摘要 為給糯玉米分子育種工作提供數(shù)據(jù)支撐，對(duì)玉米ZmWaxy蛋白序列利用現(xiàn)代生物信息學(xué)軟件進(jìn)行信號(hào)肽、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)、進(jìn)化樹(shù)及理化特性等分析。結(jié)果表明：玉米ZmWaxy基因有3 676 bp開(kāi)放讀碼框，并編碼1個(gè)穩(wěn)定的由609個(gè)氨基酸構(gòu)成的弱酸性親水蛋白，其分子量大小為66.61 kD。玉米ZmWAXY蛋白預(yù)測(cè)有49個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，12個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)。有典型的GT5-Glycogen-synthase-DULL-like蛋白保守結(jié)構(gòu)域，但不含有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域。其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，伴有大量α-螺旋和少量β轉(zhuǎn)角。進(jìn)化關(guān)系中，玉米與高粱最近，次之為水稻和谷子，與小麥進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞 糯玉米；ZmWaxy蛋白；生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào) S-058" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A" 文章編號(hào) 0517-6611（2025）03-0096-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.019

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Bioinformatics Analysis of ZmWaxy of Zea mays L.

XING Lei， CHEN Yong xin， FAN Rui et al

（Maize Research Institute of Shanxi Agricultural University， Xinzhou， Shanxi 034000）

Abstract To provide certain data support for molecular breeding of glutinous corn， this study analyzed the signal peptide， conserved domain， transmembrane domain， protein advanced structure， evolutionary tree， and physicochemical properties of corn ZmWaxy protein sequence using modern bioinformatics software. The results showed that the maize ZmWaxy gene has an open reading frame of 3 676 bp and encodes a stable weakly acidic hydrophilic protein composed of 609 amino acids， with a molecular weight of 66.61 kD. The corn ZmWAXY protein is predicted to have 49 phosphorylation modification sites and 12 glycosylation modification sites， carrying out rich protein post translational modification activities. It had a typical conserved domain of GT5 Glycogen synthase DULL like protein， but did not contain signal peptide structures and transmembrane domains. Its secondary and tertiary structures were mainly characterized by irregular curls， accompanied by a large number of α Spiral and small amount β Corner. In evolutionary relationships， corn was closest to sorghum， followed by rice and millet， and had the farthest evolutionary relationship with wheat.

Key words Waxy corn;ZmWaxy protein;Bioinformatics

基金項(xiàng)目 山西省科技重大專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃揭榜掛帥項(xiàng)目“甜糯玉米種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育”（202201140601025-1-06）；山西省玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（2023CYJSTX01-08）；忻州市科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)專(zhuān)項(xiàng)“優(yōu)質(zhì)白色甜加糯玉米新品種晉甜糯2號(hào)示范推廣”（20230403）；忻州市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“甜糯玉米抗逆優(yōu)異種質(zhì)材料創(chuàng)制與挖掘利用”（20230203）。

作者簡(jiǎn)介 邢磊（1994—），女，山西忻州人，實(shí)習(xí)研究員，碩士，從事甜糯玉米種質(zhì)材料創(chuàng)新與品種選育研究。*通信作者，二級(jí)研究員，從事甜糯玉米種質(zhì)材料創(chuàng)新與品種選育研究。

收稿日期 2023-12-28；修回日期 2024-05-07

玉米是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾募Z食作物之一^［1-2］。近年來(lái)，由于產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)升級(jí)，鮮食玉米兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的特點(diǎn)，使其成為特色高效農(nóng)業(yè)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的新亮點(diǎn)，備受社會(huì)和農(nóng)業(yè)學(xué)家的關(guān)注^［3-4］，因此玉米育種工作作為影響玉米品質(zhì)和產(chǎn)量的重要因素，也受到了極高的重視。支鏈淀粉含量高達(dá)98%以上的糯玉米，富含多種維生素、氨基酸，口感軟糯，清香滿(mǎn)口，適口性極好，是人們餐桌上必不可少的美味^［5］，其黏滯性強(qiáng)，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，也是造紙、飼料的優(yōu)質(zhì)原料^［6］。

Waxy基因又叫蠟質(zhì)基因，編碼顆粒凝結(jié)型淀粉合成酶（GBSSI）。GBSSI是植物儲(chǔ)藏器官中顆粒結(jié)合蛋白的主要部分，存在于胚乳中，控制胚乳直鏈淀粉的合成^［7-11］。普通玉米由于GBSSI活性較高，成熟胚乳積累超23%的直鏈淀粉表現(xiàn)為非糯性^［12-13］。糯玉米由于其Waxy基因的缺失、突變或GBSSI酶活的降低而導(dǎo)致直鏈淀粉合成受阻，胚乳中只積累支鏈淀粉，表現(xiàn)為糯性^［14-16］。筆者對(duì)玉米ZmWaxy蛋白的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域以及蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)、進(jìn)化樹(shù)、理化特性等進(jìn)行分析，旨在為糯玉米分子育種工作提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 序列

玉米（Zea mays L.）ZmWaxy［GeneID=541854］、谷子（Setaria italica）SiWaxy［GeneID=101761090］、小麥（Triticum aestivum）TaWaxy［GeneID=543395］、水稻（Oryza sativa）OsWaxy［GeneID=4340018］、高粱（Sorghum bicolor）SbWaxy［GeneID=8068390］基因序列與蛋白均來(lái)源于檢索工具NCBI。

1.2 生物信息學(xué)軟件

1.2.1 基因閱讀框分析。

利用檢索工具NCBI獲得玉米及其他植物的Waxy基因及蛋白序列，通過(guò)NCBI的“ORF finder”在線(xiàn)平臺(tái)（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析玉米Waxy基因序列的開(kāi)放讀碼框。

1.2.2 性質(zhì)及功能分析。

通過(guò)Protscale、ProtParam在線(xiàn)平臺(tái)分析玉米ZmWaxy蛋白的親疏水性和理化性質(zhì)，通過(guò)NetOGlyc4.0和Netphos3.1分析玉米ZmWaxy蛋白的糖基化及磷酸化位點(diǎn)；使用TMHMM、SingalP 4.1 Server和ScanProsite軟件分析預(yù)測(cè)玉米ZmWaxy蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽及保守結(jié)構(gòu)域；采用Psort Prediction和Cell-PLoc 2.0在線(xiàn)平臺(tái)對(duì)玉米ZmWaxy蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；使用COILS、SOPMA、PSIPRED 4.0和Phyre2、PyMol在線(xiàn)平臺(tái)預(yù)測(cè)玉米ZmWaxy蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。該研究涉及的在線(xiàn)平臺(tái)及軟件見(jiàn)表1。

1.2.3 多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

通過(guò)DNAMAN 6.0將玉米與其他植物的Waxy蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，分析其序列的同源性。通過(guò)MEGA 7.0構(gòu)建玉米與其他植物的ZmWaxy蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，對(duì)其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmWaxy蛋白理化性質(zhì)及親疏水性預(yù)測(cè)

玉米ZmWaxy蛋白由碳、氫、氧、氮和硫5種元素組成，利用ORF finder和ProtParam在線(xiàn)分析工具分析其理化性質(zhì)，其開(kāi)放閱讀框在3 676 bp，原子總數(shù)為9 331，蛋白分子量為66.61 kD。預(yù)測(cè)中ZmWaxy蛋白的理論等電點(diǎn)為6.59，呈酸性。結(jié)合Protscale在線(xiàn)分析工具分析其親疏水性（圖1），ZmWaxy蛋白比較穩(wěn)定（不穩(wěn)定系數(shù)31.54），親水性較低（-0.144 7），脂溶指數(shù)83.78。

2.2 玉米ZmWaxy信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

采用SignalP 4.1在線(xiàn)平臺(tái)對(duì)玉米ZmWaxy蛋白的信號(hào)肽序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其不存在信號(hào)肽和剪切位點(diǎn)，由此推測(cè)，玉米ZmWaxy蛋白為非分泌型蛋白，直接在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中起作用，并不參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)任務(wù)。使用在線(xiàn)平臺(tái)TMHMM 2.0預(yù)測(cè)玉米ZmWaxy蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖2所示，玉米ZmWaxy蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，也并未發(fā)現(xiàn)膜內(nèi)的氨基酸序列，位于膜外，屬于非膜蛋白。

通過(guò)在線(xiàn)平臺(tái)NCBI中的CD Search和InterPro中的EBI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ZmWaxy蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，ZmWaxy具有明顯GT5-Glycogen-synthase-DULL-like蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GTB類(lèi)型。

2.3 玉米ZmWaxy亞細(xì)胞定位及磷酸化、糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)在線(xiàn)平臺(tái)Cell-PLoc 2.0及Psort Prediction，對(duì)ZmWaxy蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)ZmWaxy蛋白主要定位于葉綠體中。

使用NetPhos3.1在線(xiàn)工具分析，發(fā)現(xiàn)ZmWaxy蛋白存在眾多磷酸化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示，在系統(tǒng)設(shè)定的閾值之上，ZmWaxy含有Thr（蘇氨酸）位點(diǎn)16個(gè)、Ser（絲氨酸）位點(diǎn)20個(gè)，以及Tyr（酪氨酸）位點(diǎn)13個(gè)。同時(shí)使用NetOGlyc 4.0在線(xiàn)平臺(tái)預(yù)測(cè)得到12個(gè)ZmWaxy蛋白的糖基化位點(diǎn)，這暗示ZmWaxy蛋白在生物體中參與了復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程。

2.4 玉米ZmWaxy二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)Expasy平臺(tái)的Coils工具分析ZmWaxy蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其有明顯的卷曲螺旋。使用PSIPRED和SOPMA平臺(tái)分析ZmWaxy蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5，表明ZmWaxy蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲（41.54%）的氨基酸殘基為主，伴有大量α-螺旋（36.29%）和少量β轉(zhuǎn)角（7.06%）。

通過(guò)同源建模軟件Phyre2對(duì)ZmWaxy蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模型模擬，得到模板c3vufA.1（與ZmWaxy蛋白相似度最高），根據(jù)該模板對(duì)ZmWaxy蛋白進(jìn)行同源建模，得到覆蓋度為88.80%的模型。利用PyMOL對(duì)ZmWaxy蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維建模模擬，并展示其同源建模結(jié)果，同時(shí)以二級(jí)結(jié)構(gòu)標(biāo)記顏色（圖6）。

2.5 玉米ZmWaxy與其他植物蛋白的多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

以ZmWaxy的蛋白序列為探針，搜尋并下載NCBI中與ZmWaxy蛋白相似性較高的序列，通過(guò)軟件 DNAMAN 對(duì)得到的玉米、小麥、高粱、谷子和水稻的Waxy蛋白序列進(jìn)行比對(duì)（圖7），發(fā)現(xiàn)5種植物的Waxy蛋白序列比對(duì)的一致性為80.23%，氨基酸相似度較高，保守性高。這表明不同植物的Waxy蛋白序列相對(duì)保守。玉米、高粱、水稻和谷子都有其特有的GT5糖原合成酶保守結(jié)構(gòu)域，而小麥有糖基轉(zhuǎn)移酶GTB型超家族保守結(jié)構(gòu)域。通過(guò)軟件MEGA7.0（NJ法）構(gòu)建5種植物Waxy蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖8），發(fā)現(xiàn)在進(jìn)化關(guān)系中，玉米ZmWaxy蛋白與高粱親緣最近，再次為水稻和谷子，而與小麥進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

該研究通過(guò)現(xiàn)代生物信息學(xué)工具對(duì)玉米ZmWaxy基因及蛋白序列進(jìn)行信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域、理化特性以及蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)、進(jìn)化樹(shù)等特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該基因存在3 676 bp的開(kāi)放讀碼框，編碼由609個(gè)氨基酸構(gòu)成穩(wěn)定弱酸性親水蛋白，其分子量大小為66.61 kD。不含有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域，但擁有典型的GT5-Glycogen-synthase-DULL-like蛋白保守結(jié)構(gòu)域，其定位于葉綠體中，非膜蛋白，有可能在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中起作用。其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，伴有大量α-螺旋和少量β轉(zhuǎn)角。進(jìn)化關(guān)系中，玉米與高粱最近，次之為水稻和谷子，與小麥進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

磷酸化、泛素化、乙?；⒓谆?、糖基化等是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要形式^［17-18］。玉米ZmWAXY蛋白具有12個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)和49個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)。眾多的磷酸化修飾位點(diǎn)中包括unsp、cdc2、PKA、PKC、CK1、CK2等多個(gè)磷酸激酶作用位點(diǎn)。蛋白質(zhì)磷酸化參與植物幾乎所有的生命過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性以及蛋白質(zhì)之間的相互作用，在信號(hào)傳遞與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用^［19-20］。而蛋白質(zhì)糖基化為蛋白質(zhì)打上不同標(biāo)記，改變多肽的構(gòu)象并增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性^［21-22］，在生物體內(nèi)有著重要的生理意義，在細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號(hào)傳輸?shù)确矫嫫鹬匾饔谩Ｒ虼?，?duì)ZmWaxy蛋白翻譯后修飾的進(jìn)一步研究迫在眉睫，為甜糯玉米優(yōu)良糯性品質(zhì)的分子機(jī)制的進(jìn)一步揭示奠定基礎(chǔ)。

玉米ZmWaxy擁有典型的GT5-Glycogen-synthase-DULL-like蛋白保守結(jié)構(gòu)域。GT5淀粉合成酶在葡糖基轉(zhuǎn)移酶11的催化下介導(dǎo)葡糖基轉(zhuǎn)移。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)，GT5屬于GTB超家族（http：∥www.cazy.org/），并且可以結(jié)合葡糖基供體（ADP-Glc）的保守氨基酸殘基，通常合并到淀粉合成酶的堿性催化區(qū)起作用^［20］。

王慧等^［22］利用Eco-TILLING分析糯玉米種質(zhì)材料的Waxy基因序列變異情況，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源糯玉米種質(zhì)糯質(zhì)表現(xiàn)型在DNA序列上表現(xiàn)為 SNP、InDel 等不同類(lèi)型的突變。丁敏等^［23］通過(guò)Waxy基因的1個(gè) InDel 位點(diǎn)和移碼突變以及單堿基突變位點(diǎn)進(jìn)行Waxy基因功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)，利用開(kāi)發(fā)的標(biāo)記對(duì)山西省糜子資源進(jìn)行基因分型，為糜子糯性品質(zhì)育種提供了分子檢測(cè)工具。這對(duì)利用Waxy基因功能對(duì)糯玉米進(jìn)行標(biāo)記提供了新思路，為糯玉米分子育種提供了標(biāo)記工具。

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