摘 要：為了開展石榴遺傳轉(zhuǎn)化研究，以‘突尼斯軟籽’石榴為試材，葉片為外植體，采用響應(yīng)面回歸分析方法研究了不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對離體葉片愈傷組織再生的影響。結(jié)果表明，‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋2，4-D 0.5 mg/L＋NAA 0.3 mg/L，誘導(dǎo)率可達83.9%，且愈傷組織生長狀況良好。本研究建立了‘突尼斯軟籽’石榴高效的離體快繁體系，為石榴繁育技術(shù)的改善提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：‘突尼斯軟籽’石榴；植物生長調(diào)節(jié)劑；愈傷組織；響應(yīng)面法

中圖分類號：S665.4 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-1038（2025）02-0051-05

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2025.02.008

Study on Callus Induction Conditions of Pomegranate

Leaves of ‘Tunisia Soft Seed’

WANG Hong1， JIA Maomao1， TAO Aili2， LI Yuying2， YUAN Chaozheng1， YANG Ling1， GAO Xiaofeng1*

（1. Nanyang Academy of Sciences， Nanyang Key Laboratory of Pomegranate Breeding， Nanyang 473000， China;

2. Nanyang Normal University， Henan Soft Seed Pomegranate Engineering Research Center，

Nanyang 473000， China）

Abstract： In order to develop genetic transformation test of pomegranate， in this paper， using leaves in ‘Tunisia soft-seed’ pomegranate as explants， the different growth regulators on callus regeneration of leaves by response surface method was studied. The results showed that the optimal medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA， the induction rate was 83.9%， and most of the callus grew well. At the same time， a high efficient rapid propagation system of‘Tunisia soft-seed’ pomegranate was established. And it also provided a theoretical basis for improving pomegranate breeding technology.

Keywords： ‘Tunisia soft-seed’ pomegranate; plant growth regulator; callus; response surface method

石榴（Punica granatum L.）屬桃金娘目石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）落葉果樹，小喬木或灌木[1]，果實中含有維生素C、維生素B、有機酸、蛋白質(zhì)以及鈣、磷、鉀等豐富的營養(yǎng)成分[2]。石榴在我國已有2 000多年的栽培歷史，是優(yōu)良經(jīng)濟林樹種之一，栽培效益十分可觀。2020年，我國石榴種植面積約11.6萬hm2，居世界第一位，遠超世界第二大石榴種植國——伊朗[3]。

石榴是木本植物，營養(yǎng)生長期較長，利用傳統(tǒng)育種方法改良性狀遠落后于草本植物，而利用組織培養(yǎng)技術(shù)對研究石榴遺傳轉(zhuǎn)化及分子育種有一定的幫助[4]。目前，關(guān)于石榴組織培養(yǎng)方面的研究已經(jīng)取得了一定的進展[5-6]，對其葉片進行誘導(dǎo)愈傷組織方面的研究也有相關(guān)報道[7-8]。但是，葉片愈傷組織誘導(dǎo)受多因素影響，植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度是愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素[9-10]，但從單一因素出發(fā)優(yōu)化快繁體系較片面，沈慶斌等[11]、史滟滪等[12]、歐陽歡等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織誘導(dǎo)中單獨使用2，4-D不利于胚性愈傷組織的形成。Huang等[14]、李瑞靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)單獨使用細胞分裂素也很難完成愈傷組織的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)高質(zhì)量的愈傷組織，生長素和細胞分裂素缺一不可，需相互協(xié)同作用，而通過響應(yīng)面（法Box-Behnken design，BBD）可對不同因素與愈傷組織誘導(dǎo)率的關(guān)系建立模型并進行分析，得到可靠有效的試驗因素優(yōu)化方案[16]，關(guān)于利用響應(yīng)面法優(yōu)化石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的相關(guān)文獻未見報道。

本試驗以‘突尼斯軟籽’石榴葉片為原料，采用響應(yīng)面法研究NAA、6-BA和2，4-D濃度配比對石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，建立并優(yōu)化適用于‘突尼斯軟籽’石榴葉片誘導(dǎo)愈傷組織的快繁體系，為石榴愈傷組織的研究提供良好的試驗系統(tǒng)，同時也為石榴愈傷組織的進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為南陽師范學(xué)院石榴園試驗基地（112°30′E、33°0′N）3年生‘突尼斯軟籽’石榴樹。

MS培養(yǎng)基、6-BA、NAA、2，4-D，分析純，康倍斯生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得

取3年生‘突尼斯軟籽’石榴樹，當(dāng)年新抽、無病蟲害、生長健壯枝條，采摘葉片作為試材。用洗滌劑洗去表面塵土，流水下沖洗2 h。置于超凈工作臺上，先后用75%的乙醇震蕩30 s和0.1%氯化汞浸泡6 min進行滅菌，最后用無菌水沖洗2次，再放入無菌水中備用。

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

將無菌葉片在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，避開主脈剪成0.5 cm×0.5 cm大小，葉片背部向下鋪在培養(yǎng)基上。以MS為基本培養(yǎng)基，pH 5.8。每個處理接種10瓶，每瓶3個外植體，重復(fù)3次。接種后暗培養(yǎng)14 d，然后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃，光照強度1 500～2 000 lx，光照時間16 h/d。30 d后觀察記錄愈傷組織的生長情況并利用公式（1）計算誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率/%=×100（1）

1.3 單因素試驗

固定MS培養(yǎng)基的激素組成為NAA濃度0.3 mg/L、6-BA濃度1.5 mg/L、2，4-D濃度0.5 mg/L。NAA濃度設(shè)置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L，6-BA濃度設(shè)置為1.3、1.4、1.5、1.6、1.7 mg/L，2，4-D濃度設(shè)置為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/L，測定葉片誘導(dǎo)率及生長狀況，進行‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的單因素試驗。

1.4 響應(yīng)面實驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 10.0.6按照3因素3水平進行響應(yīng)面優(yōu)化。如表1所示，以愈傷組織誘導(dǎo)率（Y）為響應(yīng)值，以對誘導(dǎo)‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織影響顯著的3個因素，即NAA濃度、6-BA濃度及2，4-D濃度為考察因素。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，同時，利用Design-Expert 10.0.6對所得數(shù)據(jù)進行計算和分析，推測出最佳培養(yǎng)基配比，通過試驗驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 NAA對石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2知，石榴葉片暗培養(yǎng)14 d后，轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)條件下，葉片愈傷組織生長狀況見表2。結(jié)果表明，隨NAA濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率先增加后減小，當(dāng)NAA濃度為0.3 mg/L時，誘導(dǎo)率最大，并且得到綠色致密的愈傷組織，其生長非常好。由此可見，‘突尼斯’軟籽石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳NAA濃度為0.3 mg/L。

2.1.2 6-BA對石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，6-BA濃度為1.3 mg/L時，誘導(dǎo)率僅為56.7%，生成少量綠色愈傷組織；當(dāng)濃度1.5 mg/L時，誘導(dǎo)率最高，可達到76.7%，且得到大量綠色致密的愈傷組織；隨著6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)率降低，并且誘導(dǎo)的愈傷組織中有黃白色膨大；可能是激素濃度過高，細胞分裂過旺造成提前衰老[7]。綜上，‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的6-BA最佳濃度為1.5 mg/L。

2.1.3 2，4-D對石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表4可知，不同濃度的2，4-D對石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不同?？梢娚L素濃度適當(dāng)，一定程度上會促進愈傷組織的形成，但當(dāng)生長素濃度過高時，會增加多酚氧化酶的活性，褐化嚴重。因此，2，4-D濃度為0.5 mg/L時，‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率最高且生長情況最好。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化軟籽石榴葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2.1 模型擬合和方差分析

利用Box-Behnken試驗設(shè)計與分析3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化（表5），研究軟籽石榴葉片誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵因素，以獲得最佳的條件參數(shù)。對表5的結(jié)果進行擬合，得回歸方程為誘導(dǎo)率（Y）=83.54+0.76A+1.95B+0.26C-0.88AB+0.20AC-0.13BC-3.32A2-1.25B2-2.17C2。

根據(jù)方差分析和顯著性檢驗的結(jié)果（表6）可知，F(xiàn)=3.87，P＜0.05，表明該回歸方程顯著，R2=0.83表示模型可信度較高，模型擬合較好。失擬項的F=3.01，P=0.157 3（P＞0.05），可見失擬項不顯著，擬合情況較好，該模型能較好地預(yù)測和分析軟籽石榴愈傷組織的誘導(dǎo)率。

同時由表6回歸模型系數(shù)顯著性檢驗表明，模型一次項B影響顯著，因此在本試驗中對其愈傷組織的誘導(dǎo)率的影響的大小為6-BA＞NAA＞2，4-D。

2.2.2 交互作用分析

通過誘導(dǎo)率與各因素之間的響應(yīng)面，可以看出各因素間的交互作用對響應(yīng)值影響的顯著性，相互作用越強響應(yīng)面的曲線越陡[17-18]。圖1可知，6-BA濃度不變，隨著NAA和2，4-D濃度的增大，誘導(dǎo)率呈先增加后降低的趨勢；從圖1也可看出，NAA和6-BA、6-BA和2，4-D 之間的相互作用對誘導(dǎo)率的影響也相對較小。

2.2.3 最佳試驗條件的確定及驗證

分析得到軟籽石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)率最高的激素配比為6-BA濃度1.578 mg/L，NAA濃度為0.301 mg/L，2，4-D濃度為0.504 mg/L，在此條件下軟籽石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)率預(yù)測值為84.307%。調(diào)整后，最佳試驗條件為6-BA濃度1.5 mg/L、NAA濃度為0.3 mg/L、2，4-D濃度為0.5 mg/L，經(jīng)驗證試驗，得到軟籽石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)率為（83.9%±0.8%）。

3 結(jié)論

本試驗利用響應(yīng)面試驗設(shè)計方法篩選出不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響。翟懿銘等[19]研究證明，此方法是選擇最佳試驗方案的一種高效、直觀試驗設(shè)計方法，目前已有將此方法用于植物組培的報道，如武愛龍等[20]、趙欣等[21]、段新鈺等[22]分別對珍珠相思不定芽、黃精以及獼猴桃的研究。試驗結(jié)果表明，軟籽石榴葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L。本試驗得到了‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件，為石榴繁育技術(shù)的改善提供了理論依據(jù)。

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