摘 要：為降低蒙古櫟（Quercus mongolica）組培過程褐化現(xiàn)象，闡明褐化發(fā)生是否與抗氧化酶系統(tǒng)及酚類物質產(chǎn)生有關。以蒙古櫟成熟合子胚為材料，利用組織培養(yǎng)技術優(yōu)化蒙古櫟再生植株體系獲得再生植株，探究聚乙烯吡咯烷酮（PVP）抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發(fā)的生理生化指標的影響。結果表明，PVP 40（40代表PVP平均分子量范圍）抑制褐化效果最佳，添加0. 2 g/LPVP 40不定芽誘導率最高，為71. 17%，其芽增殖系數(shù)為3. 90，芽生根率為40. 37%，移栽存活率為73%；PVP降低了蒙古櫟外植體抗氧化酶、多酚氧化酶活性及總酚酶活力，有效抑制褐化現(xiàn)象。PVP有效降低蒙古櫟組培褐化效果抑制褐化不再加劇，優(yōu)化蒙古櫟器官再生植株體系，分析PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發(fā)的內在生理機制，為櫟屬其他樹種抑制褐化提供參考。

關鍵詞：蒙古櫟； 聚乙烯吡咯烷酮； 褐化； 植株再生； 生理生化

中圖分類號：S792. 186 文獻標識碼：A DOI：10. 7525/j. issn. 1006-8023. 2025. 02. 008

0 引言

蒙古櫟（Quercus mongolica）又名蒙櫟、柞櫟、柞樹，為殼斗科（Fagaceae）櫟屬（Quercus）落葉喬木，是東北地區(qū)重要的闊葉樹種，具有極高的生態(tài)和經(jīng)濟價值［1-3］ 。蒙古櫟主要靠種子繁殖，由于種子繁育周期性強、發(fā)芽率低，易遭受蟲害且繁殖速度慢，而扦插、嫁接等傳統(tǒng)的無性繁殖技術無法滿足蒙古櫟優(yōu)良植株快速規(guī)?；敝承枨螅?］。因此利用組織培養(yǎng)技術既可能保證其優(yōu)良性狀，又可以縮短培育周期，提高產(chǎn)量和成活率。

國內外先后對櫟類樹種進行了組織培養(yǎng)技術研究，麻櫟（Q. acutissima）［5］、栓皮櫟（Q. variabi?lis）［6］、北美紅櫟（Q. rubra）［7］和冬青櫟（Q. ilex）［8］等多樹種已成功通過組織培養(yǎng)技術建立再生植株體系，獲得再生植株。在蒙古櫟器官發(fā)生途徑的植株再生研究中，基部愈傷化、植株玻璃化、培養(yǎng)物褐化及壞死等皆是影響其不定芽誘導及生根效率的原因［9］。蒙古櫟與胡桃楸（Juglans mandshurica）［10］、核桃（Walnut）［11］等闊葉樹種在組培過程中的褐化現(xiàn)象較其他木本植物更易發(fā)生，在蒙古櫟合子胚萌發(fā)培養(yǎng)階段，發(fā)現(xiàn)褐化嚴重影響合子胚的萌發(fā)率。已知添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可通過控制酚類物質的產(chǎn)生或降低外植體死亡率來改善這些情況的發(fā)生［12］，楊旭風等［13］證明了丙二醛（MDA）含量過高對細胞具有毒害作用，主要影響植物細胞中超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的活性，進而導致植物組織內活性氧動態(tài)失衡，激發(fā)過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性，催化大量酚類物質轉變成醌類物質導致褐化，地涌金蓮（Musella lasiocarpa）等植物在組織培養(yǎng)中褐化加重時PPO活性和總酚酶活力均較高［14］。然而蒙古櫟組培過程褐化現(xiàn)象是否與抗氧化酶系統(tǒng)及酚類物質產(chǎn)生有關尚需研究。

本研究探究了不同類型PVP對蒙古櫟合子胚萌發(fā)及無菌苗莖段的不定芽誘導、不定芽增殖和生根培養(yǎng)的影響，通過分析PVP對蒙古櫟合子胚萌發(fā)及組培抑制褐化處理的內在生理機制，降低外植體褐化率，建立高效穩(wěn)定、重復性良好的蒙古櫟器官發(fā)生再生體系，為櫟屬其他樹種抑制組織培養(yǎng)過程中的褐化現(xiàn)象提供參考，為今后應用蒙古櫟組織培養(yǎng)技術并利用分子手段進行遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

材料取自東北林業(yè)大學哈爾濱市城市林業(yè)示范基地，于2022年9月中上旬采集棕色或紅棕色的蒙古櫟成熟種子并分裝，挑選無蟲眼的成熟種子放置在4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 外植體制備與消毒

將種子在流水下沖洗2 h去除表面雜質，在超凈臺內去除殼斗和種皮，用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3次，選擇2%次氯酸鈉（NaClO）和1%氯化汞（HgCl2）分別浸泡消毒7、10、20 min，后用無菌水清洗5次，滅菌過程震蕩或攪拌使外植體與消毒液充分接觸。在超凈工作臺上用無菌濾紙吸干材料表面水分，將合子胚子葉朝上接種在培養(yǎng)基上。以1/2 MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同質量濃度的萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、吲哚丁酸（IBA），30 g/L 蔗糖及7 g/L 瓊脂，滅菌前調整pH為5. 8（本研究中基本培養(yǎng)基若未特別注明皆為1/2 MS培養(yǎng)基，蔗糖和瓊脂質量濃度不變）。每個處理培養(yǎng)15個外植體，重復3次，觀察并統(tǒng)計外植體污染率。

污染率（%） = （污染數(shù)÷ 接種數(shù)） × 100%。（1）

1. 3 PVP抑制褐化處理與蒙古櫟合子胚萌發(fā)

將消毒后的合子胚分別接種在添加PVP 30（0. 2、0. 4、0. 6 g/L）和PVP 40（0. 2、0. 4、0. 6 g/L）的萌發(fā)培養(yǎng)基（培養(yǎng)基制備同1. 2）上（PVP 30和PVP40中的30和40代表PVP平均分子量范圍），以不添加PVP為對照，每個處理培養(yǎng)15個外植體，重復3次。30 d后觀察統(tǒng)計7種不同抑制褐化處理的合子胚萌發(fā)率（%）、褐化率（%）、根系長度（cm）及根面積（cm2），根長、根面積使用根系掃描儀進行測定，重復3次，每次10個樣本。

褐化率（%） = （褐化數(shù)÷ 接種數(shù)） × 100%。（2）

萌發(fā)率（%） = （萌發(fā)數(shù)÷ 接種數(shù)） × 100%。（3）

1. 4 不定芽誘導培養(yǎng)

以萌發(fā)獲得的無菌苗莖段為材料，取其莖段切成1～2 cm左右小段，沿形態(tài)學方向接種在添加PVP40（0. 2、0. 4、0. 6 g/L）和6-BA（0. 2、0. 4、0. 6 mg/L）的誘導培養(yǎng)基（培養(yǎng)基制備同1. 2）上。每個處理培養(yǎng)15個外植體，重復3次，30 d后觀察并統(tǒng)計芽長度（cm）、不定芽數(shù)量（個）及外植體褐化情況，計算不定芽誘導率（%）。

不定芽誘導率（%）=（誘導數(shù)÷接種數(shù)）×100%。（4）

1. 5 不定芽增殖培養(yǎng)

將誘導獲得的不定芽轉移到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加0. 2 g/L PVP 40與不同質量濃度的6-BA（0. 2、0. 4、0. 6 mg/L），觀察6-BA質量濃度對不定芽增殖的影響。每個處理培養(yǎng)15個外植體，重復3次，30 d后觀察統(tǒng)計蒙古櫟不定芽生長情況及增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)= 再生芽總數(shù)÷ 接種芽數(shù)。（5）

1. 6 生根培養(yǎng)與煉苗移栽

將增殖后生長良好的組培苗轉入生根培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的NAA（0. 1、0. 25、0. 5 mg/L）和IBA（0. 1、0. 25、0. 5 mg/L），每個處理培養(yǎng)10個外植體，重復3次，培養(yǎng)初期暗培養(yǎng)7 d后轉到正常光照培養(yǎng)，2周后觀察統(tǒng)計幼苗生根率及生根情況。

煉苗和移栽：選擇生長良好、根系健壯的組培苗，揭開培養(yǎng)瓶封口膜并放置在培養(yǎng)室內環(huán)境下， 7 d后置于溫室內煉苗移栽，清洗干凈幼苗根系上殘留的培養(yǎng)基，移栽至草炭土∶蛭石∶珍珠巖體積比例為2∶1∶1的營養(yǎng)基質上，選擇弱光下培養(yǎng)，光照時間16 h/d，培養(yǎng)溫度為25 ℃±0. 5 ℃，定期澆水保持基質的含水率為50%～60%，2周后統(tǒng)計再生植株的成活率。

生根率（%） = （生根苗數(shù)÷ 接種數(shù)） × 100%。（6）

成活率（%） = （成活數(shù)÷ 移栽數(shù)） × 100%。（7）

1. 7 PVP抑制蒙古櫟合子胚褐化的生理生化指標測定

將消毒后的蒙古櫟合子胚接種在添加PVP 30及PVP 40的萌發(fā)培養(yǎng)基中，以不添加PVP作為對照（CK），每個處理隨機設置3個重復，每個重復接種外植體10個，萌發(fā)過程中每5 d取材1次，共取至第30 d（取材時間為0、5、10、15、20、25、30 d），將待測材料快速切碎混合均勻后液氮冷凍保存于-80 ℃冰箱內，用于不同類型PVP抑制蒙古櫟合子胚褐化的生理生化指標含量的測定，每個處理設置3個重復，每個樣品質量0. 1 g，每個指標共63個樣品，8個指標共504個樣品。

可溶性糖、可溶性淀粉含量采用蒽酮比色法，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法［15］；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑NBT還原法［16］；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法［15］；過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫法［16］；多酚氧化酶（PPO）活性采用鄰苯二酚法，總酚（TP）酶活力測定采用福林酚法［15］。

1. 8 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)經(jīng) Excel 2010整理統(tǒng)計后，利用SPSS Statistics 22. 0使用單因素方差分析（ANOVA）、最小顯著性差異法（LSD）和鄧肯（DUCAN）多重比較分析不同PVP處理組合下蒙古櫟合子胚萌發(fā)率、褐化率、不定芽誘導率、增殖率、生根率及蒙古櫟合子胚萌發(fā)的酶活性等生理指標的顯著性差異，在P=0. 05水平上進行顯著性檢驗，百分數(shù)數(shù)據(jù)在統(tǒng)計分析前先進行反正弦轉換，方差分析結果以均值±標準差（xˉ ± s）表示，采用不同小寫字母表示Plt;0. 05水平下的差異性顯著；圖像均用Origin軟件進行制圖。

2 結果與分析

2. 1 消毒劑及消毒時間對蒙古櫟合子胚消毒效果的影響

消毒劑及消毒時間對蒙古櫟合子胚消毒效果差異顯著，見表1。2種消毒劑對蒙古櫟合子胚消毒效果差異顯著，1% HgCl2消毒效果優(yōu)于2% NaClO。隨著消毒時間的增加，污染率及褐化率下降，萌發(fā)率顯著升高。因此，選擇1% HgCl2作為蒙古櫟合子胚消毒劑，消毒時間20 min。

2. 2 PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發(fā)的影響

蒙古櫟成熟種子平均長2. 16 cm、寬1. 31 cm，單粒質量3. 59 g。不同類型PVP抑制蒙古櫟合子胚褐化效果差異顯著，見表2。由圖1可知，與對照組相比，培養(yǎng)基中添加PVP可以降低蒙古櫟合子胚褐化率，PVP質量濃度提高褐化率隨之降低，最低為31%。PVP 40 較PVP 30 抑制褐化效果差異顯著（Plt;0. 05），當PVP 40質量濃度為0. 4 g/L時，萌發(fā)率最高73. 8%，根系長度為8. 04 cm，根面積為10. 39 cm2，高質量濃度的PVP不利于蒙古櫟合子胚萌發(fā)。因此，添加0. 4 g/L PVP 40對蒙古櫟合子胚萌發(fā)抑制褐化效果最佳。

2. 3 不同質量濃度PVP及6-BA組合對蒙古櫟不定芽誘導的影響

不同質量濃度PVP及6-BA組合對蒙古櫟不定芽誘導效果不同，見表3及圖2。對照組不定芽啟動時間晚，不定芽數(shù)量少、褐化率高；隨著6-BA質量濃度增加不定芽誘導率提高，質量濃度為0. 2 mg/L時最高，為71. 17%，芽生長健壯；褐化率隨PVP 質量濃度提高顯著下降。綜上，添加0. 2 g/L PVP 40與0. 2 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基為蒙古櫟不定芽誘導的最適培養(yǎng)基。

2. 4 6-BA質量濃度對蒙古櫟不定芽增殖的影響

將誘導培養(yǎng)30 d的不定芽轉移到增殖培養(yǎng)基上，6-BA質量濃度對不定芽增殖效果顯著，見表4及圖3。添加0. 6 mg/L 6-BA增殖系數(shù)最高，為4. 2，但多數(shù)葉片不舒展，出現(xiàn)輕微玻璃化。6-BA質量濃度為0. 4 mg/L時，芽長勢良好，平均苗高3. 90 cm，莖段生長健壯。隨著6-BA質量濃度逐漸升高，不定芽增殖系數(shù)增大，腋芽萌動較快，但葉片出現(xiàn)玻璃化，高質量濃度的生長素不利于不定芽增殖。

2. 5 蒙古櫟不定芽生根及煉苗移栽

NAA和IBA對蒙古櫟不定芽生根效果的影響差異顯著（Plt;0. 05），添加NAA不定芽生根效果優(yōu)于添加IBA的培養(yǎng)基，見表5及圖4，添加0. 25 mg/L NAA生根率最高為40. 37%。添加IBA（0. 01、0. 25 mg/L）根黃白色較短、無須根；添加NAA（0. 25 mg/L），根系較為粗壯。暗培養(yǎng)7 d后，生根效果有所增加，但葉片開始輕微發(fā)黃，隨著NAA與IBA質量濃度（0. 5 mg/L）的增加生根率下降，基部少量愈傷化，分化出的根系細弱相對較短，且不再繼續(xù)生根，表明單一較高質量濃度的植物生長調節(jié)劑會抑制蒙古櫟不定芽生根的效果。

將已生根30 d的蒙古櫟莖段，選擇生長健壯的幼苗進行煉苗3 d，煉苗移栽后的小植株，移栽到草炭土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1的營養(yǎng)基質中進行馴化培養(yǎng)（圖4（g））。培養(yǎng)2周后，統(tǒng)計蒙古櫟再生植株的存活率為73%（圖4（h））。

2. 6 PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發(fā)的生理生化影響

2. 6. 1 PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發(fā)的可溶性糖、可溶性淀粉、可溶性蛋白質量分數(shù)的影響

淀粉、糖作為儲能物質為植物生長代謝活動提供物質能量，不同類型PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發(fā)的營養(yǎng)物質質量分數(shù)的影響差異顯著，如圖5所示。本研究中CK與PVP 30處理組的可溶性糖質量分數(shù)呈上升下降趨勢，PVP 40變化趨勢不規(guī)則（圖5（a））。第0～10天處理組可溶性糖質量分數(shù)均高于對照組，第10天達到峰值，PVP 40處理組最高，為62. 87 mg/g?？扇苄缘矸圪|量分數(shù)均呈上升趨勢（圖5（b））；除第10～20天，PVP處理組可溶性淀粉質量分數(shù)均高于CK，PVP 40處理組質量分數(shù)第30 天達到最大值，為56. 64 mg/g。處理組與CK可溶性蛋白質量分數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，在整體培養(yǎng)周期內差異不顯著（圖5（c））；處理組在培養(yǎng)周期末質量分數(shù)達到最大值，PVP 30可溶性蛋白質量分數(shù)為27. 23 mg/g，PVP 40質量分數(shù)為27. 42 mg/g。

2. 6. 2 PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發(fā)的酶活性及總酚酶活力的影響

不同類型PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發(fā)的酶活性及總酚酶活力影響差異顯著（Plt;0. 05）。處理組抗氧化酶活性先上升后下降，如圖6所示。PVP處理組與對照組SOD活性差異顯著，處理組均低于對照組，未添加PVP處理的合子胚在接種5 d時SOD 活性達到高峰，為16. 69 U/g（圖6（a））。除第10～20天對照組POD活性顯著高于PVP處理組，對照組POD活性第10天最高，為77. 75 U/g，PVP 40第10天時最高，為54. 76 U/g，添加PVP能夠降低POD活性。PVP處理下蒙古櫟合子胚CAT活性低于對照差異顯著，PVP 30 與PVP 40 在第10 天達到峰值，分別為24. 72、26. 40 U/g，對照組CAT活性呈現(xiàn)波動式變化，可能是培養(yǎng)基成分及合子胚萌發(fā)過程的差異性造成的。

外植體培養(yǎng)第15天和第25天恰好是外植體褐化嚴重的時期。PVP處理組的蒙古櫟合子胚PPO活性顯著低于對照（圖6（d））；在第25天褐化情況加重；PPO活性小范圍上升，PVP 40始終處于較低水平。PVP處理蒙古櫟合子胚萌發(fā)的總酚酶活力變化差異顯著；對照組總酚酶活力高于PVP處理組，PVP處理組呈波動式變化，總酚酶活力越高褐化現(xiàn)象越嚴重。添加PVP可以抑制蒙古櫟成熟合子胚中酚類物質的產(chǎn)生，從而抑制蒙古櫟成熟合子胚褐化。

3 討論與結論

在植物組培中，外植體褐化現(xiàn)象嚴重阻礙組織培養(yǎng)的順利進行，本研究通過添加2種類型的PVP抑制蒙古櫟合子胚萌發(fā)褐化效果，萌發(fā)培養(yǎng)基中添加0. 4 g/L PVP 40抑制褐化效果最佳；0. 2 g/L PVP40促進蒙古櫟莖段不定芽誘導及增殖，不定芽增殖系數(shù)3. 90，芽生長健壯；NAA和IBA均能誘導不定芽生根，0. 25 mg/L NAA 生根效果最好，生根率40. 37%，這與劉曉紅等［17］對地被小菊（Chrysanthe?mum morifolium）的研究結果一致。蒙古櫟組培苗移栽存活率為73%；添加PVP處理合子胚萌發(fā)過程營養(yǎng)物質質量分數(shù)有所提高，酶活性及總酚酶活力顯著降低，表明PVP抑制外植體褐化效果從而提高植物新陳代謝能力，促進生長發(fā)育，PVP 40對萌發(fā)褐化效果抑制優(yōu)于PVP 30處理效果。

木本植物器官發(fā)生能否獲得再生植株，通常有很多影響因素，外植體類型、母樹基因型、基本培養(yǎng)基類型、植物外源激素和培養(yǎng)環(huán)境條件等［18］。大量研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用細胞分裂素也可以誘導不定芽的發(fā)生［19］，隨著6-BA質量濃度逐漸升高，不定芽增殖系數(shù)增大，腋芽萌動較快，但葉片干枯玻璃化還易產(chǎn)生矮小芽，不利于后續(xù)生根培養(yǎng)［20］，側柏古樹組織培養(yǎng)過程也有相同發(fā)現(xiàn)［21］；相比較豎向放置，莖段橫向放置不定芽生長更快，數(shù)量更多。在黃樟（Cinnamomum porrectum）的研究中發(fā)現(xiàn)生根前添加有機物質可以生根壯苗，暗培養(yǎng)生根效果有所增加［22］。

PVP通過降低蒙古櫟合子胚萌發(fā)過程中抗氧化酶活性和總酚酶活力有效抑制外植體褐化效果。PPO催化酚類物質氧化為醌類物質，PPO活性高低影響外植體褐化效果［23］，酚類物質在被多酚氧化酶氧化之前，PVP對其進行吸附，使其不能形成醌類物質，從而抑制褐化［24］。肖婧一等［25］在5種抗褐化劑對草莓莖尖褐化及誘導分化研究中發(fā)現(xiàn)，0. 5 g/LPVP抑制褐化效果最好，可起到破壞酚-酶復合物結構而達到抑制褐化的目的。外植體類型不同在組織培養(yǎng)過程中褐化的程度有所差別，通常生長狀態(tài)健壯的外植體，褐化率會大幅度降低［26］。綜上所述，PVP能夠抑制蒙古櫟外植體褐化現(xiàn)象從而提高不定芽誘導率促進再生植株成活，本研究優(yōu)化了蒙古櫟組織培養(yǎng)再生體系，并分析了PVP抑制蒙古櫟組織培養(yǎng)物的褐化效果及其生理響應，可為蒙古櫟及其他櫟屬樹種組織培養(yǎng)過程中解決外植體褐化問題提供參考。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2023YFD2200103）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（2572023CT02）。