摘要 為進一步了解雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）在安徽雞群中的感染情況和流行菌株的遺傳進化特征，對10個不同類型雞群進行血清學和抗原核酸檢測，分離并鑒定菌株，并進行遺傳進化分析。結果表明，安徽雞群中MS的平均抗體陽性率為71.02%，平均核酸陽性率為72.19%，血清學檢測結果和核酸檢測結果之間存在顯著相關（Plt;0.05）；通過不同類型雞群的比較發(fā)現(xiàn)，青年雞群MS的感染率最低，其次為種雞群。經過分離、培養(yǎng)、純化和鑒定，從發(fā)病雞群中分離到2株MS分離株，命名為AHH-01和AHH-02，分離株具有典型的MS菌株特征；基因分型結果顯示，2株分離株均為K基因型，在遺傳進化關系上與四川分離株SMU-SCYA-LF1/2019的親緣關系最近，與國內其他地區(qū)的分離株存在一定的遺傳距離。該研究為深入分析安徽地區(qū)雞群MS的感染情況和流行菌株提供了研究基礎。

關鍵詞 雞滑液囊支原體；血清學；核酸；分離鑒定；進化分析

中圖分類號 S858.31" 文獻標識碼 A" 文章編號 0517-6611（2025）03-0082-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.016

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Epidemiological Survey and Pathogen Isolation，Identification of Mycoplasma synoviae in Chicken Flocks in Anhui

HOU Hong yan^1，2， SHEN Xue huai^1，2，3，ZHAO Rui hong^1，2 et al

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Anhui Academy of Agricultural Sciences/Anhui Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety， Hefei， Anhui 230031; 2.Research and Development Center of Livestock and Poultry Disease Prevention and Control Technology， Institute of Advanced Research，Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031; 3.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095）

Abstract In order to further understand the infection status and genetic evolutionary characteristics of Mycoplasma synoviae （MS） in chicken flocks in Anhui， serological and antigenic nucleic acid tests were performed on 10 different types of chicken flocks. The strains were isolated and identified， the genetic evolutionary analysis was made. The results showed that the average antibody positive rate of MS in chicken flocks of Anhui was 71.02% and the average nucleic acid positive rate was 72.19%， with a significant correlation between the serological results and nucleic acid detection results （Plt;0.05）. Through the comparison among different types of flocks， it was revealed that the infection rate of MS was the lowest in young flocks， followed by breeder flocks. Through the isolation， culture， purification and identification， two MS isolates were isolated from the diseased chicken， named AHH 01 and AHH 02. The isolated strains had the typical characteristics of MS strains. The genotyping results showed that the two isolates were all K genotype， which had the closest genetic relationship with the isolate SMU SCYA LF1/2019 from Sichuan， and a certain genetic distance from the isolates in other regions of China. This study provided the basis for in depth analysis of MS infection and prevalent strains in chicken flocks in Anhui.

Key words Mycoplasma synoviae；Serology;Nucleic acid; Isolation and identification；Evolutionary analysis

基金項目 安徽省重點研究與開發(fā)計劃項目（202204c06020039）；國家蛋雞產業(yè)技術體系項目（CARS-40）；安徽省農業(yè)科學院平臺項目（2024YL016）；安徽省家禽產業(yè)技術體系項目（AHCYJSTX-06）。

作者簡介 侯宏艷（1975—），女，河南?？h人，助理研究員，碩士，從事畜禽病原學研究。

*通信作者：沈學懷，副研究員，博士，從事畜禽傳染病研究；潘孝成，副研究員，博士，從事畜禽傳染病研究。

收稿日期 2024-06-03；修回日期 2024-07-24

雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）感染不同日齡階段的雞從而引發(fā)雞滑液囊支原體?。∕ycoplasma synoviae disease）。該病主要造成病雞關節(jié)腫大、滑膜囊及肌腱炎癥、呼吸道癥狀以及雞蛋頂端異常，嚴重威脅雞群健康和經濟效益^［1］。該病在世界范圍內流行，多個國家的流行病學監(jiān)測表明MS在商品代雞群中有很高的流行率^［2-3］。我國最早關于MS感染的報道是一些地區(qū)肉雞群出現(xiàn)“腿癱病”，隨后在蛋雞和種雞中也出現(xiàn)類似疾病，最終被確認是由MS感染引起的。自2010年以來，以滑膜炎為主要特征的雞群MS感染在我國廣泛流行^［4］。Sun等^［5］對16個省份采集的雞血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)抗體陽性率達63.2%。2012—2014年江蘇部分地區(qū)雞腿癱病病例病原檢測結果表明MS感染占48.75%，是引起雞“腿癱病”的主要病因^［6］。

近年來，隨著MS在雞群中的廣泛流行，不同品種的感染雞群除了出現(xiàn)典型的臨床癥狀外，還能造成雞群產蛋率下降，并伴有蛋殼頂端異常等非典型病理變化^［7］。當前，國內有不少學者利用ELISA血清試驗和病原PCR檢測進行MS流行病學調查。沈學懷等^［8］對安徽部分雞場的MS感染調查顯示，雞場MS陽性率為90.48%，平均血清陽性率為77.01%。國內有學者從雞群中分離和鑒定出多株MS毒株^［9-10］，表明MS在國內雞群中廣泛流行。MS雖然只有一個血清型但有多個基因型，可變脂蛋白血凝素A基因（vlhA）被廣泛應用于MS的基因型鑒定^［11］。筆者對安徽部分雞群進行MS感染的血清學和病原核酸檢測，從具有明顯臨床癥狀的雞群中分離培養(yǎng)出2株MS流行株，并對其基因型和進化背景進行分析，以期為雞群MS感染的防控和凈化提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

MS抗體ELISA檢測試劑盒、MS DNA熒光PCR檢測試劑盒均購自IDEXX公司；不含結晶紫的PPLO肉湯培養(yǎng)基和PPLO瓊脂培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術有限公司；核酸提取試劑盒為西安天隆科技有限公司產品；2×PCR PreMix、瓊脂糖等均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 MS陽性血清的制備

使用雞滑液囊支原體標準菌株CVCC2960免疫4周齡SPF雞14 d后重復免疫1次，二免后21 d心臟采血，離心，制備血清。

1.3 樣品采集與來源雞場

對安徽3個種雞群、2個青年雞群和5個蛋雞群采取隨機抽樣的方式采樣，使用一次性真空采血管翅下靜脈采集2 mL血液，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心10 min后收集血清，置于-20" ℃下保存。采用無菌棉簽采集雞腭裂拭子，并將拭子樣品置于含1.0 mL生理鹽水的EP管中，-20 ℃冰箱保存。對種雞群2和蛋雞群1中出現(xiàn)胸骨囊腫和關節(jié)腫脹的病雞，采集其關節(jié)腔內容物，用于MS的分離與培養(yǎng)。種雞群2為245日齡，出現(xiàn)零星死亡，高峰產蛋率在90%左右；蛋雞群1為300日齡，個別雞只跗關節(jié)腫大，高峰產蛋率約80%。

1.4 試驗方法

1.4.1 MS血清抗體檢測。所有雞場血清樣品MS抗體檢測步驟和結果判定均按照檢測試劑盒說明書操作。群體陽性率計算公式：群體陽性率=（陽性數(shù)/總樣品數(shù)）×100%。

1.4.2 MS核酸檢測。將裝有腭裂拭子的EP管在渦旋振蕩器上5 000 r/min劇烈振蕩1 min，使拭子上的樣品充分分散到生理鹽水中；取400 μL樣品加到核酸提取試劑盒的加樣孔中，采用自動核酸提取儀的提取程序獲得樣品DNA。MS熒光PCR反應體系（25 μL）如下：10 μL引物和探針預混液、10 μL擴增液、5 μL DNA樣品。熒光PCR反應程序如下：50 ℃ 15 min；95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s（收集熒光），共45個循環(huán)。另設置陰性對照和陽性對照。

1.4.3 菌株的分離與純化。病原分離的培養(yǎng)基為改良的Thiaucourt’s培養(yǎng)基。無菌采集病雞關節(jié)腔內容物，并加入少量液體培養(yǎng)基進行勻漿，組織懸液在液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng) 5～7 d后，連續(xù)10倍梯度稀釋至10^-3后繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d。每一代培養(yǎng)物都用0.45 μm濾器過濾后進行傳代培養(yǎng)。當培養(yǎng)基變黃時，將培養(yǎng)物轉接于固體平皿培養(yǎng)基中，置于 37 ℃下培養(yǎng)4～5 d。待培養(yǎng)基出現(xiàn)特征性菌落后，再轉接入液體培養(yǎng)基中，重復2～3次，獲得支原體純化培養(yǎng)物。

1.4.4 菌株的鑒定。

1.4.4.1 形態(tài)學觀察。將純化獲得的菌株接種到固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 d后，置于低倍顯微鏡下觀察典型菌落形態(tài)。將純化的液體培養(yǎng)物涂片后進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4.4.2 雞紅細胞吸附試驗。在培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)基表面加入5 mL 1%雞紅細胞懸液，室溫孵育20 min后吸去多余的紅細胞懸液，用PBS緩沖液洗滌培養(yǎng)板3次，使用低倍顯微鏡觀察SM菌落表面是否有紅細胞吸附。

1.4.4.3 血凝抑制試驗。將分離菌培養(yǎng)液離心濃縮，與MS陽性血清1∶1（V/V）混合后加到檢測板上，同時將未加入陽性血清的分離菌液作為陽性對照，室溫下作用30 min后，加入1%雞紅細胞懸液，輕微振蕩，室溫下作用30 min，將檢測板傾斜，觀察紅細胞凝集情況，判斷分離菌與MS陽性血清是否存在特異性反應。

1.4.5 PCR分型鑒定。擴增MS分型基因vlhA，參照文獻中vlhA基因序列^［12］，PCR引物由通用生物公司合成，上游引物vlhA-F為5′-TACTATTAGCAGCTAGTGC-3′，下游引物vlhA-R為5′-AGTAACCGATCCGCTTAAT-3′。PCR反應體系（25.0 μL）如下：2×PCR PreMix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板2.0 μL 、雙蒸水8.5 μL。PCR反應程序如下：94 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物使用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，預期擴增片段長度為400 bp。PCR產物測序后，使用Mega 7軟件對vlhA基因序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中的比對序列進行進化樹構建。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制；相關性分析使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件中的Pearson方法進行，使用GraphPad Prism 8軟件繪制相關性熱圖。

2 結果與分析

2.1 雞群MS血清抗體和核酸檢測結果

對安徽地區(qū)10個雞群MS的血清抗體和腭裂拭子核酸進行檢測，結果見表1。由表1可以看出，雞群中MS血清抗體陽性率最低為1.09%，最高為100%，平均值為71.02%；核酸陽性率最低為3.33%，最高為100%，平均值為72.19%。血清抗體和抗原核酸陽性率的相關性分析顯示，二者之間存在顯著相關（Plt;0.05）（圖1）。通過不同類型雞群的比較發(fā)現(xiàn)，青年雞群MS的血清抗體陽性率和核酸陽性率均最低（分別為7.14%和6.67%），其次是種雞群（抗體陽性率和核酸陽性率分別為90.62%和67.78%），蛋雞群的血清抗體陽性率和核酸陽性率均最高（分別為97.95%和97.65%）（圖2）。

2.2 MS菌株培養(yǎng)純化與形態(tài)觀察

病料樣品經處理后，接

種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d，培養(yǎng)基顏色變黃，經連續(xù)轉接培養(yǎng)純化后，獲得2株MS分離株，命名為AHH-01和AHH-02。分離菌株在固體培養(yǎng)基上呈大小不一、透明的針尖狀菌落，顯微鏡下可看到典型的“煎蛋”樣菌落（圖3A）；挑取菌落進行革蘭氏染色，顯示為革蘭氏陰性，菌落呈多形性（圖3B）。

2.3 紅細胞吸附試驗

對分離株菌落進行雞紅細胞吸附試驗，結果顯示在低倍顯微鏡下可見菌落表面存在雞紅細胞吸附，表明該研究分離的SM菌株具有紅細胞吸附能力。

2.4 血凝抑制試驗

將分離株培養(yǎng)液離心濃縮后進行平板凝集試驗。結果顯示，未中和的分離株AHH-01和AHH-02培養(yǎng)物能夠使雞紅細胞產生凝集，MS陽性血清中和后的分離株培養(yǎng)物無法使紅細胞產生凝集，說明該研究分離的2株MS菌可以凝集紅細胞，且能夠被MS陽性血清中和。

2.5 PCR鑒定

根據(jù)雞MS DNA熒光PCR檢測試劑盒，配制PCR反應體系，收集FAM和VIC熒光信號，參照試劑盒說明書進行結果判定，發(fā)現(xiàn)2株MS分離株檢測結果均呈陽性。

2.6 MS分離株基因型和遺傳進化分析

對MS菌株vlhA基因進行PCR擴增，得到400 bp大小的擴增產物，與預期大小相符（圖4）。將擴增產物測序后進行序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)其序列與GenBank上發(fā)布的MS序列同源性達100%。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取MS A、E和K基因型等15條vlhA參考基因，進行基因進化樹構建。如圖5所示，MS的vlhA基因在不同基因型間存在明顯聚類，從進化樹聚類可以看出該研究分離到的MS菌株基因型均為K亞型，并且在遺傳距離上與四川分離株SMU-SCYA-LF1/2019的親緣關系最近，與河南分離株17HN08、廣東分離株CHN-JX-JX02-2014、河北分離株2019/XJP株和安徽分離株2019-2株同屬于K基因型，但存在一定的遺傳距離。

3 討論

MS感染雞群通常呈慢性經過，病程較長，感染初期往往看不到明顯病變，侵入器官后可形成滑膜炎、腱鞘炎、氣囊炎、卵巢炎等，具有很高的感染發(fā)病率，嚴重影響雞群的健康和生產性能^［13］。該病的水平傳播和垂直傳播能力都很強，對國內雞群的危害持續(xù)加大^［14］。近年來，國內MS流行病學的研究越來越受到關注。孫佳琳等^［15］對寧夏地區(qū)部分城市雞滑液囊支原體病的血清學調查分析發(fā)現(xiàn)，2021年血清MS抗體平均陽性率為77.88%，較2020年顯著升高；雞群日齡越大，陽性率越高，且種雞場的陽性率高于蛋雞場和肉雞場。姜蘭蘭等^［16］報道北京市雞場MS 的平均陽性率和血清陽性率分別為86.60%和 75.60%。2016 年安徽地區(qū)調查結果顯示，雞群中MS的血清平均陽性率為 43.66%^［17］；2023年調查發(fā)現(xiàn)MS血清陽性率為77.01%^［8］。該研究對安徽地區(qū)3種雞群的血清抗體和腭裂拭子核酸調查發(fā)現(xiàn)，MS血清抗體的平均陽性率為71.02%，與2023年報道結果相近，明顯高于2016年調查結果。通過腭裂拭子核酸檢測，可以評估雞群MS的感染狀態(tài)和感染壓力。該研究發(fā)現(xiàn)雞群MS核酸陽性率為72.19%，并且核酸陽性率和血清抗體陽性率之間呈現(xiàn)顯著正相關。血清學檢測和核酸檢測結果都反映出安徽雞群中MS的整體感染率和感染壓力均較高。研究發(fā)現(xiàn)，雞群的日齡與血清陽性率密切相關^{［8，18-19］}。該研究結果基本符合這個規(guī)律，青年雞群的陽性率明顯低于種雞群和蛋雞群。

MS只有一個血清型，但可根據(jù)其vlhA基因序列的差異區(qū)分為不同的基因型。分離株基因型的不同雖然與其抗原性和致病性無關，但其在菌株流行病學監(jiān)測和進化溯源分析方面具有明顯的優(yōu)勢^［20］。謝迪等^［12］對國內分離的48株MS分離株進行基因型分析，發(fā)現(xiàn)絕大部分MS分離株屬于K基因型，還存在少部分的A基因型和E基因型。劉麒等^［21］采集10個地區(qū)的發(fā)病雞樣本，共分離到17株MS分離株；vlhA基因序列分型顯示，16株為K基因型，1株為L基因型。翟路峰等^［22］報道在河南、河北、山東、安徽、江蘇等地采集的疑似感染MS的病料樣品中共分離出29株分離株，其中28株為L基因型，1株為E基因型。該研究分離的SM分離株均屬于K基因型，與四川分離株SMU-SCYA-LF1/2019的親緣關系最近，與國內其他地區(qū)的分離株存在一定的遺傳距離。目前國內的研究報道表明，MS流行的優(yōu)勢基因型主要有K基因型和L基因型，并且存在A基因型和E基因型的部分流行，研究也揭示出國內MS流行菌株的遺傳背景和變異情況相對復雜。綜上所述，MS在國內雞群的流行形勢嚴峻復雜，加強雞群血清學和病原學監(jiān)測可為雞群MS的防控和凈化提供重要參考。

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