supervision of

genetically modified crops between China and the USA [J].

Mol. Plant Breed.， 2022， 20（6）：1850-1855.

［20］ TANI C. EU agriculture ministers move closer to consensus on

gene editing of crops [EB/OL]. （2022-09-20） [2023-07-25].https：

//sciencebusiness.net/news/eu-agriculture-ministers-move-closerconsensus-

gene-editing-crops.

［21］ WANG K， SHI L， LIANG X N， et al.. The gene TaWOX5

overcomes genotype dependency in wheat genetic transformation

[J]. Nat. Plants， 2022， 8（2）：110-117.

［22］ CANALES R， TIWARI S， REUBER T L， et al .. Strong

activation domain： US10167480B2 [P]. 2019-01-01.

［23］ FINCHER K L， FLASINSKI S， WILKINSON J Q. Plant

expression constructs： US6660911B2 [P]. 2003-12-09.

［24］ 伍國(guó)強(qiáng)，劉海龍，劉左.RNAi技術(shù)及其在植物中的應(yīng)用[J].分

子植物育種，2018，16（19）：6299-6307.

WU G Q， LIU H L， LIU Z. RNAi technology and its application

in plants [J]. Mol. Plant Breed.， 2018， 16（19）：6299-6307.

［25］ 高瀝文，陳世國(guó)，張?jiān)＃?基于RNA干擾的生物農(nóng)藥的發(fā)展

現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2022，38（3）：700-715.

GAO L W， CHEN S G， ZHANG Y， et al .. The development of

biological pesticides based on RNA interference [J]. Chin. J.

Biol. Control， 2022， 38（3）：700-715.

［26］ HUANG S， IANDOLINO A B， PEEL G J. Methods and

compositions for introducing nucleic acids into plants：

US10655136B2 [P]. 2020-05-19.

［27］ CRAWFORD M J， EADS B D. Compositions and methods for

controlling insect pests： US10378012B2 [P]. 2019-08-13.

［28］ ALLEN E M， GILBERTSON L A， HEISEL S E， et al ..

Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene

expression： US9212370B2 [P]. 2015-12-15.

［29］ JINEK M， CHYLINSKI K， FONFARA I， et al .. programmable

dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial

immunity [J]. Science， 2012（337）：816-821.

［30］ CONG L， RAN F A， COX D， et al .. Multiplex genome

engineering using CRISPR/Cas systems [J]. Science， 2013（339）：

819-823.

［31］ MALI P， YANG L， ESVELT K M， et al .. RNA-guided human

genome engineering via Cas9 [J]. Science， 2013（339）：823-826.

［32］ LARSON M H， GILBERT LA， WANG X W， et al .. CRISPR

interference （CRISPRi） for sequence-specific control of gene

expression [J]. Nat. Prot.， 2013， 8（11）：2180-2196.

［33］ 毛金燕，翟惠，王潔.CRISPR/Cas技術(shù)及其作用機(jī)理[J].分子

植物育種，2022，20（7）：2310-2319.

MAO J Y， ZHAI H， WANG J. CRISPR/Cas technology and its

action mechanisms [J]. Mol. Plant Breeding， 2022， 20（7）： 2310-2319.

［34］ 曾秀英，侯學(xué)文.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在植物基因

功能研究及植物改良中的應(yīng)用[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2015，

51（9）：1351-1358.

ZENG X Y， HOU X W. Application of CRISPR/Cas9 genome

editing technology in functional genomics and improvement of

plants [J]. Plant Physiol. J.， 2015， 51（9）：1351-1358.

［35］ 李樹磊，鄭紅艷，王磊.基因編輯技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用與

展望[J].生物技術(shù)通報(bào)，2020，36（11）：209-221.

LI S L， ZHENG H Y， WANG L. Application and prospect of

gene editing technology in crop breeding [J]. Biotechnol. Bull.，

2020， 36（11）：209-221.

［36］ DOUDNA J A， JINEK M， CHARPENTIER E， et al .. Methods

and compositions for RNA-directed target DNA modification

and for RNA-directed modulation of transcription：

US10266850B2 [P]. 2019-04-23.

［37］ ZHANG F. CRISPR-Cas systems and methods for altering

expression of gene products： US8697359B1 [P]. 2014-04-15.

［38］ 國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織.2019年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)

基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2021，

41（1）：114-119.

［39］ 梁晉剛，張旭冬，畢研哲，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米發(fā)展現(xiàn)狀與展

望[J].中國(guó)生物工程雜志，2021，41（6）：98-104.

LIANG J G， ZHANG X D， BI Y Z， et al .. Development status

and prospect of genetically modified insect-resistant maize [J].

China Biotechnol.， 2021， 41（6）：98-104.

［40］ 賈倩，鄭懷國(guó)，趙靜娟.跨國(guó)種企作物育種專利布局及對(duì)我國(guó)

的啟示[J].中國(guó)生物工程雜志，2022，42（10）：112-124.

JIA Q， ZHENG H G， ZHAO J J. The layout of crop breeding

patents of multinational seed companies and its enlightenment

to China [J]. China Biotechnol.， 2022， 42（10）：112-124.

［41］ MEADE T， NARVA K， STORER N P， et al .. Combined use of

CRY1Ca and CRY1Fa proteins for insect resistance management：

US9567602B2 [P]. 2017-02-14.

［42］ MEADE T， BURTON S L， NARVA K， et al .. Modified Cry1Ca

insecticial Cry proteins： US9284573B2 [P]. 2016-03-15.

［43］ MEADE T， NARVA K， STORER N P， et al .. Use of Cry1Ab in

combination with Cry1Be for management of resistant insects：

US9663795B2 [P]. 2017-05-30.

［44］ MEADE T， NARVA K， STORER N P， et al .. Use of Cry1Da in

combination with Cry1Be for management of resistant insects：

US9499835B2 [P]. 2016-11-22.

［45］ MEADE T， NARVA K， STORER N P， et al .. Use of Cry1Da in

combination with Cry1Ca for management of resistant insects：

US9796982B2 [P]. 2017-10-24.

［46］ BERMUDEZ E， CONG R， HOU J T， et al .. Synthetic

insecticidal proteins active against corn rootworm： US9109231

B2 [P]. 2015-08-18.

［47］ MALVEN M， RINEHART J， TAYLOR N， et al .. Soybean event

MON89788 and methods for detection thereof： US7632985B2

[P]. 2009-12-15.

［48］ MALVEN M， RINEHART J， TAYLOR N， et al .. Soybean event

MON89788 and methods for detection thereof： US8053184B2

[P]. 2011-11-08.

［49］ CLEMENTE T E， DUMITRU R， FENG P C C， et al .. Modified

DMO enzyme and methods of its use： US7884262B2 [P]. 2011-

02-08.

［50］ FENG P C C， MARIANNE M， STANISLAW F. Chloroplast

transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof：

US7838729B2 [P]. 2010-11-23.

［51］ BRINKER R J， BURNS W C， FENG P C C， et al .. Soybean

transgenic event MON 87708 and methods of use thereof：

US8501407B2 [P]. 2013-08-06.

［52］ JUSTIN M L， ROBERT M C， CARLA Y， et al .. Synthetic

brassica-derived chloroplast transit peptides： WO2013116758

A1 [P].2013-08-08.

［53］ MASON J T， LETTOW L J， EBY M A， et al .. Elite event eegm3

and methods and kits for identifying such event in

biological samples： WO2011063411A1 [P]. 2011-05-26.

［54］ WRIGHT T R， LIRA J M， WALSH T A， et al .. Herbicide

resistance genes： US8283522B2 [P]. 2012-10-09.

［55］ WRIGHT T R， LIRA J M， WALSH T A， et al .. Herbicide

resistance genes： US8916752B2 [P]. 2014-12-23.

［56］ CUI Y X C， THOMAS H， PARKHURST D M， et al .. Insect

resistant and herbicide tolerant breeding stack of soybean

event pdab9582.814.19.1 and pdab4468.04.16.1： WO2013016

516A1 [P]. 2013-01-31.

［57］ CUI Y X， BRYAN J R， MAUM D G， et al .. AAD-1 event DAS-

40278-9， related transgenic corn lines， event-specific

identification thereof， and methods of weed control involving

AAD-1： US8598413B2 [P]. 2013-12-03.

［58］ WEI S B， LI X， LU Z F， et al .. A transcriptional regulator that

boosts grain yields and shortens the growth duration of rice [J].

Science， 2022， 377（6604）： abi8455 [2023-07-27]. https：//doi.

org/10.1126/science.abi8455.

［59］ BROWN J K M， WULFF B B H. Diversifying the menu for crop

powdery mildew resistance [J]. Cell， 2022， 185（5）：761-763.

［60］ HEARD J E， RIECHMANN J L， RATCLIFFE O， et al ..

Transcription factor sequences for conferring advantageous

properties to plants： US9447425B2 [P]. 2016-09-20.

［61］ ABAD M， AHRENS J， AUGUSTINE A， et al .. Transgenic

plants with enhanced agronomic traits： WO2009009142A3 [P].

2009-01-15.

［62］ PETRIE J R， MACKENZIE A M， LIU Q， et al .. Enzymes and

methods for producing omega-3 fatty acids： US8809559B2 [P].

2014-08-19.

［63］ XU D M. Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana：

US7812227B2 [P]. 2010-10-12.

［64］ XU D M. Tobacco nicotine demethylase genomic clone and

uses thereof： US8592663B2 [P]. 2013-11-26.

［65］ 解偉，劉春明.生物育種產(chǎn)業(yè)化面臨的機(jī)遇與政策保障[J].

生物技術(shù)通報(bào)，2023，39（1）：16-20.

XIE W， LIU C M. Commercialization of biological breeding in

China： opportunities and policy issues [J]. Biotechnol. Bull.，

2023， 39（1）：16-20.

［66］ 賴錦盛，周英思，朱金潔，等.新型CRISPR/Cas12f酶和系統(tǒng)：

CN111757889B[P].2021-05-25.

［67］ 賴錦盛，周英思，李英男，等.CRISPR-Cas12j 酶和系統(tǒng)：

CN113462671B [P].2023-09-12.