摘要 ［目的］解決烤煙生長連作障礙。［方法］通過2021—2023年生物有機(jī)肥定位試驗(yàn)，研究連續(xù)3年生物有機(jī)肥施用對(duì)連作植煙土壤養(yǎng)分及微生多樣性的影響。［結(jié)果］連作種植下連續(xù)3年施用生物有機(jī)肥的植煙土壤pH及有機(jī)質(zhì)呈上升趨勢，堿解氮含量降低，有效磷及速效鉀含量保持穩(wěn)定。MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)植煙土壤細(xì)菌16S DNA V3～V4區(qū)域及真菌ITS ITS1 的檢測結(jié)果顯示，連作種植下隨著生物有機(jī)肥施用年限的增加，植煙土壤中的細(xì)菌及真菌OTUs數(shù)目、Chao1指數(shù)、香濃指數(shù)及物種數(shù)目呈增加趨勢。在門水平上，連作植煙土壤酸桿菌門（Acidobacteria）豐富度隨著生物有機(jī)肥施用年限的增加而增加，而擬桿菌門（Bacteroidetes）相對(duì)豐度減少；植煙土壤生物有機(jī)肥施用1年，子囊菌門（Ascomycota）豐富度最高，連續(xù)施用2年擔(dān)子菌門（Basidiomycota）豐富度最高。［結(jié)論］生物有機(jī)肥能夠降低連作植煙土壤酸化狀況，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，增加土壤微生物多樣性，對(duì)穩(wěn)定土壤速效養(yǎng)分具有一定的作用，為解決煙區(qū)連作障礙提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 生物有機(jī)肥；連作；植煙土壤；微生物多樣性

中圖分類號(hào) S154.3" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A" 文章編號(hào) 0517-6611（2025）03-0154-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.032

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Biological Organic Fertilizer Application on Soil Nutrients and Microbial Diversity of Continuous Cropping Tobacco

ZHANG Ben qiang， ZHANG Yang， LI Xi kun et al

（Shandong Tobacco Industrial Co.， Ltd .，Jinan，Shandong" 250014）

Abstract ［Objective］ To solve the continuous cropping obstacles of flue cured tobacco. ［Method］ Through the positioning test of biological organic fertilizer from 2021 to 2023， the effects of biological organic fertilizer application on soil nutrients and microbial diversity of continuous cropping tobacco were studied. ［Result］ The pH and organic matter of continuous cropping tobacco planting soil increased， the content of alkali hydrolyzable nitrogen decreased， and the content of available phosphorus and available potassium remained stable when biological organic fertilizer was applied continuously for 3 years. The detection results of bacterial 16S DNA V3"" V4 region and fungal ITS ITS1 in tobacco planting soil by MiSeq high throughput sequencing technology showed that the number of bacterial and fungal OTUs， Chao1 index， aroma index and species in tobacco planting soil increased with the increase of the application years of biological organic fertilizer under continuous cropping. At the phylum level， the abundance of Acidobacteria increased with the application of biological organic fertilizer， while the abundance of Bacteroidetes decreased; the richness of Ascomycota was the highest when the bio organic fertilizer was applied for one year， and that of Basidiomycota was the highest when the bio organic fertilizer was continuously applied for two years. ［Conclusion］ Bio organic fertilizer can reduce soil acidification， increase soil organic matter content， increase soil microbial diversity， play a certain role in stabilizing soil available nutrients， and provide a certain theoretical basis for solving continuous cropping obstacles under continuous cropping in tobacco areas.

Key words Biological organic fertilizer;Continuous cropping;Tobacco planting soil;Microbial diversity

基金項(xiàng)目 山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目““泰山”品牌導(dǎo)向型高端原料生產(chǎn)模式構(gòu)建與示范”（202101001）。

作者簡介 張本強(qiáng)（1985—），男，山東濟(jì)寧人，農(nóng)藝師，碩士，從事煙草栽培與調(diào)制研究。

*通信作者，農(nóng)藝師，碩士，從事煙草栽培研究。

收稿日期 2024-04-16；修回日期 2024-05-16

烤煙作為我國的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，近年來，由于連作嚴(yán)重影響烤煙的生長及產(chǎn)量產(chǎn)值。輪作雖然一直成為烤煙種植推廣的重點(diǎn)，但由于部分煙區(qū)耕地資源限制及種植模式單一，部分煙區(qū)烤煙連作現(xiàn)象逐漸增加，嚴(yán)重制約了我國煙葉的可持續(xù)發(fā)展及土壤利用^［1-2］。

連作障礙導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失調(diào)，土壤內(nèi)在養(yǎng)分不平衡，抑制土壤的生化過程。對(duì)于連作障礙的產(chǎn)生主要是作物、微生物及土壤生態(tài)系統(tǒng)間的失調(diào)，其中土壤理化性質(zhì)及微生物變化是導(dǎo)致連作障礙的重要原因^［3-5］。研究表明，連作破壞了植煙土壤微生物平衡，導(dǎo)致酶活性降低，土壤種群的多樣性及功能多樣性降低^［6-7］。作為土壤養(yǎng)分循環(huán)驅(qū)動(dòng)者的微生物具有的生態(tài)功能性也降低^［8］。在有限的耕地資源及單一種植模式影響下，如何在烤煙連作種植情況下，打破傳統(tǒng)連作障礙成為烤煙種植的重要問題之一。生物有機(jī)肥作為一種兼顧微生物肥料及有機(jī)效應(yīng)的肥料，在調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分及改善微生物群落結(jié)構(gòu)方面具有一定作用^［9］。筆者在淄博煙區(qū)烤煙連作種植的基礎(chǔ)上，連續(xù)3年施用生物有機(jī)肥，旨在探究連續(xù)施用生物有機(jī)肥對(duì)連作植煙土壤養(yǎng)分及微生物群落多樣性的影響，為解決煙區(qū)因連作種植導(dǎo)致土壤連作障礙提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)點(diǎn)位于山東省淄博市沂源縣南魯山鎮(zhèn)流水村（118.198 652°E，36.284 265°N）。該地區(qū)地處暖溫帶，屬半濕潤、半干旱大陸性氣候，年平均氣溫在13 ℃左右，年降雨量650 mm，，無霜期為200 d左右。土壤類型為棕壤。

1.2 試驗(yàn)材料

以2021年連作5年的煙田植煙根際土壤為材料，生物有機(jī)肥由ETS（天津）生物科技發(fā)展公司生產(chǎn)，N+P2O5+K2O≥8%；有機(jī)質(zhì)≥20%；有效活菌數(shù)≥0.2 億/g。主栽品種為云煙97。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2021—2023年在煙田開展生物有機(jī)肥施用定位試驗(yàn)，試驗(yàn)區(qū)面積為667 m2，生物有機(jī)肥在每年3月土地翻耕前，將1 500 kg/hm2的生物有機(jī)肥均勻撒施土壤表面，然后翻耕耙均。分別于2021、2022及2023年11月采集土壤樣品，分別標(biāo)記為C、B、A處理，生物有機(jī)肥測序（rbt1）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品采集及處理。

采用5點(diǎn)取樣法，并將5個(gè)點(diǎn)的樣品混合，放于無菌袋中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。過2 mm篩后，一部分土樣自然風(fēng)干檢測土壤理化指標(biāo)，另一部分土樣放置于-80 ℃的冰箱中檢測土壤微生物群落多樣性。

1.4.2 土壤理化性質(zhì)檢測。

土壤pH、堿解氮、有效磷、有機(jī)質(zhì)及速效鉀參照常規(guī)土壤農(nóng)化分析進(jìn)行測定。

1.4.3 土壤微生物多樣性檢測。

采集的土壤樣品由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，基于IIIumina Hi Seq測序平臺(tái)進(jìn)行微生物細(xì)菌及真菌高通量測序。

（1）根際土壤DNA提取與PCR擴(kuò)增。

采用Magpure Soil DNA LQ Kit（Magen，廣東）進(jìn)行土壤微生物DNA提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）檢測DNA的濃度及完整性。細(xì)菌通用引物16S V3～V4區(qū)引物（前端引物：343F-5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′；后端引物：798R-5′-AGGGTATCTAATCCT-3′），真菌多樣性鑒定采用通用引物ITS ITS1區(qū)引物（前端引物：ITS1F-5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；后端引物：ITS2-5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。

（2）Illumina Miseq測序數(shù)據(jù)處理及比對(duì)。

原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式。使用 Trimmomatic^［10］軟件對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜。去雜參數(shù)：檢測并截去模糊堿基N；并采用滑窗法檢查平均堿基質(zhì)量，當(dāng)質(zhì)量低于20時(shí)，截取前面高質(zhì)序列。去雜后的雙端序列利用 FLASH^［11］軟件進(jìn)行。拼接參數(shù)：最小的overlap為10 bp，最大的Overlap為200 bp，最大錯(cuò)配率為20%。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)行精準(zhǔn)去雜，去除含有模糊堿基（ambiguous）、單堿基高重復(fù)區(qū)（homologous）的序列以及長度過短的序列。精準(zhǔn)去雜參數(shù)：去掉含有N堿基的序列，保留堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)Q20達(dá)到至少 75% 的序列。同時(shí)，利用UCHIME檢測并去除序列中的嵌合體序列。測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后，采用Vsearch^［12］ 軟件，根據(jù)序列的相似性，將序列歸為多個(gè)OTU。參數(shù)為序列相似度大于或等于97% 被歸為一個(gè)OTU單元。使用QIIME^［13］ 軟件包挑選出各個(gè)OTU的代表序列，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋。16S使用Silva（version132）數(shù)據(jù)庫比對(duì)，物種比對(duì)注釋使用 RDP classifier^［14］ 軟件，保留置信區(qū)間大于0.7的注釋結(jié)果。ITS使用Unite數(shù)據(jù)庫比對(duì)。物種比對(duì)注釋使用BLAST^［15］軟件。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 23.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)法對(duì)土壤微生物相對(duì)豐度進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，其他均應(yīng)用最小顯著差數(shù)（LSDlt;0.05）法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

生物有機(jī)肥連續(xù)施用對(duì)烤煙根際土壤理化指標(biāo)的影響見表1。由表1可知，土壤pH及有機(jī)質(zhì)含量隨著生物有機(jī)肥施用年限的增加呈上升趨勢；土壤速效磷、速效鉀含量不同施肥年限間差異不顯著；堿解氮含量隨著生物有機(jī)肥施肥年限的增加而呈下降趨勢。可見，連續(xù)施用生物有機(jī)肥能夠減緩植煙土壤連作土壤酸化狀況，提高連作植煙土壤pH，減少土壤堿解氮含量，而土壤速效磷及速效鉀含量差異不顯著。

2.2 微生物多樣性檢測

2.2.1 OTUs分析。

對(duì)不同處理植煙土壤的tags數(shù)目及OTUs數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表2。由表2可知，細(xì)菌群落OTUs數(shù)目的大小為rbt1lt;Clt;Blt;A，真菌OTUs數(shù)目大小為Clt;rbt1lt;Blt;A。說明生物有機(jī)肥中的細(xì)菌OTUs數(shù)目小于施肥后的連作植煙土壤，而連續(xù)施用2年以上的連作植煙土壤真菌OTUs數(shù)目大于生物有機(jī)肥。與此同時(shí)，連作種植下隨著生物有機(jī)肥施用年限的增加，植煙土壤中的細(xì)菌及真菌OTUs數(shù)目呈增加的趨勢。

生物有機(jī)肥（rbt1）與連作試驗(yàn)土壤（A、B、C）細(xì)菌群落共有243個(gè)OTUs，A特有318個(gè)OTUs，B特有143個(gè)OTUs，C特有211個(gè)OTUs，rbt1特有122個(gè)OTUs。分別占各自O(shè)TUs總數(shù)的14.18%、7.14%、10.69%、23.33%。生物有機(jī)肥（rbt1）與連作試驗(yàn)土壤（A、B、C）真菌群落共有192個(gè)OTUs，A特有157個(gè)OTUs，B特有86個(gè)OTUs，C特有62個(gè)OTUs，rbt1特有110個(gè)OTUs。分別占各自O(shè)TUs總數(shù)的21.63%、13.29%、12.76%、22.18%（圖1）。

2.2.2 物種多樣性分析。

由表3可知，不同處理樣本的覆蓋率均在99%以上，可以比較準(zhǔn)確地反映不同處理樣本的真實(shí)情況，施用生物有機(jī)肥后的植煙土壤（A、B、C）細(xì)菌及真菌的Chao1指數(shù)、香濃指數(shù)及物種數(shù)目均大于生物有機(jī)肥（rbt1），且呈現(xiàn)Agt;Bgt;C，說明連作種植下隨著生物有機(jī)肥施用年限的增加，植煙土壤微生物多樣性增加。

2.2.3 物種群落結(jié)構(gòu)分析。

在門水平上，各個(gè)處理土壤樣本細(xì)菌群落主要分為25個(gè)門56綱129目137種230科399屬。對(duì)各個(gè)處理相對(duì)豐度前15的菌門進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）及放線細(xì)菌（Actinobacteria）占總菌門數(shù)量的85%以上。植煙土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）的相對(duì)豐度呈Agt;Bgt;Cgt;rbt1，而酸桿菌門（Acidobacteria）的相對(duì)豐度呈rbt1gt;Cgt;Bgt;A。說明連作植煙土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）隨著生物有機(jī)肥施用年限的增加而增加，而擬桿菌門（Bacteroidetes）相對(duì)豐度減少。

真菌群落主要分為9個(gè)門30個(gè)綱124個(gè)科202個(gè)屬。真菌群落以子囊菌門（Ascomycota）及擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為主，其中C處理子囊菌門豐富度最高，B處理擔(dān)子菌門（Basidiomycota）豐富度最高（圖2）。

3 討論

研究表明^［16-18］，產(chǎn)生連作障礙的原因較多，其中土壤堿解氮含量增加，有機(jī)質(zhì)、有效磷及速效鉀含量降低以及土壤微生物結(jié)構(gòu)失調(diào)是產(chǎn)生連作障礙的重要原因。因此，研究植煙土壤養(yǎng)分變化及微生物多樣性具有重要意義。連作極易導(dǎo)致土壤酸化，土壤速效養(yǎng)分增加，土壤養(yǎng)分流失比較嚴(yán)重^［19-21］。而該研究發(fā)現(xiàn)，在連作情況下，隨著生物有機(jī)肥施用年限的增加，土壤pH呈上升趨勢，有機(jī)質(zhì)增加，堿解氮降低，其他速效養(yǎng)分基本保持不變或略有上升。為了追求高產(chǎn)，長期連作導(dǎo)致植煙土壤氮素含量積累，過多的氮素含量會(huì)降低烤根系脫氫酶活性，影響烤煙生長發(fā)育，對(duì)烤煙品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。

生物有機(jī)肥中富含大量的有機(jī)質(zhì)，有機(jī)質(zhì)具有一定的保肥能力，有機(jī)質(zhì)中所含有的腐殖質(zhì)具有一定吸附陰、陽離子的作用^［22］，因此對(duì)于有效磷、速效鉀等速效養(yǎng)分具有一定的穩(wěn)定作用。進(jìn)一步說明植煙土壤在常年連作的情況下，生物有機(jī)肥能夠提高植煙土壤pH，增加有機(jī)質(zhì)含量，穩(wěn)定植煙土壤速效養(yǎng)分，減少養(yǎng)分流失。而且隨著生物有機(jī)肥施用年限的增加，效果更加明顯。

多樣性作為評(píng)價(jià)微生物群落的重要指標(biāo)，多樣性指數(shù)越高則表明土壤微生物種類越豐富，植煙土壤越穩(wěn)定^［23］。長期連作導(dǎo)致植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)被破壞，微生物多樣性降低，土壤的穩(wěn)定性被打破^{［2，24］}。該研究中，在烤煙連作情況下，施用生物有機(jī)肥能夠提高連作植煙土壤中的細(xì)菌及真菌OTUs數(shù)目，植煙土壤微生物多樣性指數(shù)（Chao1指數(shù)、香濃指數(shù)、物種數(shù)目）也提高，且隨著生物有機(jī)肥施用年限的增加而增加。傳統(tǒng)烤煙種植多以有機(jī)肥配施化肥，而該研究以生物有機(jī)肥替代傳統(tǒng)的有機(jī)肥方式，生物有機(jī)肥不僅含有有機(jī)肥的功能，而且本身含有有益菌，隨著生物有機(jī)肥施用年限的不斷增加，植煙土壤中的外源有益菌也不斷增加，對(duì)于因連作導(dǎo)致微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)的破壞具有一定的修復(fù)作用。因此，3年生物有機(jī)肥施用對(duì)于連作植煙土壤微生物多樣性提高具有一定的作用。

4 結(jié)論

連續(xù)3年生物有機(jī)肥施用能夠提高連作植煙土壤pH，減少酸化，促進(jìn)土壤速效養(yǎng)分的釋放，提高土壤微生物多樣性，為煙區(qū)因耕地資源有限及烤煙單一種植模式而進(jìn)行連作種植方式導(dǎo)致連作障礙提供了新的解決方法。

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